Artykuł metodologiczny

Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu

DOI:

10.3791/51781

⸱

5 sierpnia 2014

 ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neuroscience Research Institute, Department of Neurological Surgery, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazowe uszkodzenia mózgu (TBI) pozostają poważnym problemem zdrowotnym. Wykorzystując model chirurgii kontrolowanego wpływu kory mózgowej, można przeprowadzić badania nad skutkami TBI i możliwymi metodami leczenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdego roku ponad milion Amerykanów doznaje urazowego uszkodzenia mózgu (TBI). W połączeniu z występowaniem TBI na całym świecie, skutki fizyczne, emocjonalne, społeczne i ekonomiczne są oszałamiające. Dlatego konieczne są dalsze badania nad skutkami TBI i skutecznymi metodami leczenia. Model kontrolowanego uderzenia korowego (CCI) wywołuje urazowe uszkodzenia mózgu, od łagodnych do ciężkich. Metoda ta wykorzystuje sztywny impaktor do dostarczania energii mechanicznej do nienaruszonej opony twardej odsłoniętej po kraniektomii. Uderzenie odbywa się przy precyzyjnych parametrach z zadaną prędkością, aby osiągnąć z góry określoną głębokość odkształcenia. Chociaż istnieją inne modele TBI, takie jak spadek masy ciała i płynna perkusja, CCI jest dokładniejszy, łatwiejszy do kontrolowania, a co najważniejsze, powoduje urazowe uszkodzenia mózgu podobne do tych obserwowanych u ludzi. Jednak żaden model TBI nie jest obecnie w stanie odtworzyć zmian patologicznych identycznych z tymi, które obserwuje się u ludzi. Model CCI umożliwia badanie krótko- i długoterminowych skutków TBI, takich jak śmierć neuronów, deficyty pamięci i obrzęk mózgu, a także potencjalne metody leczenia TBI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) definiuje się jako zmianę w funkcjonowaniu mózgu lub inny dowód patologii mózgu, spowodowany przez siłę zewnętrzną1. TBI pozostają poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie, szczególnie w Stanach Zjednoczonych. Według Centers for Disease Control and Prevention, co najmniej 1,7 miliona TBI występuje rocznie w Stanach Zjednoczonych, co powoduje 30,5% wszystkich zgonów związanych z urazami. W 2000 roku bezpośrednie koszty medyczne i pośrednie koszty TBI wyniosły szacunkowo 76,5 miliarda dolarów w samych Stanach Zjednoczonych. Chociaż postęp technologiczny i terapeutyczny w poprzednich dekadach poprawił jakość i długość życia osób cierpiących na TBI, obecnie nie ma skutecznych metod leczenia farmakologicznego lub zapobiegawczego. Ze względu na złożoność i dalekosiężne skutki TBI, w tym uszkodzenia tkanek, śmierć komórek i zwyrodnienie aksonów, nie ma dwóch identycznych urazów; w związku z tym żaden obecny model TBI dla zwierząt nie odtwarza dokładnie wszystkich aspektów TBI obserwowanych u ludzi. Jednak modele zwierzęce zapewniają możliwość wytwarzania prawie identycznych urazów niezbędnych do zbadania różnych skutków TBI z nadzieją na dalsze zrozumienie klinicznych objawów TBI.

Model kontrolowanego uderzenia korowego (CCI) wykorzystuje system uderzeń do fizycznego uderzenia w odsłoniętą oponę twardą zwierzęcia. Wywołuje TBI w zakresie od łagodnego do ciężkiego, podobnego do tych, których doświadczają ludzie. Uraz ten został po raz pierwszy scharakteryzowany u fretki2, a później został przystosowany do stosowania u szczura3,4, myszy5-7 i owcy8. Od czasu pierwszej charakterystyki miejsce urazu zostało umieszczone zarówno nad linią środkową2,9, jak i korą boczną10. CCI zapewnia łatwą i dokładną metodę badania skutków i potencjalnych metod leczenia TBI.

