Artykuł metodologiczny

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

DOI:

10.3791/51845

⸱

9 października 2014

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Wykazano, że

Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alternatywny splicing odgrywa kluczową rolę w przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT), niezbędnym programie komórkowym, który występuje w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy strategię wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT przy użyciu indukowalnego modelu EMT poprzez ekspresję represora transkrypcji Twist. EMT jest monitorowany przez zmiany w morfologii komórek, utratę lokalizacji E-kadheryny na połączeniach komórka-komórka oraz przełączoną ekspresję markerów EMT, takich jak utrata markerów nabłonkowych E-kadheryny i γ-kateniny oraz przyrost markerów mezenchymalnych N-kadheryny i wimentyny. Korzystając z zestawów starterów specyficznych dla izoformy, alternatywne składanie zainteresowanych mRNA jest analizowane za pomocą ilościowego RT-PCR. Produkcja odpowiednich izoform białek jest walidowana za pomocą testów immunoblottingowych. Opisana tutaj metoda wykrywania izoform splicingu nadaje się również do badania alternatywnego splicingu w innych procesach biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) to program rozwojowy, który napędza morfogenezę narządów i przebudowę tkanek podczas embriogenezy. W przypadku nieprawidłowej aktywacji EMT sprzyja przerzutom guza i zwłóknieniu narządów1,2. Przekonujące badania opisały znaczenie regulacji transkrypcji podczas procesu EMT, zdefiniowanego przez kilka czynników transkrypcyjnych, takich jak Twist, Snail i ZEB, które hamują ekspresję białka połączenia adherens E-kadheryny, powodując utratę morfologii nabłonka przypominającą bruk i uzyskanie wrzecionowatego fenotypu mezenchymalnego3-8. Niedawne badania przeprowadzone przez analizę całego genomu RNA ujawniły, że istnieje grupa genów, których wzorce splicingu są związane z fenotypami nabłonkowymi lub mezenchymalnymi9,10. Pracuj z naszego laboratorium, funkcjonalnie połączone alternatywne łączenie i EMT. Badając cząsteczkę adhezyjną CD44 na powierzchni komórki, wykazaliśmy, że alternatywny splicing CD44 jest ściśle regulowany podczas EMT, a co ważniejsze, że przełączanie izoform splicingu CD44 przyczynowo przyczynia się do EMT11.

Alternatywny splicing reprezentuje szeroko rozpowszechniony i konserwatywny model regulacji genów, ponieważ do 95% ludzkich genów wieloeksonowych jest alternatywnie splicingowanych12-14. Generując wiele produktów białkowych z jednego genu, alternatywny splicing stanowi niezbędny mechanizm dla różnorodności białek, dodając kolejną warstwę złożoności do ludzkiego genomu. W związku z tym rozregulowanie alternatywnego splicingu może potencjalnie prowadzić do głębokich skutków biologicznych powodujących choroby u ludzi. Rzeczywiście, nieprawidłowy alternatywny splicing w chorobach jest dokumentowany od ponad dekady15-25, w tym niedawne odkrycia, że mutacje w genach kodujących maszynerię spliceosomów są powszechnie spotykane w zespołach mielodysplastycznych26-28. Dlatego opracowanie wiarygodnych metod wykrywania alternatywnie splicowanych izoform ma ogromne znaczenie w badaniu różnych procesów biologicznych, w tym EMT.

Tutaj udostępniamy protokół do wykrywania zmian w alternatywnym splicingu za pomocą indukowalnego modelu EMT. Metody projektowania starterów PCR i wykrywania izoform splicingu są odpowiednie nie tylko do badania alternatywnego splicingu podczas EMT, ale także do badania alternatywnego splicingu w innych procesach biologicznych. Badanie alternatywnego splicingu podczas EMT jest konieczne, aby lepiej zrozumieć mechanizmy EMT i przerzutów nowotworowych, ułatwiając w ten sposób opracowanie skutecznych strategii leczenia przerzutów raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa indukcji EMT

Uwaga: EMT może być wywołane przez leczenie TGFβ lub ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych Twist, Snail, lub Zeb1/2 w komórkach nabłonkowych. W tym protokole opisano indukowalny system EMT poprzez ekspresję białka fuzyjnego Twist-ER w unieśmiertelnionych ludzkich komórkach nabłonka sutka (HMLE / Twist-ER, dar dr J Yanga, UCSD)9,11,29. Po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem (TAM) białko fuzyjne Twist-ER przemieszcza się do jądra w celu napędzania transkrypcji i powoduje pełne przejście EMT w ciągu 12-14 dni9,11,29. Dodatkowe systemy indukowane EMT, takie jak HMLE/Snail-ER, HMLE/TGFβ i MCF10A/TGFβ, można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach11,30.

