Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Podsumowanie

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Streszczenie

Wadliwa naprawa DNA prowadzi do zwiększonej niestabilności genomu, co jest główną przyczyną mutacji prowadzących do nowotworzenia. Analiza częstości występowania i rodzaju aberracji chromosomowych w różnych typach komórek pozwala na wyjaśnienie defektów w szlakach naprawy DNA. Zrozumienie biologii naprawy DNA ssaków było znacznie pomocne dzięki produkcji myszy z nokautami w określonych genach. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu w mysich limfocytach B. Znakowanie telomerów za pomocą sond PNA-FISH (peptide nucleic acid - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) ułatwia szybką analizę niestabilności genomu w rozprzestrzenianiu się chromosomów metafazy. Limfocyty B mają specyficzne zalety w stosunku do fibroblastów, ponieważ mają normalną ploidalność i wyższy indeks mitotyczny. Krótkoterminowa hodowla limfocytów B umożliwia zatem precyzyjny pomiar niestabilności genomu w pierwotnej populacji komórek, która prawdopodobnie będzie miała mniej wtórnych mutacji genetycznych niż te, które zwykle występują w przekształconych fibroblastach lub liniach komórkowych pacjentów.

Wprowadzenie

Rak jest spowodowany przez nagromadzenie mutacji wpływających na geny, które regulują normalny wzrost komórek. Mutacja jest konsekwencją zmian w strukturze i sekwencji genomu spowodowanych uszkodzeniem DNA. Uszkodzenie DNA może nastąpić w wyniku różnych procesów, w tym czynników egzogennych, takich jak promieniowanie jonizujące, oraz jako produkt uboczny normalnego metabolizmu komórkowego, takiego jak spontaniczna deaminacja zasad nukleotydowych lub uszkodzenie powstałe w wyniku kontaktu z reaktywnymi formami tlenu¹.

Chociaż komórki ssaków posiadają szereg czynności naprawczych, które mogą odwrócić uszkodzenia DNA lub przywrócić sekwencję w miejscach przerwania, mutacje kumulują się przez cały okres życia komórki. Uszkodzenie DNA może ponadto przyczyniać się do starzenia się i utraty siły działania komórek macierzystych, dwóch procesów związanych z chorobami związanymi ze starzeniem^{się 2}. Zrozumienie procesu naprawy uszkodzeń DNA ma zatem zasadnicze znaczenie dla rozwiązania dwóch istotnych problemów w dziedzinie zdrowia publicznego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że szlaki naprawy DNA ssaków mogą przyczyniać się do ewolucji genomu komórek nowotworowych^3,4, co sprawia, że jeszcze ważniejsze staje się zrozumienie procesów związanych z tłumieniem mutacji na poziomie molekularnym.

Bezpośrednia wizualizacja aberracji chromosomowych jest potężnym i ilościowym sposobem określania stopnia niestabilności genomu w określonym typie komórki. Skondensowane chromosomy z komórek w metafazie można wyizolować i sprawdzić za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Takie podejścia cytogenetyczne są stosowane w praktyce od kilkudziesięciu lat i mogą być wykorzystywane do wykazania pojawienia się translokacji lub określonych typów aberracji chromosomowych związanych z utratą czynności naprawy DNA. Protokół ten nadaje się do kilku potencjalnych rozszerzeń: chromosomy mogą być znakowane za pomocą sond do kariotypowania spektralnego (SKY) lub wielokolorowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) w celu identyfikacji translokacji^5,6. Techniki te umożliwiają również określenie częstotliwości translokacji chromosomowych i struktury złożonych translokacji chromosomowych, co dostarcza dodatkowych informacji wykraczających poza to, co jest możliwe w przypadku tego protokołu. Alternatywnie, można wygenerować sondy specyficzne dla sekwencji, które można wykorzystać do zbadania częstotliwości pękania DNA w wybranych miejscach genomu⁷.

