Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51796

⸱

2 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Streszczenie

W tym protokole przedstawiamy wymagane materiały oraz procedurę tworzenia zmodyfikowanego C. elegans Pożywki habituacyjne i rozrodcze (mCeHR). Dodatkowo opisano etapy wystawiania i aklimatyzacji C. elegans hodowanych na E. coli do aksenicznego płynnego podłoża. Wreszcie, dalsze eksperymenty, które wykorzystują akseniczny C. elegans, ilustrują korzyści płynące z tej procedury. Zdolność do analizy i określenia zapotrzebowania C. elegans na składniki pokarmowe zilustrowano hodowlą robaków N2 typu dzikiego w płynnych pożywkach aksenowych o różnych stężeniach hemu. Procedurę tę można powtórzyć z innymi składnikami odżywczymi w celu określenia optymalnego stężenia dla wzrostu i rozwoju robaków lub w celu określenia skutków toksykologicznych leczenia farmakologicznego. Wpływ różnych stężeń hemu na wzrost robaków typu dzikiego określono za pomocą jakościowej obserwacji mikroskopowej i ilościowego określenia liczby robaków, które rosły w każdym stężeniu hemu. Ponadto wpływ różnych stężeń składników odżywczych można oznaczyć, wykorzystując robaki z ekspresją czujników fluorescencyjnych, które reagują na zmiany w interesującym składniku odżywczym. Co więcej, z łatwością wyprodukowano dużą liczbę robaków do wytworzenia transgenicznego C. elegans za pomocą bombardowania mikrocząsteczkami.

Wprowadzenie

Nicień glebowy, Caenorhabditis elegans, jest potężnym organizmem modelowym, wykorzystywanym w licznych badaniach, od genetyki po toksykologię. Ze względu na rozmiar 1 mm, szybki czas generacji wynoszący cztery dni, łatwość uprawy i dużą liczbę potomstwa, nicienie te zostały wykorzystane w wielu genetycznych i farmakologicznych badaniach przesiewowych 1,2. Naukowcy wykorzystują tego robaka do identyfikacji cząsteczek i szlaków zachowanych w systemach kręgowców. Szlaki te obejmują sygnały śmierci komórki, szlaki starzenia się i metabolizmu oraz układ nerwowy3-6. Dodatkowo, przezroczystość C. elegans pozwala na generowanie linii transgenicznych za pomocą fluorescencyjnych reporterów białkowych, które mogą być bezpośrednio wizualizowane w celu analizy wzorców ekspresji genów i lokalizacji białek.

W wielu badaniach ten nicień jest hodowany na powierzchni na bazie agaru przy użyciu płytek z pożywką dla nicieni (NGM) lub w płynnych kulturach wysiewanych z Escherichia coli jako źródłem pożywienia7,8. Te bakteryjne źródła pożywienia mogą mylić badania biochemiczne i toksykologiczne z zakłóceniami powodowanymi przez bakteryjne produkty uboczne wpływające na interpretację wyników. Aby uniknąć tych narastających efektów, C. elegans można hodować w płynnym pożywce aksenowej, która jest pozbawiona bakterii jako źródła pożywienia. Korzystając z tej pożywki, z powodzeniem wyhodowaliśmy miliony wysoce zsynchronizowanych robaków dla wielu standardowych protokołów C. elegans, w tym analizy mikromacierzy różnie regulowanych genów u C. elegans wystawionych na różne stężenia hemu oraz produkcji transgenicznych robaków za pomocą bombardowania genów. Pożywka ta jest chemicznie zdefiniowana i zmodyfikowana na podstawie oryginalnej receptury opracowanej przez dr Erica Clegga9. Korzystając z tej pożywki mCeHR, udało nam się zidentyfikować geny zaangażowane w homeostazę hemu, określane jako geny reagujące na hem (hrgs)10, co nie byłoby możliwe w normalnych warunkach wzrostu, które wykorzystują płytki agarowe NGM wysiane E. coli.

