Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51829

⸱

21 września 2014

 ,  , 
1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

W tym artykule

Podsumowanie

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Streszczenie

Badania ekspresji genów na poziomie RNA i białka od dawna wykorzystywane do badania procesów biologicznych leżących u podstaw choroby. Ostatnio genomika i proteomika zostały uzupełnione o kompleksową analizę ilościową puli metabolitów obecnych w systemach biologicznych. Strategia ta, zwana metabolomiką, ma na celu zapewnienie globalnej charakterystyki małocząsteczkowego dopełniacza biorącego udział w metabolizmie. Podczas gdy genom i proteom definiują zadania, które mogą wykonywać komórki, metabolom jest częścią właściwego fenotypu. Wśród metod stosowanych obecnie w metabolomice szczególnie interesujące są techniki spektroskopowe, ponieważ pozwalają na jednoczesną analizę dużej liczby metabolitów bez uprzedniej selekcji dla określonych szlaków biochemicznych, umożliwiając w ten sposób szerokie, bezstronne podejście. W tym miejscu przedstawiono zoptymalizowany protokół eksperymentalny do analizy metabolomicznej za pomocą spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości, która jest metodą z wyboru do efektywnej kwantyfikacji metabolitów tkankowych. Istotnymi zaletami tej metody są: (i) stosowanie surowych ekstraktów, bez konieczności oczyszczania próbki i/lub oddzielania metabolitów; (ii) wewnętrznie ilościowy charakter NMR, pozwalający na ilościowe określenie wszystkich metabolitów reprezentowanych przez widmo NMR z tylko jednym związkiem odniesienia; oraz (iii) nieniszczący charakter NMR umożliwiający wielokrotne wykorzystanie tej samej próbki do wielu pomiarów. Dynamiczny zakres stężeń metabolitów, który można pokryć, jest znaczny ze względu na liniową odpowiedź sygnałów NMR, chociaż metabolity występujące w skrajnie niskich stężeniach mogą być trudne do wykrycia. W przypadku najmniej obfitych związków metoda spektrometrii mas o wysokiej czułości może być korzystna, chociaż technika ta wymaga bardziej skomplikowanych procedur przygotowania próbki i kwantyfikacji niż spektroskopia NMR. Przedstawiamy tutaj protokół NMR dostosowany do analizy mózgu szczura; Jednak ten sam protokół można zastosować do innych tkanek z niewielkimi modyfikacjami.

Wprowadzenie

Modele mysie były szeroko wykorzystywane w badaniach nad mózgiem1. Korelacje genotyp-fenotyp badano w mózgach myszy i szczurów, badając ekspresję genów na poziomie RNA i/lub białka z jednej strony, a morfologicznymi, funkcjonalnymi, elektrofizjologicznymi i/lub behawioralnymi fenotypami z drugiejstrony 2-6. Jednak, aby w pełni zrozumieć mechanizmy łączące fenotyp z genotypem, konieczne jest zbadanie zdarzeń molekularnych zachodzących po ekspresji białek, tj. metabolizm substratów biochemicznych, na które działają enzymy7. Wymóg ten doprowadził w ciągu ostatnich 10 do 15 lat do renesansu badań metabolicznych w wielu gałęziach biologii8,9. Podczas gdy klasyczne badania metaboliczne często koncentrowały się na szczegółach określonych szlaków, nowe podejście metabolomiczne jest ukierunkowane na kompleksowe badanie globalnego profilu metabolicznego badanej tkanki. Jedną z konsekwencji tej koncepcji jest oczywiste zapotrzebowanie na narzędzia analityczne, które minimalizują stronniczość w kierunku określonych szlaków metabolicznych i/lub klas związków. Jednak klasyczny test biochemiczny opiera się na określonej reakcji chemicznej określonego analitu, którą należy określić przed wykonaniem testu. Natomiast techniki spektroskopowe, takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i spektrometria mas (MS) (i), opierają się na szczególnych właściwościach molekularnych (fizycznych) związków biochemicznych, z których każdy powoduje powstanie jednego lub kilku odrębnych sygnałów w widmie wykrytych w trakcie jednego eksperymentu; oraz (ii) wykrywać dużą liczbę różnych związków w jednym eksperymencie.

Tak więc, każde widmo zawiera połączone informacje o całym zakresie metabolitów. Z tego powodu metody spektroskopowe są odpowiednimi narzędziami metabolomiki, ponieważ nie ma potrzeby dokonywania wcześniejszej selekcji w odniesieniu do charakteru mierzonego analitu8. W związku z tym techniki te w naturalny sposób nadają się do badań eksploracyjnych, ponieważ znacznie ułatwiają wykrywanie nieoczekiwanych zmian metabolicznych.

