Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

22.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

21 sierpnia 2014

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Streszczenie

Ostatnie dziesięciolecia były świadkami eksplozji naukowego zainteresowania mechanizmami kontroli ekspresji genów na poziomie RNA. Ta gałąź biologii molekularnej została w znacznym stopniu wzmocniona przez odkrycie niekodujących RNA jako głównych graczy w regulacji posttranskrypcyjnej. Takiej rewolucyjnej perspektywie towarzyszył i uruchamiał rozwój potężnych technologii profilowania ekspresji krótkich RNA, zarówno na poziomie wysokoprzepustowym (identyfikacja całego genomu), jak i jako analiza pojedynczego kandydata (akumulacja określonych gatunków w stanie ustalonym). Chociaż obecnie dostępnych jest kilka najnowocześniejszych strategii dawkowania lub wizualizacji takich uciekających cząsteczek, test Northern Blot pozostaje odpowiednim podejściem w biologii molekularnej do natychmiastowej i dokładnej oceny ekspresji RNA. Stanowi ona pierwszy krok w kierunku zastosowania bardziej wyrafinowanych, kosztownych technologii i w wielu przypadkach pozostaje preferencyjną metodą łatwego uzyskania wglądu w biologię RNA. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół (Enhanced Northern Blot) do wykrywania słabo eksprymowanych mikroRNA (lub innych małych gatunków regulatorowego RNA) z całych zarodków Drosophila melanogaster, ręcznie wypreparowanych tkanek larwalnych/dorosłych lub komórek hodowanych in vitro. Wymagana jest bardzo ograniczona ilość RNA i można również rozważyć wykorzystanie materiału z komórek izolowanych metodą cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Biochemia RNA doświadczyła spektakularnego postępu w ostatnich latach1. Nasze zrozumienie potencjału RNA w kontroli ekspresji genów zostało poszerzone dzięki identyfikacji silnych niekodujących ryboregulatorów2, odkryciu nowych mechanizmów regulacyjnych opartych na RNA3,4 oraz głębszej charakterystyce już znanych zdarzeń potranskrypcyjnych5. Wszystkie te badania pozwoliły biologii RNA na radykalne pojawienie się na scenie, stając się głównym tematem badań w obecnym krajobrazie naukowym. W szczególności w ostatnich latach dostrzegamy wszechobecny wpływ "świata RNA" naneurobiologię molekularną6, jedną z najbardziej dynamicznych dziedzin badań we współczesnych naukach przyrodniczych. W ostatniej dekadzie ubiegłego stulecia ogólny scenariusz naukowy został zrewolucjonizowany przez odkrycie interferencji RNA7,8 i małych regulatorowych RNA9,10, ze szczególnym uwzględnieniem mikroRNA11, endogennie eksprymowanych małych niekodujących RNA, zaangażowanych w kontrolę prawie wszystkich funkcji komórkowych jako plejotropowe i kombinatoryczne regulatory ekspresji genów.

Prawie 10 lat po początkowym odkryciu miRNA u Caenorhabditis elegans przez laboratoria Ambrosa i Ruvkuna, ponownie zwrócono uwagę na tę dziedzinę, gdy zidentyfikowano dużą liczbę miRNA u Drosophila oraz w komórkach ludzkich12-15. Od tego czasu, dzięki wszechstronnym metodom transgenicznym, Drosophila melanogaster wyróżnia się jako cenny kontekst biologiczny dla zagłębiania się w biosyntezę i aktywność miRNA. MiRNA Drosophila ujawniły odrębne funkcje w specyficznych dla owadów lub ewolucyjnie konserwatywnych procesach, od starzenia się po metabolizm, szlaki sygnałowe, zachowanie i, oczywiście, neurogenezę. Idąc w tym kierunku, niedawno odkryliśmy nowe ogniwo16 w intrygującej korelacji zachodzącej między głównym genem gcm/glide a szlakiem RNA. Czynnik transkrypcyjny muchy Gcm / Glide17-19 stanowi unikalny przykład determinantu losu komórki, który dyktuje wybór losu glejowego i neuronalnego u multipotencjalnych prekursorów neuronalnych much20. Dwudziestoletnie badania na ten temat wyraźnie podkreśliły występowanie wielu i nakładających się na siebie danych wejściowych regulacji ekspresji genów, zbiegających się w gcm / glide21-28 w celu ustalenia poziomów progowych wymaganych do zrównoważenia delikatnego stosunku między neuronalnymi i glejowymi odpowiednikami podczas rozwoju neuronalnego.