W tym protokole opisujemy procedurę wprowadzania i utrzymywania C. elegans wyhodowanych na E. coli do aksonicznego mCeHR i wykorzystujemy tę metodę do uzyskania dużej liczby robaków do produkcji transgenicznych linii C. elegans za pomocą bombardowania mikrocząsteczkami. Przedstawiamy również badania, które pokazują przydatność stosowania pożywek aksenicznych do określania zapotrzebowania żywieniowego C. elegans na przykładzie hemu. Badania te pokazują, że stosowanie pożywek mCeHR pozwala na szybki wzrost dużej liczby C. elegans w wielu dalszych zastosowaniach wykorzystywanych przez badaczy robaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Szczepy robaków

  1. Otrzymaj szczepy C. elegans Bristol N2 typu dzikiego z Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) i utrzymuj je na płytkach NGM wysianych szczepem E. coli OP507. Uwaga: Wykorzystano transgeniczne szczepy robaków IQ6011 (Phrg-1::GFP) w sposób opisany wcześniej11. IQ6011 można zamówić u autora korespondencyjnego.

2. Przygotowanie zmodyfikowanego podłoża do siedliska i rozmnażania C. elegans (mCeHR)

Przygotuj płynne media mCeHR zgodnie z opisem poniżej12. To akseniczne płynne podłoże pozwala robakom rosnąć bez żadnych dodatkowych źródeł pożywienia. Wszystkie manipulacje płynnymi mediami aksenicznymi i robakami aksenicznymi należy wykonywać w ściśle sterylnych warunkach, takich jak okap z przepływem laminarnym.

  1. Zdobądź ultra pasteryzowane mleko beztłuszczowe ze sklepu spożywczego. Używaj produktu schłodzonego, a nie produktu o temperaturze pokojowej. Przed użyciem w pożywce mCeHR rozpylić mleko na płytkach agarowych Brain Heart Infusion (BHI) i inkubować przez 3 dni w temperaturze 30 °C i 37 °C, aby sprawdzić sterylność. Przenieść mleko do sterylnych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C
  2. Przygotować każdy z następujących składników i połączyć w podanej kolejności i ilościach w celu przygotowania 1 l mCeHR (tabela 1A): 10 ml 2 mM cytrynianu dwukwasowego choliny, 10 ml mieszanki witamin i czynników wzrostu (patrz przepis w tabeli 1B), 10 ml 2,4 mM mio-inozytolu, 10 ml 2 mM chlorku heminy, 250 ml wody dejonizowanej. Zastosuj odsysanie i przefiltruj przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.
  3. Dodać 20 ml mieszaniny kwasów nukleinowych (przepis w tabeli 1C), 100 ml mieszanki mineralnej (przepis w tabeli 1D), 20 ml 170 mg/ml hydrolizatu laktoalbuminy, 20 ml aminokwasów egzogennych, 10 ml aminokwasów endogennych, 20 ml 450 mM KH2PO4, 50 ml 1,45 M D-glukozy, 10 ml 1 M HEPES, sól sodowa, 250 ml wody dejonizowanej.
  4. Zastosuj ssanie do filtra, wysterylizuj elementy. Wyjmij filtr i dodaj 1 ml 5 mg/ml cholesterolu. Upewnij się, że pH podłoża wynosi około 6-6,5. Uwaga: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.
  5. Przed użyciem dodać 20% (v/v) ultra pasteryzowanego ekologicznego mleka odtłuszczonego do podłoża mCeHR. Stosuj skrupulatnie sterylną technikę (na przykład w okapie z przepływem laminarnym) podczas otwierania i porcjowania mleka. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie C. elegans do hodowli w płynnym podłożu Axenic mCeHR

