In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans

Podsumowanie

Po ekspozycji na specyficzne stresory środowiskowe, nicień Caenorhabditis elegans przechodzi intensywną plastyczność fenotypową, aby wejść w odporne na stres stadium młodociane. Przedstawiono metody kontrolowanej indukcji i obrazowania neuroplastyczności w okresie dauera.

Streszczenie

Mechanizmy kontrolujące plastyczność fenotypową wywołaną stresem u zwierząt są często skomplikowane i trudne do zbadania in vivo. Klasycznym przykładem plastyczności wywołanej stresem jest stadium dauer C. elegans. Dauery są alternatywnym stadium rozwojowym powstającym w warunkach niskich stężeń pokarmu bakteryjnego i wysokich stężeń feromonu dauer. Dauery wykazują dużą plastyczność rozwojową i behawioralną. Na przykład zestaw czterech neuronów wewnętrznego kwadrantu wargowego (IL2Q) ulega rozległej odwracalnej przebudowie podczas tworzenia dauera. Wykorzystując dobrze znane szlaki środowiskowe regulujące wnikanie dauera, zademonstrowano wcześniej ustaloną metodę produkcji surowego feromonu dauer z płynnych kultur nicieni na dużą skalę. Dzięki tej metodzie stężenie 50 000 - 75 000 nicieni/ml płynnej kultury jest wystarczające do wytworzenia bardzo silnego surowego feromonu dauer. Moc surowych feromonów określa się za pomocą testu biologicznego dawka-odpowiedź. Na koniec opisano metody stosowane do obrazowania poklatkowego in vivo IL2Q podczas tworzenia dauera.

Wprowadzenie

Plastyczność fenotypowa, w tym plastyczność rozwojowa i behawioralna, jest ważna dla adaptacji do niekorzystnych warunków środowiskowych i jest uważana za siłę napędową ewolucji¹. C. elegans jest organizmem modelowym często wykorzystywanym do badań nad rozwojem i neurobiologią. W idealnych warunkach C. elegans rozwija się w czterech stadiach larwalnych przed wejściem w dorosłe stadium rozrodcze. Jednak w warunkach niskiej dostępności pożywienia i dużej gęstości zaludnienia C. elegans może przejść przełącznik rozwojowy i wejść w długotrwałe i odporne na stres stadium². Dauery wykazują kilka morfologicznych i behawioralnych różnic w stosunku do osób niebędących dauerami, które prawdopodobnie pośredniczą w tej odporności na stres. Sygnały środowiskowe i szlaki genetyczne regulujące wnikanie dauera zostały obszernie opisane^{3, 4, 5, 6, 7}. Jednak mechanizmy molekularne kontrolujące poszczególne zmiany fenotypowe, które zachodzą podczas powstawania dauera, są słabiej poznane.

Badanie fenotypów specyficznych dla dauer wymaga produkcji zwierząt dauer. Można to osiągnąć na trzy sposoby: 1) Wybieranie z wygłodzonej kultury C. elegans, 2) Użycie mutantów konstytutywnych tworzenia dauer (daf-c), 3) Indukcja tworzenia dauer poprzez oczyszczony feromon. Stosunkowo łatwo jest wybrać dauery ze standardowej płytki NGM z populacją C. elegans, która wyczerpała swoje bakteryjne zapasy pokarmu. W naszych rękach standardowa płytka NGM pierwotnie wysiana 50 μl Escherichia coli OP50, pozostawiona do wzrostu przez 3 dni, a następnie zaszczepiona 3 - 4 dorosłymi hermafrodytami trzymanymi w temperaturze 25 °C, wyczerpie zapas żywności w ciągu jednego tygodnia i wyprodukuje kilka tysięcy dauers w ciągu dodatkowych 3 dni (oprócz wielu wygłodzonych nie-dauerów). Metoda ta jest jednak niezadowalająca do badania procesów zachodzących podczas linienia do dauer. Trudno określić, które z kilku tysięcy zwierząt znajdujących się na typowym wygłodzonym talerzu wchodzą do dauer. Co więcej, użycie zagłodzonej płytki nie daje możliwości synchronizacji. Zastosowanie mutantów daf-c pozwala na synchronizację i niezawodne generowanie dauerów. Nie ma jednak gwarancji, że konkretna mutacja daf-c nie wpłynie na inne fenotypy specyficzne dla dauera samodzielnie lub w połączeniu z dodatkowymi mutacjami.