Chociaż spektroskopia NMR i MS mogą być używane zamiennie do analizy wielu metabolitów, każda metoda ma określone zalety i wady, które zostały ostatnio omówione10. Krótko mówiąc, spektroskopia NMR może być zwykle wykonywana z surowych ekstraktów i nie wymaga chromatograficznego rozdzielania związków próbki przed analizą. Z kolei MS pracuje z separacją metodą chromatografii gazowej lub cieczowej (GC lub LC), z wyjątkiem najnowszych osiągnięć, takich jak obrazowanie za pomocą spektrometrii mas. W kilku szczególnych przypadkach, takich jak analiza cukrów, separacja LC może stać się koniecznością również w spektroskopii NMR, ponieważ linie rezonansowe różnych cukrów znacznie się pokrywają w widmach protonów (1H) NMR. Niemniej jednak spektroskopia 1H NMR bez separacji chromatograficznej pozostaje najpopularniejszą, niemal powszechnie stosowaną metabolomiczną metodą NMR. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie próbki jest bardziej czasochłonne i złożone w przypadku stwardnienia rozsianego niż w przypadku spektroskopii NMR. Poważne problemy wynikające z efektów matrycowych występują znacznie rzadziej w spektroskopii NMR niż w stwardnieniu rozsianym, gdzie mogą prowadzić do znacznego osłabienia sygnałów. Oznaczanie ilościowe metabolitów można osiągnąć za pomocą dowolnej metody. Jednak w przypadku stwardnienia rozsianego potrzebnych jest wiele związków wzorcowych ze względu na różnice w efektach matrycy i skuteczności jonizacji między metabolitami. Natomiast do analizy spektroskopowej NMR potrzebny jest tylko jeden wzorzec na próbkę, ponieważ w odpowiednich warunkach pomiarowych ta ostatnia metoda jest z natury ilościowa dzięki ściśle liniowej odpowiedzi NMR obserwowanych jąder. Główną wadą NMR jest jego stosunkowo niska czułość. MS, w szczególności LC-MS, jest bardziej czuły niż NMR o kilka rzędów wielkości; z tego powodu MS ma być preferowany w stosunku do NMR do analizy związków występujących w bardzo niskich stężeniach. Z drugiej strony, nieniszczący charakter eksperymentu NMR jest wyraźną przewagą nad SM; w ten sposób NMR może być wykonywany wielokrotnie na tej samej próbce, np. dla różnych jąder aktywnych NMR, takich jak 1H, fosfor-31 (31P), węgiel-13 (13C), fluor-19 (19F) itp., ponieważ żaden materiał nie jest zużywany przez NMR w przeciwieństwie do pomiarów MS.

Zarówno NMR, jak i MS mogą być stosowane w różnych trybach, z których każdy jest optymalny do wykrywania związków o szczególnych właściwościach chemicznych. Na przykład 31P NMR często lepiej nadaje się niż 1H NMR do analizy umiarkowanie skoncentrowanych związków fosforylowanych, chociaż prawie wszystkie ufosforylowane metabolity zawierają również protony. Jednak ich sygnały 1H NMR mogą być przesłonięte przez sygnały 1H NMR z innych, niefosforylowanych związków, przy czym te ostatnie oczywiście nie powodują sygnałów tła w widmach 31P NMR. W sytuacji analogowej analiza 19F NMR ma być preferowana dla związków fluorowanych, np. leków fluorowanych (brak sygnałów tła od metabolitów endogennych), podczas gdy szczególny przypadek 13C NMR jest interesujący prawie wyłącznie, gdy trzeba śledzić los egzogennych prekursorów metabolicznych znakowanych 13C, ze względu na wyjątkowo niską naturalną liczebność izotopu 13C (ok. 1%). Wiele spektrometrów mas działa w trybie jonów ujemnych lub jonów dodatnich. Dlatego ważne jest, aby przed analizą wiedzieć, czy obserwowane jony są naładowane ujemnie czy dodatnio. Skupiamy się tutaj na protokole analizy metabolomu tkanki mózgowej za pomocą spektroskopii 1H i 31P NMR, ponieważ metoda ta pozwala uzyskać dużą liczbę ważnych stężeń metabolitów przy niskich kosztach pod względem (i) czasu potrzebnego na przygotowanie próbki i (ii) wysiłku wymaganego do ilościowego określenia metabolitów. Wszystkie eksperymenty mogą być wykonywane przy użyciu sprzętu standardowego laboratorium chemii mokrej oraz urządzenia do spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości. Dalsze wymagania zostały opisane w sekcji Protokół poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: OŚWIADCZENIE O ETYCE ZWIERZĄT
Badania na szczurach były zgodne z wytycznymi obowiązującymi we Francji i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki (#40.04, University of Aix-Marseille Medical School, Marsylia, Francja).

