Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Podsumowanie

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Streszczenie

Grasica jest ważnym organem do rozwoju limfocytów T. Spośród komórek zrębu grasicy, komórki nabłonkowe grasicy (TEC) są szczególnie ważne na wielu etapach rozwoju limfocytów T: zaangażowaniu limfocytów T, selekcji pozytywnej i selekcji negatywnej. Jednak funkcja TEC w grasicy pozostaje nie w pełni poznana. W artykule przedstawiono metodę izolowania podzbiorów TEC ze świeżej grasicy myszy przy użyciu połączenia rozerwania mechanicznego i trawienia enzymatycznego. Metoda ta pozwala na efektywne uwalnianie komórek zrębowych grasicy i tymocytów z połączeń komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa oraz tworzenie zawiesiny jednokomórkowej. Korzystając z izolowanych komórek, wieloparametrowa cytometria przepływowa może być stosowana do identyfikacji i charakterystyki TEC i komórek dendrytycznych. Ponieważ TEC są rzadką populacją komórek w grasicy, opisujemy również skuteczny sposób wzbogacania i oczyszczania TEC poprzez zubożenie tymocytów, najliczniejszego typu komórek w grasicy. Po wzbogaceniu czas sortowania komórek może zostać skrócony, dzięki czemu utrata żywotności komórek może zostać zminimalizowana podczas oczyszczania TEC. Oczyszczone komórki nadają się do różnych dalszych analiz, takich jak Real Time-PCR, Western blot i profilowanie ekspresji genów. Protokół będzie promował badania nad funkcją TEC, a także rozwój rekonstytucji limfocytów T in vitro.

Wprowadzenie

Na wczesnym etapie rozwoju limfocytów T, multipotencjalni progenitorzy pochodzący z hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego są rekrutowani do kory grasicy, przechodzą zobowiązanie do linii T i stają się prekursorami limfocytów T¹. W korze mózgowej podwójnie ujemne (DN) tymocyty CD4 i CD8 prekursorowe limfocytów T rozszerzają się i różnicują w niedojrzałe podwójnie dodatnie (DP) tymocyty CD4 i CD8, tworząc dużą pulę komórek progenitorowych z wysoce zmiennymi receptorami limfocytów T¹. Tylko wybrany podzbiór komórek DP ograniczony przez MHC stanie się tymocytami CD4 lub CD8 pojedynczymi dodatnimi (SP), migruje do rdzenia grasicy i różnicuje się w funkcjonalnie kompetentne dojrzałe limfocyty T, co jest określane jako selekcja pozytywna^2-6. Natomiast klony autoreaktywnych tymocytów przechodzą selekcję negatywną i są usuwane przez apoptozę, przekształcane w regulatorowe limfocyty T w celu samotolerancji lub kierowane do limfocytów śródnabłonkowych do celów, które nie są jeszcze jasne^3,7-10.

W grasicy, komórki zrębu grasicy tworzą unikalne mikrośrodowisko dostarczające sygnałów dla tych różnych losów rozwoju limfocytów T^5,11,12. Komórki zrębu grasicy składają się z komórek nabłonka grasicy (TEC) - w tym TEC korowych (cTEC) i rdzeniastych TEC (mTEC), komórek dendrytycznych, makrofagów, fibroblastów, komórek śródbłonka, perycytów pochodzących z grzebienia nerwowego i innych komórek mezenchymalnych^13-15. Wśród nich TEC mają kluczowe znaczenie na różnych etapach rozwoju limfocytów T^1,2,16,17. Brak solidnego sposobu izolowania TEC utrudnia jednak pełne zrozumienie ich funkcji¹⁶. W szczególności cTEC, które tworzą trójwymiarową sieć otaczającą przodków w korze mózgowej, są niezbędne dla selekcji pozytywnej^13,18,19 z powodów, które nie są jeszcze jasne. Wcześniejsze badania dostarczyły wskazówek co do niejednorodności i roli TEC, opierając się głównie na narzędziach morfologicznych i histologicznych¹³. Ostatnio unikalne role podzbiorów TEC zostały omówione za pomocą podejść genetycznych w modelach mysich^12,20. Solidny i powtarzalny sposób izolowania TEC ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia bezstronnej charakterystyki podzbiorów TEC, ilościowej i jakościowej oceny funkcji TEC oraz wyjaśnienia mechanizmów, w jaki sposób cTEC wspierają selekcję pozytywną.