  1. Hoduj robaki na dziesięciu 60-milimetrowych płytkach NGM, aż na płytkach pojawi się wiele grawitacyjnych robaków i minimalna ilość OP50 E. coli.
  2. Usunąć robaki z każdej płytki, przepłukując ją 5 ml buforu M9 (przepis w tabeli 1F) i połączyć w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  3. Pozwól robakom się uspokoić, pozostawiając probówkę na 5 do 10 minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant zawierający E. coli.
  4. Powtórz kroki 3.2 i 3.3 2x, aby usunąć jak najwięcej resztek bakterii przed kontynuowaniem procedury.
  5. Zawiesić robaki w 0,1 N NaCl w objętości będącej wielokrotnością trzech, na przykład 1,5 ml, 3 ml lub 6 ml, w której w probówce można zobaczyć pojedyncze robaki.
  6. Wybielać robaki, dodając 5 N NaOH i 5% roztwór podchlorynu sodu (wybielacza) w stosunku 1:2:6 do zawiesiny robaków. Na przykład 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% podchlorynu sodu: 6 ml zawiesiny robaków. Wymieszaj NaOH i wybielacz przed dodaniem do zawiesiny robaków.
  7. Energicznie mieszać roztwór, aż robaki ciężarne rozpuszczą się i w zawiesinie widoczne będą tylko jaja (około 5 do 10 minut). Monitoruj proces za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 10X.
  8. Po całkowitym rozpuszczeniu robaków, natychmiast zagnieździć jaja w granulkach o masie 800 x g przez 45 sekund w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dwukrotnie przepłukać osad 10 ml sterylnej wody, odwirowując osad o sile 800 x g przez 45 sekund w temperaturze 4 °C.
  9. Po wybieleniu przenieść osad jajowy do kolby do hodowli tkankowych o średnicy 25cm2 zawierającej 10 ml pożywki mCeHR uzupełnionej 100 μg/ml tetracykliny. Przeprowadź tę procedurę przy użyciu sterylnych technik. W razie potrzeby dodać dodatkowe antybiotyki, w tym 250 μg/ml kwasu nalidyksowego, aby zapobiec rozwojowi bakterii w płynnych kulturach aksenu.
  10. Inkubować płynne kultury w temperaturze 20 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością około 70 obr./min.
  11. Sprawdzaj robaki codziennie, aby zanotować etap rozwoju i tempo wzrostu.
    Uwaga: Robaki początkowo rosną powoli i potrzebują od 7 do 10 dni, aby stać się ciężarne. Jednak w miarę jak robaki aklimatyzują się do płynnego podłoża, czas generacji skróci się do około 4 dni w przypadku robaków typu dzikiego (N2).
  12. Po tym, jak robaki osiągną stan ciężaru w płynnym podłożu, przenieść kulturę robaków do stożkowej rurki i granulować robaki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wahadłowego wirnika kubełkowego.
  13. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad robaka w równej objętości 0,1 M NaCl. Na przykład należy użyć 10 ml 0,1 M NaCl dla robaków hodowanych w 10 ml mCeHR. Pozwól robakom osiąść na lodzie przez 5 minut.
  14. Przeprowadzić procedurę bielenia opisaną powyżej w krokach 3.5-3.8 i pozwolić robakom rosnąć na drugie pokolenie w płynnym podłożu aksenicznym. W razie potrzeby ponownie dodaj antybiotyk, aby zahamować rozwój bakterii.
  15. Ponownie pozwól, aby robaki stały się ciężarne, a następnie osadź i ponownie zawieś robaki w 0,1 M NaCl, jak opisano w krokach 3.12 i 3.13, a następnie ponownie wybiel, jak opisano w krokach 3.5-3.8, aby uzyskać zsynchronizowaną populację. Od teraz hoduj larwy robaków L1 w płynnych pożywkach bez antybiotyków.

4. Synchronizacja robaków z płynnej kultury

  1. Osadzać i ponownie zawiesić robaki w 0,1 M NaCl, jak opisano powyżej w krokach 3.12 i 3.13. Wybielacz zgodnie z powyższym opisem w krokach 3.5-3.8.
  2. Zawiesić osad jaj w 10 ml bufora M9 i pozwolić larwom wykluć się O/N w temperaturze 20 °C na wytrząsarce na platformie obrotowej. Uwaga: Z jaj wykluwają się larwy L1, ale nie będą się dalej rozwijać, synchronizując robaki na etapie L1.
  3. Aby utrzymać i subkulturować robaki, larwy L1 należy otulić granulkami w ilości 800 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić larwy w 10 ml mCeHR i przenieść do kolby o średnicy25 cm2. Pozwól robakom rosnąć w temperaturze 20 °C na obrotowej platformie. Utrzymuj maksymalną gęstość 3,000 robaków/ml/cm2, aby zapewnić odpowiednie odżywianie robaków.
    Uwaga: Na tym etapie antybiotyki nie są wymagane do utrzymania warunków aksenicznych, gdy zabiegi są przeprowadzane przy użyciu technik sterylnych w okapie z przepływem laminarnym. Robaki należy sprawdzać codziennie, aby monitorować wzrost.