W tym protokole opisujemy przygotowanie rozprzestrzeniania się chromosomów metafazowych z limfocytów B. Stosowana jest znakowana fluorescencyjnie sonda peptydowego kwasu nukleinowego (PNA) do powtórzeń telomerowych, która skutecznie oznacza telomery w rozprzestrzenianiu się chromosomów metafazowych Ten protokół ma kilka zalet. Limfocyty B można skłonić do wzrostu przy wysokim indeksie mitotycznym, dzięki czemu można konsekwentnie wytwarzać wysokiej jakości rozprzestrzenianie się. Limfocyty B od genetycznie zmodyfikowanych myszy są również znacznie mniej podatne na wtórne mutacje genetyczne, które mogą zakłócić analizę udziału określonych genów w integralności genomu. Podejście PNA-FISH można ukończyć w ciągu jednego dnia i pozwala to na dokładniejszą ocenę pęknięć chromosomów. Dzięki zastosowaniu tego podejścia, szczególnie w połączeniu ze specyficznym sprzętem opisanym w tym protokole, możliwe jest uzyskanie bardzo spójnych, wysokiej jakości spreadów i szybka analiza szybkości i rodzaju niestabilności genomu.

Protokół

Ta procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Rutgers, State University of New Jersey. Myszy leczono zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Naukowcy powinni skonsultować się z krajowymi i instytucjonalnymi organizacjami zajmującymi się zwierzętami w celu uzyskania ustalonych i zatwierdzonych wytycznych.

Zanim zaczniesz, przygotuj rozwiązania wymienione w Tabeli 1.

1. Izolacja i aktywacja komórek B

Uśpij mysz za pomocą CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Ustaw mysz tak, aby lewa strona ciała była podniesiona i spryskaj mysz 70% etanolem, aż futro będzie wilgotne. Rozciąć śledzionę i umieścić w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm z 2 ml buforu do przemywania. W kapturze z przepływem laminarnym delikatnie rozdrobnij śledzionę w naczyniu do hodowli tkankowej za pomocą płaskiego końca strzykawki o pojemności 5 ml.

1. Włożyć siatkę nylonową o grubości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml i przenieść próbkę śledziony w 2 ml buforu do płukania do siatki nylonowej. Delikatnie rozbić śledzionę w siatce za pomocą płaskiego końca strzykawki.
2. Przepłukać tylną część strzykawki i płytkę 35 mm 8 ml buforu do przemywania i przefiltrować przez siatkę nylonową o grubości 70 μm. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Odessać i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy ACK. Pipetować w górę i w dół, aby rozbić grudki i inkubować przez 5 minut. Dodać 10 ml buforu do przemywania i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, stukając w dno probówki, a następnie pipetując 1 ml buforu do przemywania wodą. Dodać 50 μl mikrokulek anty-CD43 MACS i inkubować na lodzie przez 30 minut. Dodać 10 ml buforu do płukania, delikatnie wymieszać i odwirować w stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 10 ml buforu do płukania, delikatnie wymieszać i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Skonfiguruj kolumnę Mini-MACS, umieszczając kolumnę na magnesie MACS. Umieść oznakowaną stożkową probówkę o pojemności 15 ml poniżej kolumny. Dodać 1 ml buforu do przemywania do kolumny i pozostawić do przepuszczenia do probówki o pojemności 15 ml.
6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do przemywania wodą. Załadować próbkę do kolumny po przejściu buforu myjącego.
7. Po przejściu próbki przez kolumnę dodać 1 ml buforu do płukania, aby przepłukać kolumnę. Dodać 7 ml buforu do przemywania bezpośrednio do pobranej próbki w probówce o pojemności 15 ml.
8. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przenieść wymaganą objętość komórek potrzebną do 5 000 000 komórek/studzienkę do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Uzupełnić pożywkę z komórek B LPS 1:500 i IL4 1:1,000.
9. Odessać supernatant i dodać odpowiednią objętość uzupełnionej pożywki z komórek B, potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 1 000 000 komórek/ml.
10. Umieścić komórki w 6-dołkowych płytkach z 5 ml komórek w stężeniu 1 000 000 komórek/ml i umieścić w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