Odkryliśmy, że regulacja za pomocą celowania Dmel-miR279 stanowi kolejny poziom kontrolny, przyczyniając się do potranskrypcyjnego dostrojenia ekspresji gcm/glide 16. Na całym świecie te linie badawcze wymagały konkretnych ulepszeń metodologicznych: na przestrzeni lat kilka technologii pierwotnie opracowanych do analizy tradycyjnych RNA zostało przekształconych w celu ilościowego oznaczania małych niekodujących RNA, takich jak testy ochrony RNAza, macierze cDNA29-31, metody PCR w czasie rzeczywistym32-35 i sekwencjonowanie36,37. Z drugiej strony, rekalibracja podejść technicznych przyczyniła się do ciągłego postępu w tej dziedzinie.

Test Northern Blot (NB, lub test na plamy w żelu RNA) stanowi reprezentatywny przykład: jest on w dużej mierze wykorzystywany do profilowania akumulacji RNA, ponieważ zapewnia zarówno ilościowe określanie poziomu ekspresji, jak i określanie wielkości. Jednak wewnętrzna słaba czułość metody jest ograniczona, gdy ma być stosowana do precyzyjnych dostrajaczy o niskiej ekspresji genów, takich jak krótkie RNA. Niekorzystną konsekwencją jest wymóg dużych ilości całkowitego RNA, co utrudnia jego zastosowanie do określonych próbek biologicznych. Z tych powodów opracowano specyficzne warianty NB do wykrywania małych RNA38-40: skorzystaliśmy z ulepszonej procedury NB41 (ENB, Enhanced Northern Blot), wyjaśniając jednocześnie wspomnianą wyżej zależność między Dmel-miR279 a gcm/glide.

Ta metoda opiera się na chemicznym etapie sieciowania opartym na aktywności pochodnej karbodimidu [1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu, EDC] w celu wiązania kwasu nukleinowego na stałych nośnikach. Karbodimid jest wszechstronnym środkiem sieciującym, o którym wiadomo, że katalizuje tworzenie wiązań amidowych między aktywowanymi grupami karboksylowymi lub fosforanowymi a grupami aminowymi42. Właściwość tę można wykorzystać do kowalencyjnego łączenia małych RNA za pośrednictwem ich mono-fosforylowanej grupy 5′-hydroksylowej z grupami aminowymi na powierzchni błon nylonowych. Uzyskana konfiguracja przyłączania zwiększa dostępność unieruchomionego kwasu nukleinowego, a co za tym idzie, wydajność hybrydyzacji sonda-cel, co skutkuje niezwykłym ulepszeniem wykrywalności43.

Technika nabiera szczególnego znaczenia w badaniach molekularnych Drosophila, dzięki którym pojawia się występowanie nowych i charakterystycznych klas małych niekodujących RNA44. Wśród nich rasiRNA45,46 stanowią specyficzny podtyp RNA oddziałujących z piwi (piRNAs47), biorący udział w wyciszaniu genów specyficznych dla sekwencji. Szczegóły operacyjne tej metody są w pełni opisane i zwizualizowane poniżej, w odniesieniu do analizy mikroRNA Dmel-miR279 i Dmel-miR286 oraz, po raz pierwszy, jednego rasiRNA, rasi4. Posunęliśmy się do skrajności w tej metodzie, która pozwoliła nam ujawnić słabo wyrażone cele z minimalnych ilości RNA (mniej niż 1 μg).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek

  1. Odłączyć półprzylegające 2 komórki Schneidera (średnio 1-5 x 106 komórek) przez pipetowanie i zebrać je przez odwirowanie (100 x g przez 1 min). W przypadku komórek adherentnych hodowanych in vitro, trypsynizuj je w standardowych warunkach lub bezpośrednio zbieraj z płytek do odpowiedniej ilości odczynnika do ekstrakcji RNA, za pomocą skrobaka do komórek.
  2. W celu pobrania zarodków hoduj szczepy Drosophila w klatkach na muchy i pozwól zarodkom gromadzić się na płytkach do składania jaj. Zetrzeć zarodki pędzlem w wodzie destylowanej (dH2O), wyrzucić zanieczyszczenia przez filtrowanie sitowe, spłukać i odzyskać zarodki w fiolce48.
  3. Jako alternatywną technikę należy ręcznie wypreparować tkanki/narządy. Wyizoluj jądra (preferencyjny system do analizy piRNA) z odwłoka Drosophila w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) pod mikroskopem stereoskopowym (20-krotne powiększenie), używając igieł do preparowania lub kleszczy, jak pokazano w Sullivan i wsp. 49.
  4. Tłuczek homogenizuje próbki po uzależnieniu 0,5 objętości odczynnika do ekstrakcji RNA.