  1. Utrzymuj komórki HMLE/Twist-ER w pożywce do wzrostu komórek nabłonka sutka bez surowicy (MEGM) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Przenikaj komórki co 2-3 dni, gdy osiągną 80% konfluencji. Inkubować komórki z 0,15% trypsyną w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, a następnie dezaktywować trypsynę 5% surowicą cielęcą/DMEM. Odkręć komórki i ponownie je zawieś w MEGM. Komórki płytki w nowym naczyniu do hodowli tkankowej w stosunku 1 do 4.
  2. Rozpuść TAM w etanolu, aby uzyskać roztwór o wielkości 200 μM. Chronić TAM przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem świeżo dodać TAM do pożywki MEGM w rozcieńczeniu 1:10 000, aby uzyskać końcowe stężenie 20 nM TAM.
  3. Do indukcji EMT, płytka 1,6 x 106 komórek HMLE/Twist-ER do 10 cm naczynia do hodowli tkankowej w dwóch egzemplarzach. Komórki hodowlane z pożywką MEGM zawierającą 20 nM TAM.
  4. Umieść 1,6 x 106 komórek HMLE/Twist-ER w 10-centymetrowej naczyniu w dwóch egzemplarzach i potraktuj komórki 0,01% etanolem jako kontrolę bez TAM.
  5. Dwa dni po inkubacji zrób zdjęcia pod mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu, aby zarejestrować zmiany morfologiczne komórek.
  6. Odessać pożywkę z jednego naczynia z komórkami kontrolnymi lub poddanymi działaniu TAM. Umyj komórki zimnym PBS i zbierz komórki, złomując połowę płytki w buforze do lizy RNA w celu izolacji RNA, a drugą połowę w buforze RIPA do analizy białek.
  7. Przejście komórek z naczyń kontrolnych lub naczyń poddanych działaniu TAM poprzez ponowne posiew 1,6 x 106 komórek w naczyniu o średnicy 10 cm w dwóch egzemplarzach. Stale traktuj komórki 20 nM TAM lub nośnikiem.
  8. Powtarzaj kroki od 5 do 7 raz na drugi dzień aż do 14 dnia, kiedy to komórki Twist-ER traktowane TAM wykazują mezenchymalną morfologię w kształcie wrzeciona, podczas gdy komórki kontrolne traktowane podłożem utrzymują morfologię nabłonka przypominającą bruk
    9. .

2. Charakterystyka EMT

Uwaga: Ukończenie EMT jest sygnalizowane przez: (1) Zmiany morfologiczne komórek z morfologii nabłonka przypominającej bruk na wrzecionowaty wygląd podobny do fibroblastycznego; (2) Utrata lokalizacji E-kadheryny na połączeniach komórka-komórka; oraz (3) Przełączona ekspresja markerów EMT, zdefiniowana przez utratę markerów nabłonkowych i zysk markerów mezenchymalnych.

Zmiany morfologiczne komórek są rejestrowane przez mikroskop świetlny przy 10-krotnym powiększeniu podczas przebiegu indukcji EMT, opisanego w sekcji 1. Immunofluorescencyjna detekcja E-kadheryny na połączeniach komórkowych została opisana w tym rozdziale. Ekspresja markerów EMT jest wykrywana przez immunoblotting. Typowymi markerami nabłonkowymi są E-kadheryna, γ-katenina i okludyna, a markery mezenchymalne obejmują fibronektynę, N-kadherynę i wimentynę. Ogólne procedury immunoblottingu opisano w punkcie 4.

  1. W 12 dniu po zastosowaniu TAM wysiewać nasiona 1 x 105 komórek na okrągłym szkiełku nakrywkowym o średnicy 12 mm umieszczonym w studzience z 24-dołkową płytką.
  2. 48 godzin po wysiewie odessać pożywkę i przemyć komórki wstępnie podgrzanym PBS.
  3. Utrwal komórki za pomocą podgrzanego 4% paraformaldehydu przez 15 minut.
  4. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
  5. Inkubować komórki z 0,2% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
  7. Inkubować komórki w 5% BSA/PBS przez 1 godzinę w RT, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
  8. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem E-kadheryną w rozcieńczeniu 1:50 w 1% BSA/PBS w wilgotnej komorze O/N w temperaturze 4 °C. UWAGA: Zakres rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego wynosi zwykle od 1:50 do 1:200, a optymalne rozcieńczenie dla każdego przeciwciała należy określić doświadczalnie.
  9. Zdekantować przeciwciało pierwotne i trzykrotnie przemyć komórki PBS.
  10. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie w rozcieńczeniu 1:500 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Od tego kroku chroń komórki przed światłem.
  11. Zdekantować przeciwciało drugorzędowe i przemyć trzykrotnie PBS.
  12. Wybarwić komórki 0,1-1 g/ml DAPI lub Hoechst przez 10 min.
  13. Przepłukać komórki trzykrotnie PBS.
  14. Zamontuj szkiełka nakrywkowe z kroplą podłoża montażowego i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
  15. Obserwuj komórki i rób zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym 63x.

Można przeprowadzić barwienie dodatkowymi przeciwciałami, aby potwierdzić fenotyp EMT. Na przykład N-kadheryna i aktyna α mięśni gładkich mogą być barwione pod kątem fenotypu mezenchymalnego29,31,32. Reorganizację struktury cytoszkieletu można monitorować poprzez barwienie komórek falloidyną na F-aktynę11. Ponadto można przeprowadzić testy ruchliwości komórek i odporności na śmierć komórkową w celu zbadania właściwości EMT11.