2. Utrwalenie komórek B

1. Dodać 50 μl colcemidu do studzienki zawierającej 5 ml limfocytów B (dla końcowego stężenia 100 ng/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Ogrzać 75 mM roztwór KCl w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś limfocyty B do oznakowanej probówki o pojemności 15 ml. Przykryć etykietę taśmą i odwirować przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
2. Odessać supernatant pozostawiając 1 ml w probówce i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie. Dodaj 5 ml podgrzanego KCl kropla po kropli, stukając lub pulsując na wirze.
3. Dodać 10 ml KCl i wymieszać przez odwrócenie. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodaj 5 kropli świeżego utrwalacza i wymieszaj, odwracając. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant pozostawiając 1 ml w probówce i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie w górę i w dół.
4. Dodawać kropla po kropli 5 ml świeżego utrwalacza, stukając lub pulsując na wirze. Dodać dodatkowe 10 ml utrwalacza i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant pozostawiając 1 ml w probówce i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Dodać 14 ml świeżego utrwalacza i odwirować w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Powtórz krok 2.7 jeszcze dwa razy.
7. Dodać 14 ml świeżego utrwalacza. Uszczelnić nakrętki preparatem Parafilm i przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.

3. Przygotowanie rozprzestrzeniania się chromosomów metafazowych

1. Ustaw regulowaną komorę środowiskową na 22.9 °C i 52% wilgotności.
2. Odwirować utrwalone komórki B o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać utrwalacz, pozostawiając 70 μl w probówce i ponownie zawiesić przez pipetowanie.
3. Umieść oznaczone szkiełka w komorze wilgotnościowej pod kątem 35°. Upuść 35 μl zawieszonych limfocytów B na szkiełko podstawowe i upuść dwie szkiełka na próbkę. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w komorze wilgotnościowej na 30 minut, a następnie przechowuj je w pudełku na szkiełka w temperaturze 37 °C.

4. Telomery PNA RYBA

1. Przygotowanie sondy
   1. Wstępnie podgrzać dejonizowany formamid do temperatury 37 °C. Zmieszać 2 μl telomerowej sondy PNA z 7 μl dejonizowanego, wstępnie ogrzanego formamidu i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.
   2. Wstępnie ogrzać FISH master mix do temperatury 37 °C. Dodać 7 μl wstępnie podgrzanej mieszanki FISH master do mieszaniny z kroku 4.1.1 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-3 godziny.
   3. Denaturować mieszaninę sondy przez 8 minut w temperaturze 80 °C. Wstępnie wyżarzać sondę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
2. Wstępna obróbka preparatów chromosomowych
   1. Podgrzać szklany słoik do barwienia szkiełka zawierającego 50 ml 0,01 M HCl do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
   2. Umieść szkiełka w innym szklanym słoiku do barwienia szkiełek zawierającym 2x SSC na 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Dodaj 2 μl bulionu pepsyny do wstępnie podgrzanego szklanego słoika do barwienia szkiełek i wymieszaj, odwracając do nowa. Przenieść szkiełka do słoika do barwienia szkiełek i inkubować przez 90 sekund w temperaturze 37 °C.
   4. Umyj szkiełka 2x w innym szklanym słoiku do barwienia szkiełek zawierających 1x PBS przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej, wstrząsając. Następnie myj szkiełka przez 5 minut w 1x PBS/MgCl₂ w temperaturze pokojowej, wstrząsając.
   5. Przenieść szkiełka do szklanego słoika do barwienia szkiełek zawierających świeżo przygotowany 1% formaldehyd/1x PBS/MgCl₂ przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Myj szkiełka przez 5 minut w innym szklanym słoiku do barwienia zawierającym 1x PBS w temperaturze pokojowej, wstrząsając.
   7. Przygotuj serię odwadniania etanolu, mając oddzielne szklane słoiki do barwienia szkiełek zawierające 70%, 90% i 100% etanolu.
   8. Przenieś szkiełka do każdego słoika na 3 minuty, zaczynając od 70% etanolu, następnie 90% etanolu, a następnie 100% etanolu. Po zakończeniu umieść słoiki z etanolem w temperaturze -20 °C.
   9. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, stukając nadmiar etanolu w ręcznik papierowy i podpierając szkiełka pod kątem 35°. Po wyschnięciu zaznacz obszar o wymiarach 18 x 18 mm do hybrydyzacji na odwrocie szkiełek za pomocą pisaka diamentowego.
3. Denaturacja szkiełek dla FISH
   1. Nałożyć 120 μl 70% dejonizowanego formamidu/2X SSC na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm. Przyłóż szkiełko do szkiełka nakrywkowego. denaturować szkiełko w temperaturze 80 °C na płycie grzejnej przez 90 sekund.
   2. Szybko i ostrożnie zsuń szkiełko nakrywkowe i umieść szkiełko w lodowatym 70% etanolu na 3 minuty, a następnie 90% etanolu i 100% etanolu na 3 minuty. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
   3. Przygotuj wilgotną komorę, wykładając plastikowe pudełko szczelną pokrywką i mokrą bibułą. Papier powinien być wilgotny, ale nie nasycony wodą.
   4. W wilgotnej komorze nanieść wstępnie wyżarzoną mieszankę sondy z kroku 4.1.3 na zaznaczony obszar na szkiełku, przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 x 18 mm i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
4. Mycie po inkubacji
   1. Podgrzej 50% formamidu/2x SSC, 1x SSC i 4x SSC/0,1% Tween-20 w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
   2. Ostrożnie zdjąć szkiełka nakrywkowe i umyć je w podgrzanym 50% formamidzie/2x SSC 3xprzez 5 minut każdy w ciemności i potrząsając. Umyj szkiełka we wstępnie podgrzanym 1x SSC 3x przez 5 min każdy, wstrząsając. Na koniec umyj szkiełka we wstępnie podgrzanym 4x SSC/0,1% Tween-20 3x przez 5 minut każda.
   3. Szkiełka należy barwić przez 3 minuty w DAPI w światło, zabezpieczonym szklanym słoikiem do barwienia szkiełek.
   4. Myć szkiełka przez 5 minut w 2x SSC, wstrząsając. Nałożyć 35 μl podłoża montażowego Mowiol, przykryć szkiełkami nakrywkowymi o wymiarach 24 x 60 mm i przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.