2. Ekstrakcja/analiza RNA

  1. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, wykonaj izolację RNA za pomocą dostępnych w handlu odczynników. ostrożność! Środki do ekstrakcji RNA są zwykle toksyczne i. Alternatywnie zastosuj protokół oparty na proteinazie K do izolacji RNA50 w następujący sposób:
    1. Rozcieńczyć próbki do 400 μl Stop Mix i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Odzyskiwanie składników hydrorozpuszczalnych przez standardowe ekstrakcje fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego i chloroformu oraz przez wytrącanie/mycie etanolem (EtOH). Próbki należy wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić w podwójnie destylowanym (dd)H2O, poddanym działaniu ditylowęglanianu (DEPC).
  2. Oceń stężenie RNA za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego UV. Upewnij się również, że czystość RNA jest wysoka, bliska 2,0, w oparciu o odczyt A260/A280.
  3. Sprawdź przygotowanie RNA na denaturującym żelu agarozowym w następujący sposób:
    1. W czystej zlewce rozpuścić 1,2 g agarozy w 82 ml DEPC-ddH2O, ciągle mieszając. Gotować do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Pozostawić roztwór żelu do ostygnięcia; gdy temperatura osiągnie 60 °C, dodać 10 ml buforu 10X 4-morfolinopropanosulfonowego (MOPS) do 1X końcowego stężenia (FC) i 8 ml 37% formaldehydu do 3% FC. ostrożność! Formaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym.
    3. Wlej żel do poziomej celi elektroforetycznej. Pozostaw żel do zestalenia się pod kapturem przez co najmniej 1 godzinę. Po zestaleniu zanurz żel w MOPS 1X.
    4. Podwielokrotność 2 μg próbki RNA i 1 μg próbki Ladder (użyj markera RNA, gdy wymagana jest dokładna ocena). Dodaj 3 objętości barwnika ładującego agarozę (ALD) do RNA i do drabiny. Ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 5 minut i natychmiast schłodzić na lodzie. UWAGA! Zawartość ALD (bromek etydyny i formamid, patrz Materiały) jest odpowiednio mutagenna i.
    5. Załaduj próbki i uruchom żel pod napięciem 50 V przez około 1 godzinę z okazjonalnym recyklingiem buforowym. Sprawdź wzór frakcjonowania RNA za pomocą wizualizacji UV lub obrazowania żelowego. Rozpoznaj dyskretne prążki odpowiadające 28S i 18S rRNA oraz tRNA (patrz rysunek 1).
  4. Przejdź do testu północnego lub przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.

3. Preparat żelu akrylowego denaturującego

  1. Do tego etapu frakcjonowania należy użyć małego pionowego aparatu elektroforetycznego (rozmiar płytki około 8 cm x 9 cm, grubość grzebienia 0,75 mm).
  2. Zmontuj czyste okulary razem w ramie odlewniczej.
  3. Przygotować 10 ml 10% roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu (19:1) w MOPS 1X, 7 M moczniku. Bezpośrednio przed nalewaniem dodać 100 μl 10% nadsiarczanu amonu i 10 μl TEMED i szybko wymieszać roztwór. ostrożność! Akrylamid jest neurotoksyczny i rakotwórczy.
  4. Wlej żel między szklane płytki i ostrożnie włóż grzebień studzienki, aby uniknąć pęcherzyków. Pozwól żelowi polimeryzować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 45 minut przed użyciem. Alternatywnie, przechowuj żel O/N, zawinięty w nasączone wodą bibuły filtracyjne i szczelnie zamknięty w folii saran.