Oprócz modelu CCI, modele płynnego uderzenia i spadku masy są powszechnie używane do produkcji TBI. Modele te mają jednak ograniczenia, w tym mniejszą kontrolę nad parametrami urazu, powodując zmiany histopatologiczne nieobserwowane u ludzi TBI oraz większą częstość przypadkowych zgonów u myszy3,5,10. Model fali uderzeniowej jest również używany do produkcji TBI. Chociaż model fali uderzeniowej nie odtwarza zmian histopatologicznych obserwowanych po uderzeniu mechanicznym, model ten dokładnie tworzy TBI, których doświadcza szczególnie personel wojskowy11. Model kontrolowanego uderzenia kory mózgowej jest łatwy do kontrolowania dzięki precyzyjnej kontroli parametrów deformacji, takich jak czas, prędkość i głębokość uderzenia5. Taka dokładność sprawia, że odtworzenie niemal identycznych obrażeń w całej grupie zwierząt jest bardziej wykonalne. Co najważniejsze, CCI odtwarza TBI z cechami obserwowanymi u ludzkich TBI12. Nie ma jednak jednego modelu zwierzęcego, który byłby w pełni skuteczny w odtwarzaniu pełnego spektrum zmian patologicznych obserwowanych po TBI. Konieczne są dalsze badania, aby w pełni ujawnić ostre i przewlekłe zmiany, które zachodzą po TBI.

Po TBI występują dwa rodzaje urazów: pierwotne i wtórne. Uraz pierwotny występuje w momencie uderzenia i nie jest wrażliwy na zabiegi terapeutyczne; Jednak urazy wtórne, które utrzymują się po początkowym urazie, podlegają leczeniu13. Model kontrolowanego uderzenia kory mózgowej powoduje uraz pierwotny, co pozwala naukowcom na zbadanie skutków TBI i potencjalnych metod leczenia potencjalnie długotrwałych skutków urazów wtórnych. Obszary potencjalnych badań z wykorzystaniem modelu CCI obejmują śmierć neuronów, obrzęk mózgu, neurogenezę, efekty naczyniowe, zmiany histopatologiczne, deficyty pamięci i wiele innych3,13-16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami
Samce myszy C57 BL/6 trzymano w grupach i trzymano w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Zwierzęta wykorzystane w tym protokole miały 10-12 tygodni. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Indiana.

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Znieczulić mysz za pomocą mieszaniny ketaminy i ksylazyny (87,7 mg/ml ketaminy i 12,3 mg/ml ksylazyny) i podać (1 ml/kg) we wstrzyknięciu IP.
  2. Ogol głowę myszy między uszami.
  3. Nałóż galaretkę na bazie ropy naftowej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji.
  4. Oczyść ogolone miejsce 10% jodem. Następnie użyj 70% etanolu, aby usunąć jod.
  5. Zamocuj główkę myszy w ramie stereotaktycznej za pomocą pasków nausznych i płytki zgryźnej. Upewnij się, że mózg jest stabilny.

2. Kraniektomia

  1. Wykonaj podłużne nacięcie na środku głowy nożyczkami. Użyj hemostatu, aby przytrzymać skórę na lewej stronie.
  2. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć krew i tkankę z kości, aby odsłonić czaszkę. Pozostaw odsłoniętą czaszkę do wyschnięcia na 1 minutę.
  3. Użyj kleszczy, aby wywrzeć nacisk i upewnić się, że czaszka pozostaje nieruchoma. Zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne Lambda (aspekt ogonowy) i Bregma (aspekt czołowy). Narysuj okrąg na środku Lambda i Bregma o średnicy 4 mm i odległości 0,5 mm od linii środkowej.
  4. Użyj wiertła, aby przeciąć wzdłuż zaznaczonego okręgu. Delikatnie zdmuchnij pył kostny. Nie należy całkowicie przewiercać kości, aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej.
  5. Użyj kleszczy, aby usunąć kość i odsłonić oponę twardą.

3. Impakcja

System uderzeniowy zawiera skrzynkę kontrolną do ustawiania parametrów uderzenia, siłownik do wykonywania uderzenia oraz ramkę stereotaktyczną do zabezpieczania siłownika i głowicy myszy przed uderzeniem.