Obecność feromonu dauer została najpierw zasugerowana przez Cassadę i Russella, a później zademonstrowana przez Goldena i Riddle'a. Od tego czasu feromon dauer został scharakteryzowany chemicznie^{2, 8, 9, 10}. Oczyszczony feromon składa się ze złożonej mieszanki askarozydów, które w różnych formach regulują zarówno procesy behawioralne, jak i rozwojowe^{9, 11}. Zastosowanie surowego ekstraktu z feromonów dauer pozwala na niezawodną, kontrolowaną indukcję zsynchronizowanych dauerów na tle dzikiego typu.

Układ nerwowy i związane z nim komórki glejowe przechodzą przebudowę podczas formowania się larw dauer^{12, 13, 14}. Niektóre z tych zmian są nieodwracalne, jak na przykład przebudowa komórek glejowych podczas dauer^{13, 14}. Jednak inne zdarzenia związane z przebudową są odwracalne po powrocie do sprzyjających warunków środowiskowych. Na przykład zestaw czterech neuronów IL2Q ulega szybkiej i odwracalnej przebudowie neuronów podczas tworzenia dauer, w tym: arboryzacji dendrytów, przejściu z pojedynczych neuronów dendrytycznych na wielodendrytyczne i przebudowie aksonów¹². Przedstawione metody pozwalają na wiarygodne obrazowanie in vivo neuroplastyczności wywołanej stresem w organizmie modelowym. Przedstawione metody produkcji i badania surowego feromonu dauer zostały wcześniej opisane i opracowane na podstawie kilku źródeł^{4, 8, 15, 16, 17, 18}.