4. Przygotowanie próbki

  1. Podwielokrotność 0,5-20 μg całkowitego RNA dla każdej próbki. Jeśli objętość przekracza 3–4 μl, wysuszyć próbkę w suszarce próżniowej.
  2. W celu określenia wielkości należy przeprowadzić podwielokrotność (20-30 cps) znakowanej radioizotopowo drabinki niskiego zasięgu równolegle do próbek, jako marker (patrz sekcja 4.3 i 4.4 w celu przygotowania). Traktuje się go równolegle do próbek, jak opisano w kroku 4.5.
  3. Drabina: uruchomić reakcję fosforanową do przodu przy użyciu 0,1 μg drabiny o długości 10 pz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut i zatrzymać reakcję przez dodanie kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 20 mM FC.
  4. Oczyścić przez wytrącanie/płukanie EtOH, wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić w ddH2O (około 100 μl). ostrożność! Rozdział 32P jest źródłem promieniotwórczym.
  5. Do każdej próbki dodać równą objętość niebieskiego barwnika akrylowego (ABD). Denaturację należy przeprowadzić przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 5 minut i schłodzić na lodzie do momentu załadunku. ostrożność! Formamid (zawartość w ABD) jest.

5. Frakcjonowanie elektroforetyczne

  1. Zdejmij szklane płytki ze wspornika odlewu i prawidłowo zamontuj je w komorze elektroforetycznej. Napełnij zarówno komorę wewnętrzną, jak i zewnętrzną wystarczającą ilością buforu roboczego (RB).
  2. Delikatnie wyjmij grzebień i wstępnie uruchom żel pod napięciem 200 V przez 10 minut. Przed załadowaniem próbek zmyj osady mocznika ze studzienek, wstrzykując trochę RB przez strzykawkę.
  3. Użyj płaskich końcówek, aby ostrożnie rozwarstwić próbki z kroku 4.5 na dnie każdej studzienki. Sprawdź połączenia anody i katody, aby uniknąć pracy odwróconej. Po wprowadzeniu próbek do żelu pod napięciem 100 V przez 5 minut, zwiększ napięcie do 200 V.
  4. W przypadku frakcjonowania o długości około 7 cm wystarczy 45-minutowy bieg. Unikaj błękitu bromofenolowego (pigmentu śledzącego w ABD), aby przelać żel.
  5. Wizualizacja na żelu frakcjonowanych długich RNA za pomocą barwienia bromkiem etydyny (EtBr) jako opcjonalny krok:
    1. Odciąć 2 cm od wierzchu żelu i krótko opłukać plasterek w ddH2O.
    2. Inkubować plasterek żelu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, delikatnie zanurzając go w RB, EtBr 0,5 μg/ml FC.
    3. Odbarwić żel przez 15 minut w RB, uwidocznić długie rRNA za pomocą promieniowania UV lub obrazowania żelowego. Sprawdź obciążenie i jakość RNA (patrz Rysunek 1, Panel 7). ostrożność! Bromek etydyny jest substancją mutagenną.
  6. W międzyczasie przystąp do osuszania dolnej części żelu zawierającej małe gatunki RNA.

6. Żucie

  1. Wytnij 6 kawałków bibuły, aby pasowały do obszaru bibuły i równoważnego kawałka nienaładowanej nylonowej membrany. Zwilż arkusze papieru, membranę i 2 bibułki w RB. Upewnij się, że całkowicie nasącz podkładki, wielokrotnie ściskając je w RB.
  2. Wyjmij żel z aparatu i otwórz okulary za pomocą szpatułki. Użyj czystego noża, aby usunąć studzienki. Umieść arkusz mokrego papieru Whatman na żelu i delikatnie go podnieś.
  3. Umieść nylonową membranę na wolnej powierzchni żelu. Zaznacz róg, aby ustawić filtr zgodnie z obciążeniem próbki. Uzupełnij "kanapkę" (3 kawałki papieru z każdej strony). Zwiń plastikowy pręt po powierzchni plamy, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.
  4. Umieść blot między dwiema podkładkami do bibuły, a następnie w kasecie bibułki. Zamontuj kasetę w module bibuły, napełnij komorę płynem stałym i sprawdź prawidłową orientację (nylonowa membrana musi pozostać między żelem a dodatnim końcem).
  5. Przelew pod napięciem 20 V przez 20 minut. Uwaga: aby zapewnić jednorodne warunki, po 10 minutach otwórz moduł bibułki i obróć kanapkę o 180° przed zakończeniem przenoszenia.