1. Zbieranie i zamrażanie mózgu szczura

  1. Przygotuj wymagane elementy: ciekły azot (N2liq.) w Dewarze, który jest wystarczająco duży, aby utrzymać zacisk zamrażający (co najmniej 2-3 l objętości); środek znieczulający (np. izofluran lub ketamina/ksylazyna); komora anestezjologiczna; sterylne narzędzia do preparacji: nożyczki chirurgiczne, skalpel, kleszcze; chusteczki higieniczne i butelka z alkoholem czyszczącym (etanolem); igły (25 G); strzykawki 1 ml i 10 ml. Blachy aluminiowe (ok. 10 x 10 cm) oznaczyć taśmą klejącą. Użyj arkuszy do owinięcia pojedynczych, zamrożonych mózgów szczurów.
    UWAGA: Zawsze noś rękawice ochronne i okulary ochronne lub maskę podczas pracy z ciekłym azotem!
  2. Napełnij Dewara N2liq. i umieść zacisk zamrażający w Dewarze. Upewnij się, że ilość N2liq w Dewarze jest wystarczająca do wielokrotnych procedur zamrażania clamp (kilka litrów; ilość N2liq parującego podczas każdego zamrażania clamping zależy od wielkości zacisku).
  3. Znieczulenie zwierzęcia (np. izofluranem lub dootrzewnowym wstrzyknięciem mieszaniny ketaminy i ksylazyny). Przejdź do eutanazji przez nakłucie serca, aby zapobiec krwawieniu po usunięciu skóry głowy i otwarciu czaszki. Kroki 1.4-1.7 poniżej opisują tę standardową procedurę.
    UWAGA: W specjalnych protokołach wymagających maksymalnego zachowania glukozy i metabolitów wysokoenergetycznych, szczura należy poświęcić poprzez zamrożenie lejkiem mózgu znieczulonego zwierzęcia za pomocą N2liq11 po wycofaniu skóry głowy. Następnie wypreparuj mózg z czaszki pod przerywanymN2liq, aby zminimalizować metabolizm pośmiertny12.
  4. Zwilż głowę szczura alkoholem czyszczącym. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby (i) usunąć skórę głowy i (ii) otworzyć czaszkę wzdłuż szwów czaszkowych.
  5. Użyj kleszczy, aby dalej otworzyć czaszkę i usunąć cały mózg spod otwartej czaszki, ustawiając głowę do góry nogami. Szybko usuń wszelkie widoczne ślady krwi za pomocą chusteczek do tkanek. Jeśli półkule mózgowe są metabolicznie i morfologicznie symetryczne, wygodnie jest użyć jednej z półkul do analizy metabolicznej po oddzieleniu jej od drugiej półkuli przez nacięcie skalpelem. W razie potrzeby wykorzystaj pozostałą półkulę do innych badań mózgu, takich jak histologia.
  6. Szybko usuń zacisk zamrażający z Dewara wypełnionego N2liq, umieść cały lub pół mózgu szczura na jednej wewnętrznej powierzchni, zaciśnij i natychmiast włóż zacisk zamrażający do Dewara wypełnionego N2liq, trzymając zacisk mocno ściśnięty. Upewnij się, że kroki 1.3-1.6 nie trwają dłużej niż 60 sekund.
  7. Po 1-2 minutach wyjmij zacisk zamrażający z Dewara, otwórz zacisk, poluzuj zamrożoną tkankę mózgową z zacisku i zawiń zamrożoną tkankę w odpowiednio oznakowaną blachę aluminiową (patrz 1.1 powyżej). Upewnij się, że etykieta jest czytelna i pozostaje na swoim miejscu po owinięciu próbki. Szybko umieść owiniętą próbkę w N2liq. Całą procedurę należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć rozmrożenia zamrożonej tkanki mózgowej.
  8. Zamrożoną próbkę należy przechowywać w roztworze N2liq lub w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji metabolitu.
    UWAGA: W każdym przypadku, gdy próbka biologiczna ma być przechowywana przez okres dłuższy niż jeden rok, zaleca się przechowywanie w temperaturze N2liq w stosunku do -80 °C. Dotyczy to również pozostałej części niniejszego protokołu.

2. Przygotowanie procedury ekstrakcji metabolitów

  1. Przygotować homogenizator tkanek i pasujące do nich probówki (np. o średnicy wewnętrznej 10 mm, w zależności od średnicy trzonu homogenizatora; zwykle wykonane z tworzywa sztucznego). Używaj homogenizatorów elektrycznych zamiast homogenizatorów napędzanych ręcznie (młynki do tkanek). Przygotuj wirownik i wagę laboratoryjną.
  2. Przygotuj wiadro wypełnione kruszonym lodem. Utrzymuj wystarczającą ilość metanolu, chloroformu i wody na lodzie (po 4 ml na 250-350 mg zamrożonej tkanki mózgowej).
  3. Przygotować pipety i fiolki do przenoszenia.
    1. Przygotować szklane fiolki (objętość ≥20 ml) z nakrętkami i umieścić na lodzie (jedna fiolka na ekstrakt tkankowy). Dopasuj nakrętki z przegrodą teflonową odporną na chloroform.
    2. Przygotuj plastikowe pipety o pojemności 5 ml do dozowania metanolu i wody oraz szklane pipety lub strzykawki Hamilton do dozowania chloroformu. Przygotować dodatkowe pipety z tworzywa sztucznego (o objętości 5 lub 10 ml) do przenoszenia mieszanin homogenatu tkankowego i metanolu.
    3. Upewnij się, że wszystkie szklane naczynia są dokładnie spłukane wodą destylowaną i dokładnie wysuszone przed użyciem, aby usunąć ślady zanieczyszczeń, w szczególności wykrywalny przez NMR mrówczan i octan.
  4. Napełnij moździerz porcelanowy N2liq, umieść porcelanowy tłuczek w moździerzu i napełnij N2liq. Azot będzie parował, dopóki temperatura moździerza i tłuczka nie będzie wystarczająco niska. Niewielką ilość N2liq należy przechowywać w moździerzu.