Protokół

1. Produkcja surowych feromonów Dauer

1. Hodować OP50 E. coli z pojedynczej kolonii O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając 100 ml bulionu LB przy 200 obr./min. UWAGA: Ta kultura O/N może być przygotowana z wyprzedzeniem i przechowywana w temperaturze 4 °C.
2. Uprawiaj N2 C. elegans na 15 - 20 6 cm szalkach Petriego z agarem NGM (patrz przepis w tabeli 1) wysiewanym 50 μl OP50 E. coli, aż bakterie będą prawie wyczerpane¹⁹.
3. Przygotować 5 x 250 ml pożywki S (patrz przepis w Tabeli 1) w 1 l kolbach Erlenmeyera¹⁹. UWAGA: To rozwiązanie można wykonać z wyprzedzeniem.
4. Wyhodować kulturę OP50 E. coli w 4 litrach bulionu LB O/N poprzez zaszczepienie 1 ml OP50 w E. coli i wytrząsanie w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
5. Przemyć nicienie z płytek (etap 1.2) 1 ml roztworu podstawowego S (patrz przepis w tabeli 1) i przenieść nicienie z 4-5 płytek do każdej z 4 kolb Erlenmeyera o pojemności 1 l z pożywką S przygotowaną w kroku 1.3 (4-5 płytek na każdą kolbę)¹⁹.
6. Odwirować OP50 z kroku 1.4 przy 650 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Zawiesić każdy osad bakteryjny w 10 ml roztworu podstawowego S. Przenieść równe ilości zawieszonych bakterii do każdej kolby nicieni.
7. Umieścić kolby na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) i 100 - 150 obr./min przez 4-5 dni, aż roztwór zacznie się klarować, wskazując na wyczerpanie pokarmu.
8. Gdy pokarm się wyczerpie, wyhoduj kolejną kulturę O/N OP50 E. coli w 4x 1 l bulionu LB. Odwirować bakterie przy 650 x g przez 10 minut i dodać osad z jednej kolby do każdej z kolb z pożywką S z nicieniami. Umieścić kolby z pożywką S z powrotem w wytrząsarce orbitalnej, jak w kroku 1.7, przez dodatkowe 3-4 dni, aż pokarm ponownie się wyczerpie.
9. Pobrać ~1 ml podwielokrotności roztworu z każdej kolby i oszacować stężenie nicieni, pobierając podpróbki 1 μl z każdej podwielokrotności 1 ml i licząc liczbę nicieni. UWAGA: Populacja nicieni powinna wynosić 50 000 - 75 000 nicieni/ml. Przy tym stężeniu większość nicieni to nicienie.
10. Wyrzucić wszelkie zanieczyszczone kolby. UWAGA: Zanieczyszczenie często objawia się strzępkami grzybów widocznymi w kroku 1.9.
11. Odwirować nicienie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić osad nicienia i zachować supernatant. Alternatywnie, zapoznaj się z dyskusją na temat używania tych zwierząt do wytwarzania feromonów o niskiej mocy.
12. Przefiltruj supernatant przez #1 Bibułę filtracyjną Whatman. UWAGA: Kolba próżniowa przyspieszy ten proces.
13. Następnie przefiltruj supernatant przez sterylne jednostki filtracji próżniowej 0,45 μm. UWAGA: Filtrat można utrzymywać w temperaturze O/N w temperaturze 4 °C lub przejść do 1.14.
14. Dodać filtrat do 2-litrowej zlewki z mieszadłem. Umieścić w dygestorium na płycie do podgrzewania. Mieszając doprowadzić do wrzenia i odparować do około 200 ml. Przenieść roztwór do zlewki o pojemności 500 ml. Kontynuuj gotowanie, aż pozostanie około 50 ml. UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, ponieważ możliwe jest wykipienie roztworu. Kolor ostatnich 50 ml jest ciemnobrązowy. W dowolnym momencie procesu gotowania można wyłączyć ogrzewanie, a filtrat przechowywać O/N w temperaturze RT lub 4 °C.
15. Ostudzić i odwirować przez 5 minut przy 1 000 x g. Wlać supernatant do zlewki o pojemności 100 ml i wyrzucić osad.
16. Ugotować supernatant do brązowej skórki. Zdejmij z ognia i rozbij skórkę szpatułką. Dodaj wystarczającą ilość 200-procentowego etanolu, aby pokryć skórkę. Przykryj zlewkę Parafilm i pozostaw ją w temperaturze O/N w temperaturze pokojowej. Odlej etanol do czystej zlewki i odłóż na bok. Dodaj świeży etanol, aby przykryć skórkę. Powtórz ekstrakcje O/N 3 razy. Połącz ekstrakty.
17. Użyj pompy próżniowej do wysuszenia ekstraktów etanolu. Jeżeli pompa próżniowa nie jest dostępna, dodać ekstrakt etanolowy do czystej zlewki i ogrzać do 50 °C, mieszając w wyciągu. UWAGA: Po odparowaniu etanolu powinna pozostać lepka pozostałość o jasnobrązowym kolorze. W przypadku ogrzewania należy uważać, aby nie spalić roztworu przez zbyt długie ogrzewanie.
18. Pozostałość rozpuścić w 10 ml destylowanej sterylnej wody. Filtrować, wysterylizować ten roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 1 ml. UWAGA: 1 ml wody służy do rozpuszczenia pozostałości na każde 100 ml oryginalnej płynnej kultury nicieni. Na przykład, jeśli jedna z płynnych kolb hodowlanych zostanie wyrzucona z powodu zanieczyszczenia, należy dostosować ilość wody użytej do rozpuszczenia pozostałości.