7. Sieciowanie membranowe

  1. Przygotuj 6 ml świeżego roztworu sieciującego (XLS). Nasącz kawałek bibuły o wymiarach 10 cm x 10 cm (większy niż membrana nylonowa) za pomocą XLS. ostrożność! HCl (składnik XLS) jest silnie.
  2. Zdemontuj blot i umieść membranę na mokrej bibule filtracyjnej 3MM. Uwaga: RNA nie może mieć bezpośredniego kontaktu z nasyconym papierem. Umieść filtr i papier między dwiema szklanymi płytkami i zawiń w saran-wrap.
  3. Ogrzewać membranę w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, a następnie przepłukać ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przystąpić do hybrydyzacji.

8. Prehybrydyzacja membranowa

  1. Jeśli obciążenie RNA zostało sprawdzone (opcjonalny krok 5.5), należy bezpośrednio przejść do hybrydyzacji. Lub inaczej, odetnij 1 cm od górnej części nylonowego filtra, aby uniknąć hybrydyzacji krzyżowej sondy do frakcjonowanych długich RNA.
  2. Rozgrzać 10 ml roztworu do hybrydyzacji (HS) w temperaturze 37 °C. Denaturować 1 mg nasienia łososia w temperaturze 95 °C przez 5 minut, ostudzić na lodzie i dodać do HS.
  3. Inkubować filtr w HS w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, obracając się w piecu do hybrydyzacji. Sprawdź, czy strona RNA filtra jest skierowana w stronę HS.

9. Synteza sondy

  1. Ustawić reakcję przewodzenia fosforanu na 10 pmol specyficznego oligonukleotydu antysensownego, jak opisano w 4.3.
  2. Dodać 5 objętości buforu Tris-EDTA-NaCl (TEN) do reakcji i oczyścić znakowany starter z nieinkorporowanych nukleotydów za pomocą chromatografii wykluczającej żel na kolumnach G-25 Sephadex (lub również przez wytrącanie EtOH). Aktywność sondy można ocenić za pomocą licznika scyntylacji cieczy.

10. Hybrydyzacja membranowa

  1. Zastąpić wyczerpaną HS świeżą 10 ml podwielokrotnością (przygotowaną i uzupełnioną w sposób opisany powyżej). Podgrzej sondę w temperaturze 95 °C przez 10 minut, ostudź na lodzie i dodaj do nowego HS. Inkubować filtr w temperaturze 37 °C ON.

11. Mycie membran

  1. Odzyskać roztwór hybrydyzacyjny i przechowywać go w temperaturze -20 °C w pojemniku chroniącym przed promieniochronnością.
  2. Wypłucz filtr w buforze myjącym (WB) i dokładnie myj go przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Użyj detektora Geigera Muellera do sprawdzenia resztkowej radioaktywności w rogach filtra. Gdy emisja tła wynosi około 5 cps, przejdź do ekspozycji membranowej.

12. Wykrywanie sygnału

  1. Naświetl filtr na kliszach autoradiograficznych lub na ekranie obrazowania molekularnego WŁĄCZONY. Ujawniaj sygnały poprzez obróbkę fotograficzną lub konwersję cyfrową.
  2. Analizuj intensywność pasma za pomocą dedykowanego oprogramowania do kwantyfikacji (ImageJ lub Optiquant).

13. Zdejmowanie membrany

  1. Aby usunąć sygnały pierwotne, zanurzyć membranę w 500 ml wrzącego roztworu do strippingu, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Przejść do nowej (wstępnej) hybrydyzacji lub przechowywać filtr w temperaturze -20 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Postępując zgodnie z ogólną procedurą opisaną w tekście i przedstawioną schematycznie na Rysunku 1, oceniliśmy ekspresję małych RNA z kompleksowych próbek RNA różnego pochodzenia. W doświadczeniu przedstawionym na Rysunku 1 RNA wyizolowano z komórek Schneidera muchy Drosophila metodą ekstrakcji Proteinazą K, sprawdzono jego integralność (opcjonalny etap: frakcjonowanie na denaturującym żelu agarozowym) i naniesiono w dwóch powtórzeniach. Jedną połowę żelu przeniesiono na membran...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż nasze uznanie dla wyrafinowanego splotu, za pomocą którego RNA reguluje neurogenezę, stale rośnie, mechanistyczne implikacje obwodów opartych na RNA wpływających na biologię neuronalnych komórek macierzystych, różnicowanie neuronów/integrację funkcjonalną, rozwój patologii nerwowych i nowotwory pozostają niezbadane. Utrzymywanie takich sieci poprzez królestwa sprawia, że potencjał systemów genetycznych, takich jak Drosophila melanogaster , odgrywa zasadniczą rolę w odkrywaniu niezbadanych szlaków komórko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, Hôpital de Strasbourg, Association pour la Recherche sur le Cancer, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche i Région Alsace.

