Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) definiuje się jako zmianę w funkcjonowaniu mózgu lub inny dowód patologii mózgu, spowodowany przez siłę zewnętrzną¹. TBI pozostają poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie, szczególnie w Stanach Zjednoczonych. Według Centers for Disease Control and Prevention, co najmniej 1,7 miliona TBI występuje rocznie w Stanach Zjednoczonych, co powoduje 30,5% wszystkich zgonów związanych z urazami. W 2000 roku bezpośrednie koszty medyczne i pośrednie koszty TBI wyniosły szacunkowo 76,5 miliarda dolarów w samych Stanach Zjednoczonych. Chociaż postęp technologiczny i terapeutyczny w poprzednich dekadach poprawił jakość i długość życia osób cierpiących na TBI, obecnie nie ma skutecznych metod leczenia farmakologicznego lub zapobiegawczego. Ze względu na złożoność i dalekosiężne skutki TBI, w tym uszkodzenia tkanek, śmierć komórek i zwyrodnienie aksonów, nie ma dwóch identycznych urazów; w związku z tym żaden obecny model TBI dla zwierząt nie odtwarza dokładnie wszystkich aspektów TBI obserwowanych u ludzi. Jednak modele zwierzęce zapewniają możliwość wytwarzania prawie identycznych urazów niezbędnych do zbadania różnych skutków TBI z nadzieją na dalsze zrozumienie klinicznych objawów TBI.

Model kontrolowanego uderzenia korowego (CCI) wykorzystuje system uderzeń do fizycznego uderzenia w odsłoniętą oponę twardą zwierzęcia. Wywołuje TBI w zakresie od łagodnego do ciężkiego, podobnego do tych, których doświadczają ludzie. Uraz ten został po raz pierwszy scharakteryzowany u fretki², a później został przystosowany do stosowania u szczura^3,4, myszy^5-7 i owcy⁸. Od czasu pierwszej charakterystyki miejsce urazu zostało umieszczone zarówno nad linią środkową^2,9, jak i korą boczną¹⁰. CCI zapewnia łatwą i dokładną metodę badania skutków i potencjalnych metod leczenia TBI.

Oprócz modelu CCI, modele płynnego uderzenia i spadku masy są powszechnie używane do produkcji TBI. Modele te mają jednak ograniczenia, w tym mniejszą kontrolę nad parametrami urazu, powodując zmiany histopatologiczne nieobserwowane u ludzi TBI oraz większą częstość przypadkowych zgonów u myszy^3,5,10. Model fali uderzeniowej jest również używany do produkcji TBI. Chociaż model fali uderzeniowej nie odtwarza zmian histopatologicznych obserwowanych po uderzeniu mechanicznym, model ten dokładnie tworzy TBI, których doświadcza szczególnie personel wojskowy11. Model kontrolowanego uderzenia kory mózgowej jest łatwy do kontrolowania dzięki precyzyjnej kontroli parametrów deformacji, takich jak czas, prędkość i głębokość uderzenia⁵. Taka dokładność sprawia, że odtworzenie niemal identycznych obrażeń w całej grupie zwierząt jest bardziej wykonalne. Co najważniejsze, CCI odtwarza TBI z cechami obserwowanymi u ludzkich TBI¹². Nie ma jednak jednego modelu zwierzęcego, który byłby w pełni skuteczny w odtwarzaniu pełnego spektrum zmian patologicznych obserwowanych po TBI. Konieczne są dalsze badania, aby w pełni ujawnić ostre i przewlekłe zmiany, które zachodzą po TBI.

Po TBI występują dwa rodzaje urazów: pierwotne i wtórne. Uraz pierwotny występuje w momencie uderzenia i nie jest wrażliwy na zabiegi terapeutyczne; Jednak urazy wtórne, które utrzymują się po początkowym urazie, podlegają leczeniu¹³. Model kontrolowanego uderzenia kory mózgowej powoduje uraz pierwotny, co pozwala naukowcom na zbadanie skutków TBI i potencjalnych metod leczenia potencjalnie długotrwałych skutków urazów wtórnych. Obszary potencjalnych badań z wykorzystaniem modelu CCI obejmują śmierć neuronów, obrzęk mózgu, neurogenezę, efekty naczyniowe, zmiany histopatologiczne, deficyty pamięci i wiele innych^3,13-16.

Opieka nad zwierzętami
Samce myszy C57 BL/6 trzymano w grupach i trzymano w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Zwierzęta wykorzystane w tym protokole miały 10-12 tygodni. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Indiana.

1. Przygotowanie chirurgiczne

1. Znieczulić mysz za pomocą mieszaniny ketaminy i ksylazyny (87,7 mg/ml ketaminy i 12,3 mg/ml ksylazyny) i podać (1 ml/kg) we wstrzyknięciu IP.
2. Ogol głowę myszy między uszami.
3. Nałóż galaretkę na bazie ropy naftowej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji.
4. Oczyść ogolone miejsce 10% jodem. Następnie użyj 70% etanolu, aby usunąć jod.
5. Zamocuj główkę myszy w ramie stereotaktycznej za pomocą pasków nausznych i płytki zgryźnej. Upewnij się, że mózg jest stabilny.