Ze względu na rzadkość występowania TEC w grasicy i ścisłe interakcje, które tworzą w nienaruszonym organie, izolacja TEC była wyzwaniem. Opisany tutaj protokół oparty jest na wcześniejszych odkryciach, obecnie dostępnych odczynnikach, technikach oraz wiedzy na temat struktury grasicy i składu zrębu. Prawie dwie dekady temu opisano kilka procedur dezagregacji tkanek grasicy^21-27, w których podczas trawienia stosowano różne enzymy, w tym trypsynę, kolagenazę i dyspazę. Gray i wsp. porównali te enzymy w ich poprzedniej fazie²⁸ i opisali ulepszoną metodę z wieloetapowym trawieniem koktajli enzymatycznych²⁹, która stała się szeroko stosowana^20,30. Jednak metoda ta wymaga długiego czasu przygotowania i złożonych etapów trawienia, a w rezultacie uzyskuje się zmienną końcową liczbę komórek i proporcje TEC nawet w tej samej kohorcie myszy^29,30. Kilka lat temu w dysocjacji tkanek grasicy zaczęto stosować enzym badawczy Liberazy, zawierający wysoko oczyszczoną kolagenazę i neutralną proteazę³⁰. W tym miejscu opisujemy protokół trawienia oparty na Liberazie, ze zoptymalizowanymi procedurami separacji mechanicznej, który daje dużą liczbę żywotnych TEC z tkanek grasicy myszy.

Aby wzbogacić zdysocjowane komórki zrębu, poprzednie badania wykorzystywały albo gradienty gęstości, albo separację magnetycznych kulek^21,29. Jednak obie metody powodują poważne straty niektórych populacji komórek zrębu grasicy, w szczególności populacji cTECs²⁹. Techniki cytotoksycznej eliminacji i płukania^31,32 są szeroko stosowane do zubożenia lub separacji limfocytów w polu immunologicznym^12,31. Po porównaniu tych technik ustaliliśmy obecny protokół panoramowania w celu wzbogacenia TEC. Łagodny stan podczas procedury wzbogacania prowadzi do mniejszej śmierci komórek oraz bezstronnego i zwiększonego odzyskiwania TEC.

Izolowana zawiesina komórek grasicy opisana w sekcji 3 może być bezpośrednio zastosowana do analizy cytometrycznej przepływowej w celu identyfikacji i charakterystyki podzbiorów TEC i komórek dendrytycznych. W sekcji 4 opisano prosty i użyteczny sposób identyfikacji podzbiorów TEC za pomocą wieloparametrowego cytometru przepływowego. W przypadku eksperymentów, które mają na celu uzyskanie oczyszczonych cTEC lub mTEC, procedury wzbogacania TEC i sortowania komórek można znaleźć w sekcjach 5 i 6.

Protokół

W tym badaniu wykorzystano dorosłe (6 - 8 tygodni) samice myszy C57Bl/6. Myszy zakupiono od National Cancer Institute i utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów. Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Minnesoty (IACUC) zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach.

1. Przygotowanie instrumentów i

1. Przygotować roztwór enzymatyczny (pożywka RPMI1640 z 0,05% [w/v] Liberazy TH i 100 U/ml DNazy I), bufor bogaty w albuminy (1X PBS [Ca²⁺/Mg²⁺-free] z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym [EDTA]), bufor FACS (1X PBS [Ca²⁺/Mg²⁺-free] zawierający 1% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 0,02% NaN₃), Bufor sortujący FACS (1X PBS [Ca²⁺/Mg²⁺-free] zawierający 2% FBS) oraz pożywka RP10 (pożywka RPMI-1640 dostarczana z 10% FBS).
2. Przygotuj 10 talerzy do panowania. Przygotować 40 ml roztworu powlekającego (0,01 mg/ml koziej anty-szczurzej IgG w 0,1 M buforze_NaHCO3) i dodać 4 ml roztworu powlekającego do każdej płytki o wymiarach 100 x 15 mm, zawirować i inkubować w temperaturze 4 °C O/N. Odlać roztwór przeciwciała i przepłukać płytkę za pomocą 5 ml 1x PBS 2 razy, Energicznie wirować między płukaniami. Przygotowane płytki przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Pobieranie tkanki grasicy