3. Ekstrakcja metabolitów

  1. Wyjąć zamrożoną próbkę tkanki mózgowej z magazynu (zbiornik N2liq lub zamrażarka o temperaturze -80 °C). Następnie natychmiast przenieść próbkę tkanki do zaprawy częściowo wypełnionejN2liq.
  2. Użyj zimnego tłuczka N2liq, aby rozbić zamrożoną tkankę mózgową na mniejsze kawałki, które z łatwością zmieszczą się w probówkach używanych do homogenizacji tkanek. Aby zapobiec wyrzucaniu kawałków zamrożonej tkanki z zaprawy w tym procesie, rozdrobnij tkankę, nadal owijając ją w blachę aluminiową. Nie miel zamrożonej tkanki na proszek, ponieważ utrudniłoby to przeniesienie do probówki (zwiększone ryzyko kondensacji wody). WAŻNE: Podczas całej procedury w razie potrzeby dodawać N2liq do zaprawy, aby utrzymać próbkę w stanie głębokiego zamrożenia.
  3. Dokładnie wymieszaj małe kawałki zamrożonej tkanki mózgowej, odważ 250-350 mg i przenieś do probówki wypełnionej lodowatym metanolem (4 ml na 250-350 mg tkanki mózgowej). Za każdym razem, gdy dodawane są kawałki zamrożonej tkanki, należy je natychmiast homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego.
    UWAGA: Całą procedurę należy wykonać szybko, aby uniknąć (i) znacznej kondensacji wody na próbce, która mogłaby doprowadzić do przeszacowania masy próbki, oraz (ii) podgrzewania i rozmrażania próbki. Poszczególne fragmenty tkanek powinny znajdować się w stanie zamrożonym na początku procesu homogenizacji.
  4. Po dodaniu ostatniego kawałka zamrożonej próbki mózgu szczura do probówki i homogenizacji, przenieś homogenat do szklanej fiolki o objętości ≥20 ml, zamknij nakrętkę i odstaw na lód na 15 minut. Jeśli objętość probówki nie jest wystarczająco duża dla ≥4 ml metanolu, użyj mniejszej objętości metanolu do homogenizacji części zamrożonej tkanki mózgowej, przenieś mieszaninę do szklanej fiolki i kontynuuj homogenizację pozostałych fragmentów tkanki świeżym metanolem. Upewnij się, że całkowita objętość metanolu wynosi 4 ml na 250-350 mg tkanki mózgowej.
  5. Dodać taką samą objętość lodowatego chloroformu (tj. 4 ml na 250-350 mg tkanki mózgowej) do homogenacji, dokładnie zmieszać i odstawić na lód na 15 minut
    UWAGA: Zawsze używaj wentylowanego kaptura chemicznego podczas pracy z lotnymi rozpuszczalnikami, zwłaszcza chloroformem!
  6. Dodać taką samą objętość wody (tj. 4 ml na 250-350 mg tkanki mózgowej) do homogenacji, dokładnie odwirować i odstawić na noc w temperaturze -20 °C.

4. Przygotowanie separacji faz i odparowania rozpuszczalnika

  1. Przygotować zimną wirówkę (4 °C, 13 000 x g przy maksymalnym promieniu) i probówki wirówkowe. Upewnij się, że te ostatnie mają objętość ≥20 ml, są odporne na chloroform i mogą wytrzymać siły odśrodkowe 13 000 x g. Używać dedykowanych szklanych probówek wirówkowych, ale przed użyciem spłukać (jak wszystkie wyroby szklane) wodą destylowaną (patrz 2.3).
  2. Przygotować dokładnie wypłukane szklane pipety Pasteura i odpowiedni pipetor (gruszka, ręczna pompka do pipet, automatyczny przyrząd do pipet/pipetor itp.).
  3. Przygotować dwie dodatkowe, dokładnie wypłukane probówki (o objętości ≥15 ml) na próbkę mózgu, z których jedna musi być odporna na działanie chloroformu (wykonana ze szkła lub teflonu), a druga na metanol (wykonana z tworzywa sztucznego odpornego na metanol lub szkła).
  4. Przygotuj aparat do odparowywania rozpuszczalnika (dostępny w handlu lub domowej konstrukcji). Upewnij się, że to urządzenie zapewnia precyzyjnie kontrolowany strumień suchego azotu gazowego, który jest kierowany na powierzchnię roztworu ekstraktu zawierającego lotne rozpuszczalniki (metanol, chloroform).
  5. Przygotuj dwie dodatkowe tace lub wiadra wypełnione lodem: jedną do transportu próbki na lodzie, a drugą do utrzymywania próbek w niskiej temperaturze podczas procesu odparowywania.
  6. Przygotować liofilizator (liofilizator) i materiały potrzebne do liofilizacji: (i) jedną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml lub próżniową kolbę okrągłodenną na ekstrakt oraz (ii) N2liq do zamrożenia fazy wodnej próbek (≤0,3 l na próbkę). Jeśli używana jest probówka wirówkowa, przygotuj również butelkę z filtrem próżniowym z szeroką szyjką odpowiednią do liofilizatora.