2. Kraniektomia

1. Wykonaj podłużne nacięcie na środku głowy nożyczkami. Użyj hemostatu, aby przytrzymać skórę na lewej stronie.
2. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć krew i tkankę z kości, aby odsłonić czaszkę. Pozostaw odsłoniętą czaszkę do wyschnięcia na 1 minutę.
3. Użyj kleszczy, aby wywrzeć nacisk i upewnić się, że czaszka pozostaje nieruchoma. Zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne Lambda (aspekt ogonowy) i Bregma (aspekt czołowy). Narysuj okrąg na środku Lambda i Bregma o średnicy 4 mm i odległości 0,5 mm od linii środkowej.
4. Użyj wiertła, aby przeciąć wzdłuż zaznaczonego okręgu. Delikatnie zdmuchnij pył kostny. Nie należy całkowicie przewiercać kości, aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej.
5. Użyj kleszczy, aby usunąć kość i odsłonić oponę twardą.

3. Impakcja

System uderzeniowy zawiera skrzynkę kontrolną do ustawiania parametrów uderzenia, siłownik do wykonywania uderzenia oraz ramkę stereotaktyczną do zabezpieczania siłownika i głowicy myszy przed uderzeniem.

1. Wstępnie ustaw prędkość siłownika na 3 m/s przed operacją.
2. Wstępnie ustawione różne głębokości deformacji, aby wywołać różne nasilenie obrażeń. Głębokości deformacji 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm i 1,2-2,0 mm skutkowałyby odpowiednio łagodnym, umiarkowanym i ciężkim TBI. Protokół ten wyjaśniał, w jaki sposób osiągnąć umiarkowanie ciężkie uszkodzenie mózgu o głębokości deformacji 1 mm przy użyciu prędkości 3 m/s.
3. Przymocuj siłownik do uchwytu w ramie stereotaktycznej i za pomocą przesuwających go mikromanipulatorów zamocuj okrągłą, płaską końcówkę siłownika (o średnicy 3 mm) pośrodku otwartego obszaru czaszki. Następnie wyreguluj końcówkę pod kątem równoległym do powierzchni miejsca uderzenia.
4. Ustal punkt zerowy, przesuwając siłownik w dół w modelu przedłużającym, aż końcówka dotknie powierzchni miejsca uderzenia. Następnie ustaw kanał Z na stereotaktycznym panelu sterowania na zero.
5. Cofnąć końcówkę impaktora, jednocześnie przesuwając siłownik o 1 mm w dół.
6. Naciśnij przycisk uderzenia, aby uderzyć w miejsce urazu i osiągnąć głębokość odkształcenia 1 mm.

4. Zamknięcie miejsca kontuzji

1. Użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby usunąć krew po uderzeniu, ale nie dotykaj obszaru urazu.
2. Umieść mysz na ciepłej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała.
3. Po ustaniu krwawienia należy zaszyć ranę. Umieść zwierzę z powrotem w czystej klatce i pozwól mu dojść do siebie po operacji przez noc na ciepłej podkładce.
4. Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,05-0,10 mg/kg mc. mc. co 8-12 godzin przez 2 dni po zabiegu.

Model kontrolowanego wpływu kory mózgowej powoduje TBI o różnym nasileniu od łagodnego do ciężkiego. Po zderzeniu stopień obrzęku czaszki, krwawienia i zniekształceń czaszki w miejscu uderzenia ujawni dotkliwość urazu wynikającą z parametrów prędkości i głębokości deformacji. Łagodne TBI powodują obrzęk czaszki w miejscu uderzenia i lekkie krwawienie z powodu ograniczonego naruszenia opony twardej. Umiarkowane TBI objawia się obrzękiem czaszki i zwiększonym krwawieniem z powodu naruszenia opony twardej po zaklinowaniu (ryc. 1). Różnica między umiarkowanym a ciężkim TBI może być trudna do odróżnienia, dopóki nie zostanie uwidoczniona na utrwalonych tkankach za pomocą mikroskopu (ryc. 2); jednak ciężkie TBI może czasami wykazywać wzmocnione zniekształcenia i obrzęk czaszki po uderzeniu. Model CCI może być wykorzystany do określenia skutków wielu aspektów TBI, w tym deformacji tkanek (ryc. 2), śmierci neuronów i zmian histopatalicznych.

Rysunek 1. Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w umiarkowanym urazowym uszkodzeniu mózgu. Procedura kontrolowanego oddziaływania kory mózgowej jest zilustrowana na tym rysunku. A) Głowa myszy była stabilnie zamocowana na ramie stereotaktycznej za pomocą paska na uszy i końcówek ustnych. B) Lewa czaszka została odsłonięta, a w środku bregmy i lambdy narysowano 4 mm okrąg. C) Kość została usunięta przez wiercenie, aby wygenerować okno na uderzenie. D) Siłownik został zamocowany na ramie stereotaktycznej i ustawiono punkt zerowy na osi Z. E) Tkanka mózgowa była zniekształcona i spowodowała krwawienie przy uderzeniu. F) Krwawienie ustało kilka minut po uderzeniu, a krew została usunięta za pomocą bawełnianego aplikatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Histologia umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu. A) Usunięto naiwny 10-12-tygodniowy mózg myszy. B) 10-12-tygodniowy mózg myszy został użyty jako pozorowana kontrola. C) Mózg 10-12 tygodniowej myszy został usunięty 24 godziny po umiarkowanym TBI przy użyciu modelu CCI. D) Mózg 10-12 tygodniowej myszy usunięto 6 tygodni po umiarkowanym TBI przy użyciu modelu CCI. Wgłębienie w tkance mózgowej jest widoczne w miejscu uderzenia. E) Barwienie Nissl przeprowadzono na pozorowanym 10-12-tygodniowym mózgu myszy w celu wykazania normalnej histologii. F) Barwienie Nissl przeprowadzono na 10-12-tygodniowym mózgu myszy, który otrzymał umiarkowane TBI przy użyciu modelu CCI. Widoczna jest jama sięgająca głęboko w korę mózgową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.