5. Mikroskopowa analiza chromosomów

1. Analizuj szkiełka metafazowe za pomocą standardowego mikroskopu epi-fluorescencyjnego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy skorzystać z platformy obrazowania ze zautomatyzowanym stolikiem, takiej jak platforma MetaSystems Metafer. Dla każdego rozprzestrzeniania się metafazy zbierz jeden obraz dla fluorescencji DAPI, aby uwidocznić chromosomy, i jeden obraz dla sygnału fluorescencyjnego z sondy telomerowej. (Np. Cy3- inne fluory są dostępne i działają równie dobrze.)
2. Nałóż obrazy za pomocą programu do analizy obrazu i przeanalizuj.

Wyniki

Chromosomy w metafazie pochodzące z jednej komórki powinny tworzyć odrębny skupisko zawierający 40 chromosomów (w przypadku użycia komórek myszy) (Rysunek 1A). Każdy chromosom posiada centromer na jednym końcu, który jest widoczny jako jasnoniebieska sfera. W prawidłowych chromosomach dwa sygnały telomerowe są widoczne na końcach chromatyd oraz dwa sygnały przy każdym centromerze. Na preparacie obecne będą również jądra w interfazie. Będą one widoczne jako niebieskie sfery z czerwonymi sygnałami telomero...

Dyskusja

Podczas gdy aktywowane limfocyty B są szczególnie odpowiednie do przygotowania mitotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów, można również wykorzystać inne typy komórek. Limfocyty T mają wiele zalet limfocytów B, ponieważ mogą być oczyszczane ze śledziony lub węzłów chłonnych i mają wysoki indeks mitotyczny, gdy są stymulowane przez wzrost w pożywce zawierającej odpowiednie mitogeny⁸. Embrionalne komórki macierzyste (komórki ES) są również przystosowane do analizy chromosomów metafazy⁹. Jeśli nie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
50% siarczan dekstranu	Intergen	S4030
Dejonizowany formamid	Ambion	9342
Pepsyna (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μ g)	Sigma	I1020
PNA Sonda telomerowa	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) mikrokulki	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Suszarka cytogenetyczna	Thermotron