5. Separacja faz i odparowanie rozpuszczalnika

  1. W celu całkowitego rozdzielenia faz przenieść homogenat metanolu/chloroformu/wody/tkanki mózgowej (patrz 3.6) do probówki wirówkowej odpornej na chloroform (objętość ≥20 ml) i wirować w temperaturze 13 000 x g i 4 °C przez 40 min.
    UWAGA: Utworzą się dwie fazy, oddzielone warstwą wytrąconego białka. Dolna (cięższa) faza składa się z metanolu, chloroformu i rozpuszczonych lipidów, podczas gdy górna (lżejsza) faza składa się z wody, metanolu i rozpuszczonych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.
  2. Za pomocą pipety Pasteura przenieś górną fazę do odpowiedniej probówki o pojemności ≥15 ml (tworzywo sztuczne odporne na metanol lub szkło). Trzymaj na lodzie.
  3. Użyj świeżej pipety Pasteura, aby przenieść dolną fazę do odpowiedniej probówki o pojemności ≥15 ml (szklanej lub teflonowej). Trzymaj na lodzie.
  4. Przechowywać warstwę wytrąconego białka w temperaturze -80 °C, jeżeli ma być ona użyta do oznaczania białka całkowitego, lub wyrzucić.
  5. Probówkę z fazą woda/metanol (patrz ppkt 5.2) należy trzymać na lodzie i odparować metanol, kierując strumień suchego azotu na powierzchnię roztworu ekstraktu. Alternatywnie, delikatnie przepuść azot przez roztwór ekstraktu. Zakończ proces parowania, gdy bulgotanie azotu nie powoduje już zmniejszenia objętości roztworu ekstraktu. W tym czasie kontynuować liofilizację (patrz ppkt 5.7) lub zamrozić i utrzymywać próbkę w temperaturze -80 °C z zamkniętą probówką (nakrętką lub parafilmem) do momentu, gdy będzie gotowa do liofilizacji.
  6. Umieścić probówkę z fazą metanolu/chloroformu (patrz ppkt 5.3) na lodzie i odparować metanol, kierując strumień suchego azotu na powierzchnię roztworu ekstraktu. Gdy cały rozpuszczalnik zostanie odparowany, należy zakończyć proces i utrzymywać próbkę w temperaturze -80 °C z zamkniętą probówką (nakrętka lub parafilm) do momentu, gdy będzie gotowa do analizy NMR.
  7. Przygotuj fazę wodną do liofilizacji
    1. Po zakończeniu procesu odparowywania metanolu (patrz ppkt 5.5) przenieść próbkę do dokładnie wypłukanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (jeżeli próbka jest zamrożona, rozmrozić ją przed przeniesieniem). Alternatywnie przenieść do próżniowej kolby okrągłodennej.
    2. Zamrozić roztwór ekstraktu przez obracanie probówki wirówkowej (lub kolby o okrągłym dnie) częściowo umieszczonej w N2liq w taki sposób, aby wewnętrzna powierzchnia probówki lub kolby była stopniowo pokrywana zamrożoną cieczą. Upewnij się, że żaden N2liq. nie może dostać się do gniazda.
    3. Gdy cały płyn zostanie zamrożony, przykryj rurkę przebitą pokrywką lub zakrętką, aby umożliwić ucieczkę pary, i umieść rurkę w butelce z filtrem próżniowym z szeroką szyjką.
    4. Limofilizację należy rozpocząć po umieszczeniu kolby lub butelki w liofilizatorze.
  8. Zakończyć proces liofilizacji, gdy próbka jest całkowicie sucha. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C w zamkniętej probówce (ze szczelną nakrętką!) do momentu użycia do analizy NMR.
    UWAGA: Zwykle do liofilizacji potrzeba nie więcej niż 24 godziny. Kilka próbek może być liofilizowanych jednocześnie, w zależności od konstrukcji liofilizatora oraz od tego, czy używane są probówki wirówkowe w butelkach z szeroką szyjką, czy kolby okrągłodenne.