Pietro Laneve został wsparty przez Fondation pour la Recherche Médicale. Obecnie jest stypendystą Istituto Italiano Tecnologia (IIT). Koszty publikacji są wspierane przez sieć Neurex (TriNeuron – Program Interreg IV Górny Ren)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
OSTATECZNY SKŁAD/NAZWAFIRMOWY(Stock)UWAGI
WYMAGANIA OGÓLNE
Wirówka, 5418Eppendorf5418 000.017
Odkażanie, RNase AwaySigma-Aldrich83931Nakładać na szkło/plastik, wytrzeć i spłukać
inhibitor RNazy, DEPCSigma-AldrichD5758Niebezpieczny //// 1609-47-8
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Mikroskop stereoskopowy, M60Leica 
1X Bufor
137 mM NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
2,7 mM KClSigma-AldrichP95417447-40-7 
10 mM Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1,8 mM KH2PO4Sigma-AldrichP97917778-77-0 
EKSTRAKCJA/ANALIZA RNA
Spektrofotometr UV-VISThermo ScientificNanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+Biorad170-8265
Elektroforeza pozioma, Mini-Sub Cell GTBioRad170-4487EDU
Odczynnik do ekstrakcji RNA, TRIzol ReagentLife Technologies15596026Niebezpieczne
PCA (25:24:1), 1:1 do ekstrakcjiSigma-Aldrich77617136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 do ekstrakcjiSigma-AldrichC243267-66-3   
EtOH, 2,5 obj. do strącania, 70% do myciaSigma-Aldrich5984464-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA LadderThermo ScientificSM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5,5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x RSB Roztwór
2% dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich71736Nigdy nie schładzaj SDS, aby uniknąć opadów //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinaza KRoche Applied Science0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X Standardowy bufor retikulocytów (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7,4Sigma-AldrichT59411185-53-1   
100 mM NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
30 mM MgCl2Sigma-AldrichM82667786-30-3
agarozowy denaturujący
1,2% AgarozaSigma-AldrichA9539Pozwól żelowi zestalać się przez co najmniej 1 godzinę //// 9012-36-2
10X MOPS Bufor
0,2 M MOPS sól sodowa, pH 7Sigma-AldrichM9381Nie należy mylić soli sodowej MOPS z solą sodową MOPS MOPS //// 71119-22-7
obciążający agarozą
1x MOPS Bufor
3% formaldehyduSigma-AldrichF8775Niebezpieczne //// 50-00-0
50% formamidSigma-Aldrich47670Niebezpieczne //// 75-12-7
Bromek etydyny (EtBr) 30 μ g/mlSigma-AldrichE1510Niebezpieczne //// 1239-45-8
Błękit bromofenolowy Sigma-AldrichB0126115-39-9 
MAŁE FRAKCJONOWANIE RNA
Płaskie końcówki do ładowania żeluLife TechnologiesLC1002
Koncentrator Savant SpeedVacThermo Scientific DNA120
Elektroforeza pionowa, Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad165-8000
akrylowy do denaturacji
10% akrylamid/bis-akryloamid (19:1)Sigma-AldrichA3449Niebezpieczne. Pozwól żelowi polimeryzować przez 45 minut przed użyciem
1x Bufor TBE (lub 1x Bufor MOPS)
7 M mocznikSigma-AldrichU650457-13-6
0,1% nadsiarczan amonuSigma-Aldrich2155897727-54-0 
0,1% TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
Linijka genowa Drabinka DNA ultra niskiego zasięgu (krok 10 pz)Thermo ScientificSM1211Etykieta 0,1 μ g, zgodnie z opisem w reakcji "znakowania sondą"
Akryloamid Blue Dye 
50% formamidSigma-Aldrich47670Niebezpieczny //// 75-12-7
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126115-39-9 
Bufor roboczy (RB)