1. Poddaj mysz eutanazji w komorze CO₂. Połóż zwierzę na plecach na macie preparcyjnej, przypnij stopy do maty i zwilż futro, spryskując je 70% etanolem.
2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę, zaczynając od góry otworu cewki moczowej prosto do dolnej szczęki nożyczkami i przedłuż nacięcie w dół do kolan po obu stronach. Nacięcie wygląda jak odwrócone do góry nogami "Y". Odciągnij luźną skórę z powrotem po bokach i przypnij ją do maty preparcyjnej.
3. Nakłuj przeponę od mieczykowatej, przetnij żebra z każdej strony aż do obojczyka, a następnie podnieś żebra kleszczami i przypnij je do maty preparcyjnej. Grasica znajduje się tuż pod żebrami i wygląda jak dwa cienkie białe płaty pokrywające serce (ryc. 1). Odłącz tkankę łączną otaczającą grasicę, delikatnie pociągnij i usuń parę płatów grasicy za pomocą zakrzywionych ząbkowanych kleszczy. Umieść płatki grasicy w 6-dołkowej płytce zawierającej 5 ml RPMI-1640.

3. Przygotowanie komórek zrębu grasicy

1. Odciąć otaczający tłuszcz i tkankę łączną i przenieść płaty grasicy do nowego dołka na płytce 6-dołkowej zawierającej 5 ml świeżo przygotowanego roztworu enzymu. Wykonać małe nacięcia w płatach grasicy cienkimi nożyczkami i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
2. Delikatnie odpipetować trawiąc tkankę grasicy w górę i w dół 2-3 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml w celu dysocjacji tkanek. Zebrać frakcję sklarowanego osadu w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml zimnego buforu bogatego w albuminy w celu zneutralizowania enzymów. Probówkę z hydromasażem należy przechowywać na lodzie. Dodać 2,5 ml roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
3. Przeprowadzić delikatne mieszanie mechaniczne za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły 18 G w celu rozdrobnienia kruszyw. Umieścić supernatant w puli do probówki zbiorczej. Dodać 2,5 ml roztworu enzymatycznego do pozostałej tkanki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
4. Powtórzyć delikatne mieszanie mechaniczne za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły 25 G, a następnie inkubować płytkę przez dodatkowe 5 - 10 minut.
5. Po całkowitym roztwarzeniu umieścić supernatant w probówce zbiorczej. Odwirować probówkę zbiorczą o sile 400 x g, 4 °C przez 8 minut, aby zebrać komórki. Odessać ciecz i zawiesić granulowane komórki w 10 ml buforze bogatym w albuminy i przefiltrować próbkę przez oczka o średnicy 100 mm. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie wykonaj analizę cytometyczną przepływu (sekcja 4) lub wzbogacenie TEC (sekcja 5).

4. Identyfikacja TEC za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przygotować komórki do końcowego stężenia 4 x 10⁶ komórek na 100 μl w buforze FACS do barwienia na 96-dołkowej płytce testowej z okrągłym dnem i utrzymywać płytkę na lodzie. Dodać 20 μl roztworu blokowego Fc (przeciwciało anty-CD16/CD32 o stężeniu 10 μg/ml w buforze FACS) do komórek i inkubować komórki przez 10 minut na lodzie. Obracać płytkę w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 3 min. Wylej płyn ze studzienek, wrzucając talerz do zlewu ekranem do dołu.
2. Zawiesić granulowane komórki w koktajlu przeciwciał o stężeniu 100 μl (przeciwciała anty-CD45, -EpCAM, -MHC klasy II i -Ly51 oraz lektyna UEA-1 znakowana różnymi fluorochromami w zalecanych przez producenta lub przetestowanych optymalnych stężeniach każdego przeciwciała w buforze FACS) i inkubować komórki na lodzie przez 20 minut w ciemności. Aby to skompensować, zabarwić 1 x 10⁶ komórek każdym pojedynczym fluorochromem.
3. Dodać 100 μl buforu FACS do każdego dołka i obracać płytkę w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 3 min. Powtórzyć etap płukania jeden raz, a następnie ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze FACS. Przenieść komórki do okrągłej probówki FACS o wymiarach 12 x 15 mm wypełnionej buforem FACS o pojemności 300 μl. Pobieraj próbki za pomocą cytometru przepływowego i analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy FACS. Strategia bramkowania TEC jest pokazana na rysunku 2.