6. Przygotowanie próbek NMR

  1. Wysuszone i liofilizowane ekstrakty należy przechowywać w bardzo niskiej temperaturze (≤-80 °C). Ponownie rozpuść liofilizaty w celu przygotowania próbek NMR bezpośrednio przed eksperymentem NMR.
    UWAGA: Przechowywanie próbek w roztworze i/lub w temperaturze zbliżonej do pokojowej może spowodować degradację próbki!
  2. Przygotować wodny roztwór 200 mM czynnika chelatującego, kwasu trans-1,2-cykloheksylodiaminotetraoctowego (CDTA), w następujący sposób:
    1. Dodać czystą wodę (np. 20 ml) do probówki lub probówki wirówkowej i dodać ilość proszku CDTA niezbędną do wytworzenia roztworu o stężeniu 200 mM.
      UWAGA: Znaczna część CDTA nie będzie rozpuszczalna, ponieważ pH jest bardzo niskie, ponieważ użyto kwasowej formy CDTA, a nie soli CDTA.
    2. Ostrożnie dodawaj, krok po kroku, coraz większe ilości proszku CsOH do roztworu CDTA i dokładnie mieszaj po każdym dodaniu.
      UWAGA: Rozpuszczalna frakcja CDTA będzie rosła wraz ze wzrostem zawartości CsOH w roztworze wodnym. Należy unikać "nadmiernego miareczkowania", tj. dodawać do roztworu CDTA mniej niż stechiometryczna ilość CsOH
      3. .
    3. Gdy prawie cały proszek CDTA zostanie rozpuszczony, rozpocznij pomiar pH po każdym dodaniu CsOH i dokładnym wirowaniu. Zakończyć dodawanie CsOH po osiągnięciu końcowego pH (Tabela 1).
      UWAGA: W tym momencie wszystkie CDTA zostaną rozwiązane. Stosowanie Cs+ jako przeciwjonu do CDTA jest ogólnie preferowane w stosunku do Na+ lub K+. Cs+ jest miękkim kwasem Lewisa ze względu na duży promień jonowy, w przeciwieństwie do Na+ i K+, które mają mniejsze promienie jonowe i są twardymi kwasami. W związku z tym Cs+ tworzy kompleksy z fosforanami (twardymi zasadami) łatwiej niż Na+ i K+. Jest to korzystne dla spektroskopii 31P NMR fosforylowanych metabolitów, ponieważ kompleksowanie ma tendencję do zwiększania szerokości linii NMR, szczególnie w warunkach powolnej i pośredniej wymiany jonowej.
  3. Dla analizy 31P NMR fosfolipidów (PL) rozpuścić wysuszone lipidy (patrz 5.6) w 700 μl mieszaniny rozpuszczalników składającej się z deuterowanego chloroformu (CDCl3), metanolu i roztworu CDTA przygotowanego zgodnie z opisem w ppkt 6.2 (stosunek objętościowy 5:4:1). Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej. W obu etapach należy używać mikropipet z bezpośrednim przemieszczeniem (lub wyporowym) z końcówkami odpornymi na chloroform.
    UWAGA: Należy pamiętać, że zmiana któregokolwiek z poniższych parametrów wpłynie na wygląd (przesunięcie chemiczne i szerokość linii) widm PL 31P NMR 13-17:
    (i) stosunek objętościowy CDCl3 : MeOH : roztwór CDTA
    (ii) całkowita objętość użytego rozpuszczalnika
    (iii) pH wodnego składnika rozpuszczalnika
    (iv) Stężenie CDTA w wodnym składniku rozpuszczalnika.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, dostrajanie tych parametrów próbki (Tabela 1) nie jest konieczne i powinno być wykonywane z najwyższą ostrożnością, jeśli jest to pożądane w szczególnych przypadkach. Zmiana stosunku objętości między rozpuszczalnikami w prosty sposób prowadzi do powstania układu składającego się z dwóch faz zamiast jednej fazy jednorodnej! Stwierdzono, że system jednofazowy jest bardziej praktyczny niż system dwufazowy w większości zastosowań13,14.
  4. W celu przeprowadzenia 1-godzinnejanalizy NMR metabolitów rozpuszczalnych w wodzie, rozpuścić liofilizat (patrz 5.8) w 700 μl tlenku deuteru (D2O) zawierającego sól sodową kwasu 3-(trimetylosililo)propiono-2,2,3,3-d4 (TSPd 4) w zakresie milimolowym (D2O zawierający 0,05% TSPd4 jest dostępny w handlu). Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej.
  5. Doprowadzić pH otrzymanego wodnego roztworu ekstraktu do 7,3, dodając niewielkie ilości (ok. 2 μl) roztworów chlorku deuteru (DCl) i tlenku deuteru (NaOD). Najpierw zacznij od roztworów 0,02 N DCl lub NaOD. Jeśli 2 lub 3 kolejne dodania nie spowodują wystarczającej zmiany pH, należy kontynuować stosowanie 0,2 N roztworów DCl lub NaOD. Uważaj, aby nie przemiarkować.
    UWAGA: Całkowita potrzebna ilość roztworu DCl lub NaOD zależy od ilości wyekstrahowanej tkanki mózgowej; Należy zanotować tę wartość w celu precyzyjnego oznaczania ilościowego metabolitów. W większości przypadków łączne objętości dodanych roztworów DCl i NaOD powinny być praktycznie znikome (blisko 1% objętości próbki NMR).