2. Określenie reakcji na dawkę feromonu

1. Przygotować feromon dauer, sporządzając 6 x 5 ml pożywki NGM z agarem Noble, bez peptonu i uzupełniony 50 μg/ml siarczanu streptomycyny i szeregiem feromonów dauer (patrz przepis w tabeli 1^{)4, 19}. Wymieszaj składniki w szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 13x100 mm, zagotuj na palniku Bunsena, a następnie przelej do 3 cm szalek Petriego.
2. Zważyć probówkę do mikrowirówki. Dodać 1 ml kultury O/N E. coli OP50 do probówki i odwirować przy ~17 000 x g w probówce do mikrowirówki. Usunąć cały supernatant. Ponownie zważyć probówkę i określić wagę osadu bakteryjnego. Zawiesić osad za pomocą buforu M9 (patrz przepis w tabeli 1) dla końcowego stężenia 4% (^w/_v). Podwielokrotność 10 μl zawiesiny bakteryjnej na środek każdej płytki feromonowej⁴. Przechowywać tabliczki O/N w temperaturze pokojowej.
3. Zbierz 10-15 grawitacyjnych hermafrodytów N2 typu dzikiego dzień po wylinkowaniu do dorosłości^na płytki feromonowe 4. Przechowywać płytki w temperaturze 25 °C przez 3 - 4 godziny.
4. Zlikwiduj wszystkie dorosłe hermafrodyty. Zapisz liczbę jaj złożonych na każdej tabliczce. Uszczelnij płytki Parafilmem i wróć do temperatury 25 °C na 3 dni¹⁷.
5. Policz procent dauerów (Rysunek 2). Uwaga: W przypadku obu metod ważne jest, aby pamiętać, że dauery (i w mniejszym stopniu nie-dauery) będą wspinać się po ściankach i na pokrywę szalek Petriego. Dlatego ważne jest, aby zbadać wszystkie powierzchnie naczynia pod kątem nicieni.
6. Dopasuj dane do krzywej dawka-odpowiedź i oszacuj stężenie feromonu EC₉₀ (feromon wystarczający do wywołania 90% zwierząt do wytworzenia barwników), jak pokazano na rysunku 3. Uwaga: Zazwyczaj używamy modelu regresji logistycznej do oszacowania EC₉₀, ale różne pakiety oprogramowania statystycznego mogą mieć alternatywne metody, które dają podobne oszacowania.

3. Obrazowanie na żywo neuronów Dauer IL2

1. Przygotować płytki z feromonami dauera jak w protokole 2, stosując wartość EC₉₀ określoną w kroku 2.6.
2. Indukuj dauers za pomocą metod opisanych w protokole 2 ze szczepem przenoszącym zintegrowany transgen reporterowy IL2 (myIs13[P_klp-6::gfp], myIs14[P_klp-6::gfp], myIs16[P_klp-6::tdTomato] lub qIs56[P_lag-2::gfp])^{12, 20, 21}. UWAGA: Jeśli używany jest qIs56, ekspresja GFP nie będzie widoczna w IL2Q do kilku godzin po linieniu dauer, a niektóre z początkowych zdarzeń przebudowy nie będą widoczne. Dodatkowo, podczas gdy sygnał fluorescencyjny z transgenu P_lag-2::gfp jest ostatecznie jaśniejszy w IL2 podczas dauer niżreportery fluorescencyjne P_klp-6, transgen P _lag-2::gfp również ulega słabej ekspresji w mięśniach głowy, które mogą maskować drobne gałęzie IL2.
3. Po złożeniu jaj usunąć dorosłe hermafrodyty, uszczelnić płytki Parafilmem i inkubować przez 34 godziny w temperaturze 25 °C¹⁷. UWAGA: Czas do wylinkowania dauer różni się nieznacznie u poszczególnych osób. Najszybszy okres arboryzacji dendrytów rozpoczyna się 4 - 5 godzin po rozpoczęciu linienia dauer (39 - 44 godziny po złożeniu jaj w temperaturze 25 °C)¹².
4. Dzień przed obrazowaniem należy uzupełnić roztwór 10% (^m/_v) agarozy w buforze M9 z feromonem dauer o stężeniu EC₉₀. Porcję około 100 μl agarozy nanieść na szkiełko mikroskopowe i szybko, ale delikatnie, umieścić na niej kolejne szkiełko, aby uzyskać płaską powierzchnię agarozy. Po zestaleniu się agarozy zawiń szkiełka w saran wrap i przechowuj w komorze wilgotnościowej (pudełko z końcówkami do pipet z mokrymi ręcznikami papierowymi).
5. Po 34-godzinnym okresie inkubacji zbadaj płytki feromonowe pod kątem nicieni, które przestały pompować gardło. Oddziel szkiełka w taki sposób, aby tylko jedna powierzchnia jednego szkiełka miała na sobie agarozę. Zbierz jeden lub więcej nicieni na 10% wacikach agarozowych i 1 μl kulek polistyrenowych o grubości 0,1 mikrona²². UWAGA: Przy dobrze zsynchronizowanej populacji większość nicieni na płytce będzie wchodzić w linienie od L2d do dauer. Mogą jednak występować różnice między osobami. Dlatego ważne jest, aby zwrócić uwagę na dodatkowe cechy (niedrożność stomii, przebudowa gardła), aby oszacować czas, przez jaki zwierzęta przebywały w okresie linienia (patrz na przykład reprezentatywne wyniki).
6. Określ orientację (lewa/prawa, grzbietowa/brzuszna) nicienia. Przechwytuj obrazy stosu Z dendrytu IL2Q przy 100-krotnym powiększeniu z najniższą możliwą intensywnością fluorescencji co 15 minut lub w zależności od potrzeb konkretnego eksperymentu. Kontynuuj robienie zdjęć, dopóki nicienie nie oddzielą się od naskórka L2d i unieruchomienie nie będzie możliwe lub jeśli zwierzę wyzdrowieje z dauer (gardło zacznie pompować). Gdy nie obrazujesz aktywnie, umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. UWAGA: Używamy mikroskopu epifluorescencyjnego z zmotoryzowanym stolikiem i optyką z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC).