5. Zamrażanie i rozmrażanie robaków w średnich kulturach aksenicznych

  1. Zamrozić akseniczne asynchroniczne kultury robaków lub zsynchronizowane larwy L1 w ciekłym azocie. Robaki w granulkach w ilości 800 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zamieszać w buforze S (6,45 mM KHPO4, 43,55 mM KHPO4, 146,25 mM NaCl), używając 0,5 ml na każdą fiolkę. Dodać równą objętość buforu S z 30% v/v glicerolem do każdej fiolki i przenieść robaki do temperatury -80 °C przed długotrwałym przechowywaniem w płynieN2. Zamrozić około 1 x 106 robaków na ml w każdej fiolce.
  2. Rozmrażać robaki, inkubując fiolki w temperaturze 37 °C przez około 2 minuty, aż prawie cały lód się rozpuści. W okapie z przepływem laminarnym przenieść robaki do sterylnej kolby zawierającej mCeHR i umieścić je w temperaturze 20 °C.

6. Określ wpływ stężenia heminy na wzrost i reprodukcję w mCeHR

  1. Użyj pożywki axenic mCeHR do oznaczenia wzrostu C. elegans zależnego od składników odżywczych. Aby określić wpływ stężenia heminy na wzrost i rozwój robaków, użyj zsynchronizowanych aksenowych robaków N2 lub innych interesujących szczepów. Zsynchronizować larwy L1 zgodnie z powyższym opisem w sekcji 4.
  2. Następnego dnia osadzać i liczyć zsynchronizowane larwy L1 i rozcieńczać do 1 robaka na μl pożywki aksenowej. Zrobić 10 mM chlorku heminy w 0,3 M NH4OH i dostosować do pH 8 za pomocą skoncentrowanego HCl.
  3. Dodać 800 μl pożywki mCeHR do płytki 24-dołkowej. Dodać 100 robaków do każdej studzienki w 100 μl pożywki. Do każdej studzienki dodać chlorek heminy w stężeniach od 0 μM, 1,5 μM do 1 000 μM w trzech powtórzeniach. Upewnij się, że wszystkie studzienki zawierają takie samo stężenie 0,3 M NH4OH. Delikatnie zawiesić robaki przed pipetowaniem, aby upewnić się, że do każdej studzienki dodano 100 larw L1.
  4. Codziennie badaj robaki i zwracaj uwagę na wzrost każdego stężenia w każdej studzience. Policz liczbę robaków po 9 dniach inkubacji i wykreśl liczbę robaków/ml odpowiadającą każdemu stężeniu hemu (rysunek 1).

7. Wpływ stężenia heminy na robaki z czujnikiem hemu

  1. Inkubuj zsynchronizowane robaki czujnika hemu L1 (Phrg-1::gfp) w mCeHR zawierające 4 μM, 8 μM, 10 μM i 20 μM hemin.
  2. Zobrazuj robaki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, 48 godzin po inkubacji (ryc. 2).

8. Wykorzystanie mCeHR do generowania transgenicznych C. elegans za pomocą bombardowania mikrocząsteczkami

Uwaga: Procedura generowania i przeprowadzania bombardowania mikrocząsteczkami za pomocą robaków unc-119(ed3) hodowanych w mCeHR jest opisana na rysunku 313.