7. Wydajność eksperymentu 31P NMR do analizy fosfolipidów mózgu13,14

  1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć wielojądrowego spektrometru NMR o wysokiej rozdzielczości (natężenie pola ≥9,4 Tesli, odpowiadające częstotliwościom rezonansowym 162 MHz 31P lub 400 MHz 1H). Oprócz cewki 31P upewnij się, że sonda 31P NMR posiada cewkę 1H do odsprzęgania protonów. Ustaw regulację temperatury sondy NMR na żądaną wartość docelową (zwykle 25 °C).
    UWAGA: Temperatura sondy może potrzebować 10-20 minut, aby się ustabilizować!
  2. Odwirować roztwór ekstraktu PL w probówce do mikrowirówek (patrz ppkt 6.3) w temperaturze 4 °C i 11 000 x g przez 30 minut w celu odwirowania stałych pozostałości w próbce. Przenieść 600 μl supernatantu do wysokiej jakości probówki NMR (średnica zewnętrzna 5 mm).
  3. Przygotować odpowiedni współosiowy trzpień wkładki wypełniony wodnym roztworem metylenodifosfonianu (MDP) o pH 20 mM o pH 7,0 w celu odniesienia chemicznego i oceny ilościowej. Umieść tę wkładkę w probówce NMR wypełnionej roztworem ekstraktu PL.
  4. Dopasuj rurkę NMR do odpowiedniego pokrętła i przenieś do magnesu NMR. Teraz należy obrócić próbkę z częstotliwością 15-20 Hz i poczekać, aż próbka dostosuje się do ustawionej temperatury (ok. 10 min).
  5. Ostrożnie zminimalizuj niejednorodność pola magnetycznego w próbce, regulując prądy cewki podkładki w osi i poza osią18.
  6. Ustaw parametry akwizycji widma NMR na optymalne wartości, które mogą się różnić w zależności od natężenia pola magnetycznego (dla systemu 9.4 T, patrz Tabela 1, aby zapoznać się z zalecanymi wartościami parametrów).
  7. Ustaw liczbę stanów nieustalonych na eksperyment (= NS).
    1. Ustaw NS na około 80 (całkowity czas pozyskiwania danych ok. 20 min), jeśli tylko najbardziej rozpowszechnione PL mają być precyzyjnie oznaczone ilościowo (fosfatydylocholina (PtdCho), fosfatydyloetanoloamina (PtdEtn), plazmalogen etanoloaminy).
    2. Ustaw NS na około 100-200 (całkowity czas pozyskiwania danych 1-2 godziny), jeśli mają być oznaczane ilościowo mniej skoncentrowane PL (alkilo-acylo-fosfatydylocholina, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, kwas fosfatydynowy).
    3. Ustaw NS na około 1,500-2,000 (całkowity czas pozyskiwania danych 7-10 godzin; eksperyment nocny), jeśli mają być oznaczane ilościowo PL o bardzo niskich stężeniach, np. mono fosfatydyloinozytolu i difosforany (PtdIP i PtdIP2), kardiolipina, lizo-PL, alkilo-acylo-fosfatydyloetanoloamina i czasami inne.
  8. Po zakończeniu akwizycji widma proces wolnego zaniku indukcyjnego (FID) przy użyciu zoptymalizowanych parametrów. Wartości tych parametrów zmieniają się w zależności od natężenia pola magnetycznego, jakości podkładki i sygnału PL, który ma być określony ilościowo.
    1. Aby uzyskać najlepsze wyniki dla całego zakresu PL, powtórz przetwarzanie przy użyciu wielu (co najmniej dwóch) różnych procedur filtrowania. Użyj silnego wzmocnienia rozdzielczości dla silnie nakładających się sygnałów, np. dla regionów PtdCho i PtdEtn.
    2. Użyj silnego filtrowania (słabe lub brak poprawy rozdzielczości) dla słabych sygnałów.
    3. Filtruj bardzo słabe i szerokie sygnały bez znaczącego nakładania się przez apodyzację (np. LB = 3 Hz) w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu, np. PtdIP i PtdIP2. Patrz tabela 1 dla charakterystycznych parametrów przetwarzania.
  9. Określić ilościowo obszar każdego sygnału PL w odniesieniu do obszaru pod sygnałem związku odniesienia (MDP) w tym samym widmie.
  10. Skalibrować sygnał związku odniesienia (MDP) w oddzielnym doświadczeniu, używając rurki NMR o średnicy 5 mm wypełnionej (i) związkiem fosforu o znanym stężeniu oraz (ii) tym samym współosiowym trzpieniem wkładki, który był używany w eksperymentach NMR PL 31P (patrz 7.3 i 7.9).
  11. Obliczyć indywidualne stężenia PL na podstawie względnych obszarów sygnałów PL z jednej strony (patrz 7.9), a z drugiej strony na podstawie wartości kalibracji uzyskanej dla MDP z wkładki koncentrycznej (patrz 7.10). Należy wziąć pod uwagę, że liczba jąder fosforu przyczyniających się do określonego sygnału 31P NMR może się różnić w zależności od pochodzenia molekularnego tego sygnału.
    UWAGA: Sygnał fosfonianu MDP (zwykle odnoszący się do 19,39 ppm) reprezentuje dwa jądra fosforu, podobnie jak sygnał fosforanu kardiolipiny. Wszystkie inne sygnały NMR PL 31P wykryte w ekstraktach mózgowych reprezentują po jednym jądrze fosforu.
  12. W razie potrzeby użyj oprogramowania statystycznego, aby porównać poziomy PL w mózgu między grupami zwierząt.