  1. Wstępnie ustaw prędkość siłownika na 3 m/s przed operacją.
  2. Wstępnie ustawione różne głębokości deformacji, aby wywołać różne nasilenie obrażeń. Głębokości deformacji 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm i 1,2-2,0 mm skutkowałyby odpowiednio łagodnym, umiarkowanym i ciężkim TBI. Protokół ten wyjaśniał, w jaki sposób osiągnąć umiarkowanie ciężkie uszkodzenie mózgu o głębokości deformacji 1 mm przy użyciu prędkości 3 m/s.
  3. Przymocuj siłownik do uchwytu w ramie stereotaktycznej i za pomocą przesuwających go mikromanipulatorów zamocuj okrągłą, płaską końcówkę siłownika (o średnicy 3 mm) pośrodku otwartego obszaru czaszki. Następnie wyreguluj końcówkę pod kątem równoległym do powierzchni miejsca uderzenia.
  4. Ustal punkt zerowy, przesuwając siłownik w dół w modelu przedłużającym, aż końcówka dotknie powierzchni miejsca uderzenia. Następnie ustaw kanał Z na stereotaktycznym panelu sterowania na zero.
  5. Cofnąć końcówkę impaktora, jednocześnie przesuwając siłownik o 1 mm w dół.
  6. Naciśnij przycisk uderzenia, aby uderzyć w miejsce urazu i osiągnąć głębokość odkształcenia 1 mm.

4. Zamknięcie miejsca kontuzji

  1. Użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby usunąć krew po uderzeniu, ale nie dotykaj obszaru urazu.
  2. Umieść mysz na ciepłej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała.
  3. Po ustaniu krwawienia należy zaszyć ranę. Umieść zwierzę z powrotem w czystej klatce i pozwól mu dojść do siebie po operacji przez noc na ciepłej podkładce.
  4. Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,05-0,10 mg/kg mc. mc. co 8-12 godzin przez 2 dni po zabiegu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model kontrolowanego urazu korowego (CCI) pozwala na wywołanie TBI o stopniu ciężkości od łagodnego do ciężkiego. Po uderzeniu stopień obrzęku czaszki, krwawienia oraz zniekształcenia czaszki w miejscu uderzenia ujawnia stopień ciężkości urazu wynikający z parametrów prędkości i głębokości deformacji. Łagodne TBI skutkują obrzękiem czaszki w miejscu uderzenia i niewielkim krwawieniem ze względu na ograniczony przerwany otwór w oponie twardej. Umiarkowane TBI objawiają się obrzękiem czaszki i nasilonym krwawieniem spowodo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznymi krokami do skutecznego generowania spójnych TBI przy użyciu elektronicznego systemu uderzenia magnesu w celu wywołania CCI są: 1) stabilne zamocowanie główki myszy w ramie stereotaktycznej; 2) generowanie tego samego rozmiaru okna kostnego między myszami i usuwanie kości bez uszkadzania opony twardej pod nią podczas kraniektomii; 3) prawidłowe ustawienie końcówki udarowej na środku otwartej przestrzeni i ustalenie punktu zerowego przed uderzeniem.

Głowica myszy musi być...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z Indiana Spinal Cord & Brain Injury Research Grants (SCBI 200-12), Ralph W. and Grace M. Showalter Research Award, Indiana University Biological Research Grant, NIH grants RR025761 i 1R21NS072631-01A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jod powidonu 7,5%Purdue produkt L.P.Peeling chirurgiczny
Aplikatory z bawełnianą końcówkąHenry Schein100-6015Usuń krew i zanieczyszczenia
NożyczkiFine Science Tools14084-08Chirurgia
ForceptFine Science Tools11293-00Chirurgia
HemostatFine Science Tools13021-12Chirurgia
Akumulatorowa akumulatorowa mikrowiertarkaStoelting58610Połącz z zadziorami do generowania okna kostnego
Zadziory do Micro DrillFine Science Tools19007-05
Monofilament do szwówEthiconG697Szew
Alkohol tert-amylowySigma152463-250MLWytwarzanie 2,5% Avertin
2,2,2-TribromoetanolSigmaT48402-25GWytwarzanie 2,5% Avertin

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
  2. Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
  3. Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
  4. Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
  5. Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
  6. Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
  7. Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
  8. Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
  9. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
  10. Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
  11. Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
  12. Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
  13. Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
  14. Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
  15. Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
  16. Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kraniektomia myszykonfiguracja systemu uderzeniowegoustawienie pr dko ci si ownikapomiar g boko ci deformacjiods oni cie opony twardejjama urazu m zguanaliza histopatologicznabarwienie immunohistochemiczne

Powiązane artykuły