  1. Przygotowanie robaka
    1. Przenieść około 1 x 106 asynchronicznych robaków unc-119(ed3) w 90 ml pożywki mCeHR w kolbie o średnicy 175cm2 na tydzień przed bombardowaniem. Pozwól robakom rosnąć w temperaturze 20 °C na platformie wytrząsającej z prędkością ~70 obr./min (Rysunek 3-1).
      Uwaga: Tydzień później zagęszczenie robaków powinno być znacznie większe u wielu dorosłych robaków grawitacyjnych. Do bombardowania mikrocząsteczkami potrzebne będą około 3 x 107 robaków.
    2. Chill JM109 E. coli wysiał 10 cm płytki NGM na lodzie.
    3. Przenieść robaki akseniczne do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować robaki przy 800 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić robaki w każdej probówce w 50 ml buforu M9 (ryc. 3-2).
    4. Pozwól dorosłym robakom osadzać się grawitacyjnie na lodzie przez 10 do 15 minut.
      Uwaga: Granulka o pojemności 2 ml powinna teraz zawierać >90% dorosłych robaków. Ten 2 ml granulek powinien zawierać około 5 x 106 robaków i jest wystarczający do jednego bombardowania mikrocząsteczkami.
    5. Pokryj całą powierzchnię schłodzonej płytki NGM z nasionami JM109 2 ml granulki robaków. Poczekaj, aż płyn całkowicie się wchłonie, a następnie pozostaw płytkę na 30 minut na lodzie przed kontynuowaniem (Rysunek 3-3).
  2. Przygotowanie cząsteczek złota
    1. Odważyć 30 mg cząsteczek złota w silikonowanej probówce do mikrowirówki. Dodać 1 ml 70% etanolu i wirować w probówce przez 5 minut.
    2. Pozostaw probówkę na 15 minut, a następnie odwiruj przy 6 000 x g przez 10 sekund, aby osadzać cząsteczki złota. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety, ostrożnie dotykając końcówki po stronie probówki przeciwnej do cząstek złota.
    3. Umyj cząsteczki złota 1 ml sterylnej wody, wiruj przez 1 minutę i krótko odwiruj probówkę o sile 6 000 x g przez 10 sekund. Powtórz etap płukania dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś cząsteczki złota w 0,5 ml sterylnego 50% glicerolu.
      Uwaga: Końcowe stężenie cząsteczek złota wynosi 60 mg/ml i można je przechowywać przez 1 do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj mieszaninę cząsteczek DNA i złota
    1. Połącz 10 μg pożądanego plazmidowego DNA z 10 μg plazmidu ratunkowego unc-119 w silikonowanej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl wody demineralizowanej i 100 μl dobrze zawieszonego roztworu cząstek złota, a następnie wirować przez 1 minutę.
    2. Dodać 150 μl 2,5 M CaCl2 i ponownie wirować roztwór przez 1 minutę. Do tego roztworu dodać 60 μl 0,1 M spermidyny i wirować przez 3 do 5 minut.
    3. Pulsacyjnie odwirować roztwór o stężeniu 6 000 x g przez 10 sekund, usunąć supernatant i dodać 300 μl 70% etanolu. Wirować przez 1 minutę, wirować pulsacyjnie przy 6 000 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 170 μl 100% etanolu. Energicznie wirować roztwór przez 5 do 10 minut, a następnie odwirować pulsacyjnie i usunąć supernatant.
  4. Bombardowanie (Rysunek 3-3)
    Uwaga: Protokół ten jest przeprowadzany przy użyciu systemu dostarczania cząstek określonych w Tabeli materiałów/wyposażenia. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostępnymi przyrządów do dostarczania cząstek.
    1. Umieść arkusz bibuły na talerzu o średnicy 15 cm. Za pomocą pęsety zanurz siedem makronośników pojedynczo w 100% etanolu i połóż je na tkance do wyschnięcia.
    2. Dokładnie wyczyść komorę biolistyczną, uchwyt makronośnika i płytkę celowniczą 70% etanolem. Oczyść i autoklawuj sita zatrzymujące przed każdym zabiegiem bombardowania.
    3. Załaduj makrocarrriers do uchwytu za pomocą pęsety i wciśnij w uchwyt za pomocą narzędzia do osadzania.
    4. Równomiernie rozprowadź 20 μl cząstek złota pokrytych DNA w środku każdego makronośnika, a następnie pozwól roztworowi całkowicie wyschnąć.
    5. Oczyść dwie części rozdzielacza ciśnienia etanolem i zmontuj z oczyszczonymi z etanolu płytkami bezpieczeństwa. Przykręcić zmontowany dzielnik ciśnienia i płytki bezpieczeństwa do komory bombardowania.
    6. Zamontuj autoklawowany ekran zatrzymujący z uchwytem makronośnika i umieść urządzenie na wymaganej metalowej półce i zablokuj na miejscu.
    7. Włóż zmontowaną aparaturę makronośnika do komory biolistycznej w przeznaczonej do tego szczelinie poniżej dzielnika ciśnienia i wyrównaj z dzielnikiem ciśnienia.
    8. Przyklej otwartą płytkę NGM ze ślimakami do półki na płytę celowniczą i zamknij drzwiczki komory.
    9. Aby bombardować robaki, dostosuj ciśnienie do ciśnienia potrzebnego do złamania krążków bezpieczeństwa. Włącz podciśnienie do 28 cali ciśnienia Hg, a następnie naciśnij przycisk ognia, aż dyski pękną.
    10. Zwolnij podciśnienie i wyjmij płytkę NGM z aparatu. Umyj robaki z płytki i rozprowadź ponownie na dwudziestu 10-centymetrowych płytkach NGM wysianych JM109 E. coli (ryc. 3-4).