5. Wzbogacanie TEC przez panoramowanie

1. Odwirować komórki grasicy (przygotowane w sekcji 3) w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut. Odessać ciecz i zawiesić granulowane komórki w buforze sortującym FACS w stężeniu 2 x^10,8 komórek na ml w probówce stożkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml. Dodać przeciwciało anty-CD90.2 (klon 30-H12) (lub anty-CD45) o końcowym stężeniu 2,5 μg/ml zawiesiny komórkowej i delikatnie inkubować komórki na mieszalniku obrotowym w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć 5 - 10 razy większą objętością pożywki RP10 i odwirować probówkę o sile 400 x g, 4 °C przez 5 minut.
2. Odessać ciecz i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce RP10 o stężeniu 1 x 10,7 na ml. Dodać 5 ml zawiesiny komórek do każdej powlekanej płytki do płukania (przygotowanej w kroku 1.3), obracać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Energicznie obracać; przenieść supernatanty do stożkowej probówki. Przepłukać płytkę dwa razy za pomocą pożywki RP10 i umieścić supernatanty w probówce zbiorczej.
3. Odwirować probówkę zbiorczą o sile 400 x g, 4 °C przez 5 minut. Zassać ciecz i ponownie zawiesić granulowane komórki w 5 ml pożywki RP10. Dodać zawiesinę komórek do nowej płytki do wytaczania, obracać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać komórki, przepłukać płytkę i umieścić je w stożkowej probówce. Po wzbogaceniu TEC należy odwirować komórki w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut i zawiesić komórki w 5 ml buforze sortującym FACS.

6. Oczyszczanie TEC przez sortowanie komórek

1. Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru i przygotować zawiesinę komórek w stężeniu 4 x 10⁷ komórek w buforze sortującym FACS. Dodać przeciwciała opisane w sekcji 4.4 do roztworu komórkowego i delikatnie inkubować komórki na mieszalniku obrotowym w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po barwieniu przemyć i zawiesić komórki do stężenia 10 x 10⁶ komórek na ml buforu sortującego FACS.
2. Sortuj podzbiory TEC przez dyszę 100 μM za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Posortowane komórki są zbierane w 30% (v/v) FBS w RPMI-1640). Po zakończeniu sortowania komórek należy odwirować komórki w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut i przygotować do dalszej analizy.

Wyniki

Korzystając z tego protokołu, pobrano narząd grasicy od dorosłej myszy (sekcja 2) i przygotowano zawiesinę komórek grasicy, jak opisano w sekcji 3. Otrzymana zawiesina komórkowa składała się z tymocytów, komórek zrębu pochodzenia krwiotwórczego i komórek zrębu niehematopoetycznych. CD45 jest krwiotwórczym markerem pan-markerowym ulegającym ekspresji zarówno na tymocytach, jak i hematopoetycznych komórkach zrębowych, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne. W przeciwieństwie do tego, TEC nie są pochodzenia krwiotwórcz...

Dyskusja

W protokole krytycznymi etapami są przygotowanie komórek zrębu grasicy (sekcja 3) i wzbogacenie TEC (sekcja 4). Zdecydowanie zaleca się, aby za każdym razem przygotowywany był świeży roztwór enzymu, a tkanka była traktowana tak szybko, jak to możliwe. W przypadku grasicy zbiorczej wymagana jest optymalizacja objętości roztworu enzymatycznego w zależności od liczby grasicy. Jeśli po przetworzeniu pozostaną jakiekolwiek pozostałości tkanek, dodanie większej ilości roztworu enzymatycznego i wydłużenie czasu inkubacji może z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciw myszom EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Klon G8.8
Anty-mysz MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Klon M5/114.15.2
Anty-mysz Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Klon 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	LSRFortessa
Sortownik przepływowy	BD Biosciences	Probówki FACSAria
FACS	BD Biosciences	352052
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX różni się w zależności od fluorochromu, a YY różni się w zależności od wielkości fiolki.