Wyniki

Produkcja surowego feromonu dauer skutkuje otrzymaniem żółtego płynu (Rysunek 1), który jest stabilny zarówno w wysokiej, jak i niskiej temperaturze. Alikwoty surowego feromonu przechowuje się w temperaturze -20 °C bezterminowo, bez wyraźnej utraty aktywności. Po otrzymaniu feromonu pojedynczy bioassay zależności dawka-odpowiedź jest wystarczający do wstępnej oceny mocy. Jednak w większości eksperymentów konieczne jest powtórzenie bioassay 2 - 3 razy i wyciągnięcie średniej z każdego doświadczenia. Repre...

Dyskusja

Badanie neuroplastyczności specyficznej dla dauera i innych zmian morfologicznych związanych z dauerem wymaga kontrolowanego i niezawodnego tworzenia dauerów albo poprzez mutację genetyczną (tj. mutanty daf-c ), albo przez ekspozycję zwierząt typu dzikiego na feromony. Chociaż zastosowanie mutacji genetycznej do wywołania dauers jest wygodne, może zafałszować wyniki. W związku z tym dane zebrane z mutacjami daf-c powinny być następnie potwierdzone na zwierzętach typu dzikiego indukowanych do we...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
N2 C. elegans Bristol szczep	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Na żądanie z laboratorium Schroeder
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Na żądanie z laboratorium
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petriego szalki Petriego	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Różne		3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton w 975 ml H2O autoklawowane schłodzone do 55° C, a następnie 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu, 25 ml 1 M buforu KPO4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4
S Media	Różne		podłoża S składają się z roztworu podstawowego S (1,46 g NaCl, 0,25 g K2HPO4, 1,5 g KH2PO4, 0,25 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu i H2O do 250 ml. Autoklawowane.) Do roztworu podstawowego S dodać 2,5 ml cytrynianu potasu o pH 6,0 (2 g monohydratu kwasu cytrynowego, 29,4 g monohydratu cytrynianu tripotasu, H2O do 100 ml, autoklawowano), 2,5 ml roztworu metali śladowych (1,86 g EDTA disodowego, 0,69 g FeSO4  i byka; 7 H2O, 0,2 g MnCl2• 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  i byka; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  i byka; 5 H2O, H2O do 1 L. Autoklawizowane i przechowywane w ciemności), 0,75 ml 1 M CaCl2 i 0,75 ml 1 M MgSO4.
Płytki feromonowe Dauera do oznaczania dawka-odpowiedź	Różne		Mix 0,085 g Szlachetny agar, 0,5 ml 0,513 M NaCl i 5 &mikro; l 5 mg/ml cholesterolu rozpuszczonego w etanolu w każdej z 6 probówek hodowlanych po 15 ml. Dodaj wystarczającą ilość surowego feromonu do każdej probówki, aby uzyskać różne stężenia. Dodać H2O, aby zwiększyć objętość do 4,725 ml.  Gotować na palniku Bunsena, aż agar się rozpuści, a następnie ostudzić do 55 stopni C. Dodać 125 &mikro; l 1 M bufor KPO4 (pH 6,0), 50 &mikro; l 0,1 M CaCl2, 50 &mikro; l 0,1 M MgSO4 oraz 50 &mikro; l 5 mg/ml siarczanu streptomycyny do każdej probówki. Wsypać zawartość każdej probówki na szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej przez noc (jeśli jest dłuższy, przechowuj w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu).
Koraliki mikrosferyczne 0,1 mikrona	Polysciences Inc.	00876-15
Bufor M9	Różne		Mieszaniny 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Sterylizacja w autoklawie

Schroeder