1x Bufor MOPS 
Alternatywa RB: 1x Bufor TBE
1x Bufor
5X TBE
445 mM Tris-baseSigma-AldrichT150377-86-1 
445 mM kwas borowySigma-AldrichB790110043-35-3
20 mM EDTASigma-AldrichEDS60-00-4   
Żelowy roztwór
Bromek etydyny 0,5 μ g/mlSigma-AldrichE1510Niebezpieczne //// 1239-45-8
1x RBBejca na 15 min z EtBr, odbarwianie przez 15 min bez EtBr
BLOTTING
3MM Papier WhatmanSigma-AldrichZ270849
Neutralna membrana nylonowa, Hybond NXGE Healthcare Nauki przyrodniczeRPN203TŚwiatłoczuły
SIECIOWANIE
Roztwór sieciujący (XLS)
1% 1-metyloimidazol (v/v)Sigma-Aldrich336092Zawsze przygotuj świeżą porcję XLS //// 616-47-7
12,5 mM HClSigma-AldrichH1758Niebezpieczne //// 7647-01-0
3,1% EDC (w/v)Sigma-Aldrich345025952-53-8   
(PRE)-HYBRYDYZACJA
Licznik scyntylacji cieczy BeckmannLS 6500
Nasienie łososia z nożycami, 0,1 mg/ml Life TechnologiesAM9680
rasi4 sonda antysensowna5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA
sonda5'-CAACACACGGGTGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
sonda5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
sonda antysensowna5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Zestaw
do oczyszczania, ilustracja kolumn MicroSpin G-25GE Healthcare Life Science27-5325-01
(Pre)-Roztwór hybrydyzacyjny (HS)
0,5% SDSSigma-Aldrich71736151-21-3 
5x Roztwór
20X SSPE
3,6 M NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
0,2 M fosforan soduSigma-Aldrich3424837601-54-9   
20 mM EDTA (pH 8,0)Sigma-AldrichEDS  60-00-4   
50x Roztwór
1% Ficoll 400 (w/v)Sigma-AldrichF263726873-85-8
1% PoliwinylopirolidonSigma-AldrichPVP409003-39-8
1% BSASigma-AldrichA79069048-46-8   
1X Bufor
10 mM Tris-Cl (pH 8,0)Sigma-AldrichT150377-86-1 
100 mM NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
1 mM EDTA (pH 8,0)Sigma-AldrichEDS60-00-4   
Etykietowanie sondy
0,4 i mu; Oligonukleotyd
1,5 μ l Ci/μ l [γ-32P] ATPPerkin ElmerNEG002ANiebezpieczny //// 51963-61-2
1x bufor kinazy polinukleotydowej T4BiolabsB0201
Kinaza polinukleotydowa T4 0,5 jednostki /μ lBiolabsM0201EC 2.7.1.78
MYCIE
Detektory Geigera MuelleraCanberra IndustriesMCB2/CPS –
Bufor myjący (WB), 2x SSPE
Rygorystyczne
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
WYKRYWANIE SYGNAŁU
PharosFX Plus SystemBiorad170-9460
Obraz JSwobodnie dostępny
Ilość JednaBiorad
BioMax XARSigma-AldrichF5888Światłoczuły
wywoływacz do filmów rentgenowskichSigma-AldrichP7042
Utrwalacz do filmów rentgenowskichSigma-AldrichP7167
USUWANIE IZOLACJI
Roztwór
10 mM Tris-HCl pH 8,8Sigma-AldrichT150377-86-1 
5 mM EDTASigma-AldrichEDS60-00-4   
0,1% SDSSigma-Aldrich71736Dodaj SDS po ugotowaniu, aby uniknąć pienienia //// 151-21-3
KATALOG PBSŻel Barwnik Żel TBEbarwiący antysensowna antysensowna DenhardtaDenhardtaTENMEM77021myjące Filmy rentgenowskie , do usuwania

Bibliografia

  1. The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43(2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175(2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98(2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 2nd, Academic Press, Inc. (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60(2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641(2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Detekcja RNAelektroforeza w żelu akrylamidowymekstrakcja RNAhybrydyzacja sonddetekcja autoradiograficznaizolacja RNAtransfer z żelu
Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.