8. Wykonanie eksperymentu 1H NMR do analizy rozpuszczalnych w wodzie metabolitów mózgu

  1. Ustaw regulację temperatury sondy 1H NMR na żądaną wartość docelową (zwykle 25 °C). Patrz również uwagi w punkcie 7.1.
  2. Wodny roztwór ekstraktu odwirować w probówce do mikrowirówek (patrz 6.5) w temperaturze 4 °C i 11 000 x g przez 30 minut w celu odwirowania stałych pozostałości w próbce. Przenieść 600 μl supernatantu do wysokiej jakości probówki NMR (średnica zewnętrzna 5 mm).
  3. Przenieś rurkę NMR do magnesu NMR, podkładkę i ustaw parametry akwizycji widma NMR na optymalne wartości, jak wyjaśniono w 7.4-7.6. Patrz również Tabela 1, aby zapoznać się z zalecanymi wartościami parametrów.
  4. Ustaw liczbę stanów nieustalonych na około NS = 32 (całkowity czas pozyskiwania danych ok. 13 min). Aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu dla bardzo słabych sygnałów, zwłaszcza w obszarze aromatycznym, należy użyć NS = 64 (całkowity czas pozyskiwania danych ok. 26 min) lub więcej.
  5. Po zakończeniu akwizycji widma proces wolnego zaniku indukcyjnego (FID) przy użyciu zoptymalizowanych parametrów. Wartości tych parametrów różnią się nieznacznie w zależności od natężenia pola magnetycznego, jakości podkładki i sygnału metabolitu, który ma być określony ilościowo.
    UWAGA: W większości przypadków wystarczy przetworzyć każde widmo jeden raz, stosując zestaw parametrów przetwarzania, co stanowi dobry kompromis dla wszystkich sygnałów metabolitów. Patrz tabela 1 dla charakterystycznych parametrów przetwarzania.
  6. Określić ilościowo obszar każdego sygnału metabolitu (często multipletu, czasami nakładającego się na inne pojedyncze lub wielokrotne pochodzące z różnych cząsteczek) w odniesieniu do obszaru pod sygnałem związku odniesienia (TSP-d4) w tym samym widmie.
  7. Obliczyć stężenia poszczególnych metabolitów na podstawie stężenia TSP-d4 (patrz 6.4). Należy wziąć pod uwagę, że liczba protonów przyczyniających się do określonego sygnału 1H NMR może się różnić w zależności od pochodzenia molekularnego tego sygnału. Sygnał trimetylowy TSP-d4 (odnoszący się do 0,0 ppm) reprezentuje dziewięć protonów.
  8. W razie potrzeby użyj oprogramowania statystycznego, aby porównać poziomy metabolitów w mózgu między grupami zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość w metabolicznych widmach NMR ekstraktów z mózgu i innych tkanek, powszechną praktyką było od dłuższego czasu usuwanie lub maskowanie jonów metali (najważniejszych: jonów paramagnetycznych) obecnych w roztworach ekstraktów. Osiągano to poprzez dodanie do ekstraktu czynnika chelatującego, takiego jak EDTA lub CDTA19, lub poprzez przepuszczenie ekstraktu przez żywicę jonowymienną, taką jak Chelex-10020. Wyniki przedstawione na Rysunku 1 wykazują, że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektroskopia NMR jest skuteczną metodą pomiaru stężeń związków chemicznych w roztworze w sposób bardzo powtarzalny i dokładny. Jednak, aby uzyskać dane wysokiej jakości, konieczne jest przestrzeganie pewnych zasad dotyczących przygotowania i analizy próbek. Przy oznaczaniu stężeń metabolitów za pomocą spektroskopii NMR ani generacja, ani odbiór sygnału NMR nie dominują nad błędem ilościowym, chyba że intensywność obserwowanego sygnału zbliża się do progu detekcji (szczególnie słaby sygnał). We wszystkich innych przypadk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie ze strony Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 i 7339) jest z wdzięcznością podziękowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneVirbacVetfluraneAnesthetic dla zwierząt
Waporyzator izofluranowyOhmedaIsotec 3Dostępny nowszy model: Isotec 4
Skalpel, nożyczki, kleszcze, zaciskiAparat Harvarda
Fisher Scientific		różne
różne		Sprzęt chirurgiczny dla zwierząt
Narzędzie do zamrażaniarobotyn/aRzemień z płytkami aluminiowymi, do włożenia
w ciekłym azocie do chłodzenia
DewarNalgene4150-4000
Ciekły azotAir Liquiden/a
Azot gazowyAir Liquiden/a
Parownik azotuOrganomation AssociatesN-EVAP 111Może być zastąpiony przez domowe urządzenie
MoździerzSigma-Aldrich
TłuczekSigma-AldrichZ247510
Homogenizator tkankowyKinematicaPolytronZ probówkami pasującymi do wału homogenizatora
Waga elektronicznaSartoriusn/a
MetanolSigma-AldrichM3641
ChloroformSigma-Aldrich366910
Szklane probówki wirówkoweKimble45500-15, 45500-30Kimax 15 ml, 30 ml probówka
do mikrowirówekKimble45150-2Kimax 2 ml probówka; powinna zastąpić probówkę "Eppendorf", jeśli jest kompatybilna z wirnikiem wirówki
Pipety polistyrenoweCostar CorningStripetteso objętości 5 i 10 ml
DeuterochloroformSigma-Aldrich43191599,96% deuterowany
Tlenek deuteruSigma-Aldrich42345999,96% deuterowany
Chlorek deuteruAlpha Aesar4240620% w tlenku deuteru
DeuterSigma-Aldrich16448830% w tlenku deuteru
LiofilizatorChristAlpha 1-2
Zimna wirówkaHeraeusMegafuge 16R
pH-metrEutech CyberneticsCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
Wodorotlenek cezuSigma-Aldrich516988
probówki NMR Wilmad528-PP
Wkładka koncentryczna z trzpieniem NMRSigma-AldrichZ278513By Wilmad
Pipety NMRSigma-AldrichZ255688
PipetyEppendorfResearchZ końcówkami do objętości od 0,5 do 1 000 μ l
Spektrometr NMR
Oprogramowanie NMRBrukerTopSpin 1.3dostępna nowsza wersja: Topspin 3.2
Rozpuszczalne w wodzie związki wzorcoweSigma-Aldrichróżne
Avanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		różne
różne
różne		Źródło plazmalogenów, ale może być < 70 - 80% czystości
MetylenodifosfonianSigma-AldrichM9508
TSP-d4Sigma-Aldrich269913
domowej Z247472 Pipet-Aid Drummond XP Bruker AVANCE 400 wraz z sondą i innymi akcesoriami wzorcowe związki fosfolipidowe

Bibliografia

  1. Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5(2008).
  2. Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1(2012).
  3. Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
  4. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
  5. Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
  6. Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
  7. Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157(2007).
  8. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  9. Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
  10. Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  11. Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
  12. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
  13. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
  14. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  16. Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101(2013).
  17. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
  18. Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
  19. Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
  20. Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektroskopia NMRekstrakty z tkanki m zgowejhomogenizacja tkanekmetanol chloroform wodaproces liofilizacjianaliza fosfolipid wwysokorozdzielcze NMRprofilowanie metabolit w
Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.