    11. Pozwól robakom rosnąć przez 10 do 14 dni w temperaturze 25 °C i zagłodzić płytki. Robaki uratowane z defektu unc-119 będą miały normalny ruch i można je zidentyfikować w tym czasie. Wybierz co najmniej 10 robaków "dzikiego" z oddzielnych płytek do dalszej analizy, ponieważ reprezentują one niezależne linie transgeniczne (ryc. 3-5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowla C. elegans w aksenicznym medium płynnym ułatwia określenie składników odżywczych niezbędnych dla nicieni, bez zakłóceń wywołanych przez metabolity wtórne produkowane przez E. coli. Nicienie typu dzikiego N2 aklimatyzują się do pożywki mCeHR w ciągu trzech pokoleń i wykazują wzrost porównywalny z nicieniami hodowanymi na bakteriowych płytkach NGM. W rzeczywistości nicienie te stają się zapłodnione w ciągu 4 dni, w porównaniu do 3,5 dnia w przypadku nicieni hodowanych na bakteriach OP50.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym protokole przedstawiamy zmodyfikowane akseniczne podłoże ciekłe mCeHR, które pozwala na szybkie wytwarzanie C. elegans przy produkcji dużej liczby robaków. Pożywka ta ma kilka zalet, ponieważ robaki są hodowane bez zanieczyszczania E. coli lub bakteryjnych produktów ubocznych i mogą być wykorzystywane w badaniach żywieniowych i toksykologicznych. Stosowanie E. coli lub innych bakterii w takich badaniach ma kilka wad. Na przykład wzrost bakterii może się zmieniać w różnych warunkach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów finansowych ani konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of HealthGrants DK85035 i DK074797 (I.H).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MgCl2• 6H2OSigmaM-2393
Cytrynian soduSigmaS-4641
Monohydrat cytrynianu potasuSigmaP-1722
CuCl2• 2H2OFisherC455-500
MnCl2• 4H2OFisherM87-100
ZnCl2SigmaZ-0152
Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2OSigmaF-1018
CaCl2• 2H2OFisherC70-500
5-monofosforan adenozyny, sól sodowaSigmaA-1752
5-fosforan cytydynySigmaC-1006
i 3'-monofosforan guanozynySigmaG-8002
5-fosforan urydyny, sól disodowaSigmaU-6375
TyminaSigmaT0376
N-acetyloglukozaminaSigmaA3286
DL-AlaninaFisherS25648 
Kwas p-aminobenzoesowySigmaA-9878
BiotynaSigmaB-4639
Cyjanokobalamina (B-12)SigmaV-2876
Folinian (Ca)SigmaF-7878
NiacynaSigmaN-0761
NiacynamidSigmaN-3376
PanteteinaSigmaP-2125
Pantotenian (Ca)SigmaP-6292
Kwas pteroiloglutaminowy (kwas foliowy)ACRCS21663-0100
5'-fosforan pirydoksaluSigmaP-3657
Pirydoksamina 2HClSigmaP-9158
Pirydoksyna HClSigmaP-6280
Ryboflawina 5-PO4(Na)SigmaR-7774
Tiamina HClSigmaT-1270
DL-6,8-kwas tioktowySigmaT-1395
KH2PO4SigmaP-5379
Cytrynian dwukwasowy cholinySigmaC-2004
myo-inozytolSigmaI-5125
D-GlucoseSigmaG-7520
Hydrolizat enzymatyczny laktoalbuminySigmaL-9010
Napar z serca mózguBD211065
Chlorek heminyFrontier ScientificH651-9
HEPES, sól sodowaSigmaH-3784
CholesterolJ.T. BakerF676-05
MEM Aminokwasy endogenneInvitrogen11140-076
MEM Roztwór aminokwasówInvitrogen11130-051
Sól sodowa kwasu nalidyksowegoSigmaN4382
Chlorowodorek tetracyklinyMP Biomedicals2194542
Biolistyczny system dostarczaniaBioRad165-2257
Cząsteczki złota (Au Powder)   Ferro Electronic Material Systems6420 2504, JZP01010KM
lub
cząstki złota 1.0 i mu; mBioRad  165-2263
2'-

Bibliografia

  1. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  2. Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
  3. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
  4. Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
  5. Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
  6. Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109(2011).
  7. Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
  8. Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
  9. Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
  10. Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044(2010).
  11. Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
  12. Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
  13. Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
  14. Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
  15. Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19(2003).
  16. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
  17. White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
  18. Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
  19. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  20. Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40(2004).
  21. Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hodowla C. eleganspożywka M-C-E-H-Rstężenie hemuzapotrzebowanie na składniki odżywczetechnika sterylnasynchronizacja nicienisensory fluorescencyjne
Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.