3. Wykrywanie izoform spliców za pomocą testów qRT-PCR

  1. Wzór podkładu
    UWAGA: Pary starterów powinny być starannie zaprojektowane, aby wzmacniać różne izoformy splicingu. Przeskakiwanie eksonów, najczęściej obserwowane alternatywne zdarzenie splicingu, jest pokazane tutaj jako przykład ilustrujący strategię projektowania starterów. Rysunek 1A przedstawia czteroeksonowy pre-mRNA, z trzecim eksonem jako eksonem zmiennym. Włączenie eksonu 3 powoduje wytworzenie dłuższej izoformy splicingu, podczas gdy pominięcie eksonu 3 generuje krótszą izoformę splicingu. Startery muszą być zaprojektowane tak, aby odróżnić izoformę zawartą w eksonie-3 i izoformę pominiętą w eksonie-3 oraz wykryć całkowity transkrypt tego mRNA.
    1. W celu wykrycia inkluzji eksonu należy starannie zaprojektować starter do przodu wewnątrz zmiennego eksonu 3 i starter odwrotny wewnątrz pobliskiego konstytutywnego eksonu 4, co pozwala na specyficzne wzmocnienie izoformy zawartej w zmiennym eksonie. Upewnij się, że nie projektujesz zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu w tym samym zmiennym eksonie, aby uniknąć produktów PCR amplifikowanych z genomowego DNA lub pre-mRNA.
    2. Aby specjalnie wzmocnić zdarzenia pomijania eksonów, zaprojektuj jeden ze starterów obejmujący połączenie konstytutywnego eksonu 2 i eksonu 4, który w przeciwnym razie zostałby zniszczony, gdy uwzględniony jest zmienny ekson 3. Zaprojektuj drugi starter wewnątrz konstytutywnego eksonu 4. W związku z tym produkty PCR są wytwarzane tylko wtedy, gdy wykluczony jest ekson zmienny 3, a następnie połączone ze sobą konstytutywne ekson 2 i ekson 4.
    3. Aby wykryć całkowite transkrypty genu, zaprojektuj startery w dwóch konstytutywnych eksonach 1 i 2. W ten sposób produkty PCR są amplifikowane ze wszystkich izoform.
    4. Upewnij się, że temperatura topnienia (Tm) dla wszystkich starterów wynosi około 55 °C, długość każdego startera wynosi około 18-22 nukleotydów, a wielkość produktów PCR wynosi od 80 do 150 par zasad.
  2. Ekstrakcja RNA: Ekstrakcja RNA za pomocą zestawu do całkowitej izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
    1. Zbierz komórki w buforze do lizy RNA o pojemności 350 μl.
    2. Do lizatu dodać 350 μl 70% etanolu i dokładnie wymieszać.
    3. Przenieść próbkę do kolumny oczyszczającej RNA.
    4. Odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę i odrzucić przepływ.
    5. Przemyć kolumnę raz 500 μl buforu do przemywania RNA I i dwukrotnie buforem do przemywania RNA II.
    6. Usunąć resztki buforu płuczącego RNA II z kolumny przez odwirowanie z maksymalną prędkością przez 2 minuty.
    7. Przenieść kolumnę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, dodać 50 μl wody wolnej od nukleaz do środka matrycy kolumny i wymyć RNA przez odwirowanie z maksymalną prędkością.
  3. Synteza pierwszej nici cDNA
    1. Określ stężenie i jakość RNA za pomocą pomiaru absorpcji UV. UWAGA: Dobrej jakości RNA powinno mieć współczynnik absorbancji 260 nm / 280 nm wynoszący około 2,0.
    2. Skonfiguruj reakcje odwrotnej transkryptazy (RT), które zawierają 250 ng całkowitego RNA, 0,05 μg losowych starterów heksameru, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 μl 5× buforu GoScript i 1 μl enzymu RT w końcowej objętości 20 μl.
    3. Przeprowadzać reakcje RT w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę, a następnie inkubację w temperaturze 70 °C przez 5 minut w celu inaktywacji enzymu RT.
  4. PCR w czasie rzeczywistym
    1. Przygotuj 20 μl reakcji, które składają się z 10 μl zielonej mieszanki głównej SYBR, 0,1-1,0 μl matrycy cDNA oraz 5 pmol starterów do przodu i do tyłu.
    2. Uruchom PCR w czasie rzeczywistym z 40 cyklami następujących kroków: denaturacja w 95 °C przez 10 sekund, wyżarzanie w 58 °C przez 10 sekund i przedłużenie w 60 °C przez 30 sekund. Wykonaj reakcje PCR w trzech powtórzeniach.
    3. Sprawdź krzywe dysocjacji i upewnij się, że dla każdego zestawu starterów zaobserwowano pojedynczy pik.
    4. Wartości cyklu kwantyfikacji (Cq) należy uzyskać, obliczając wartości drugiej pochodnej krzywych amplifikacji.
    5. Obliczyć względną ilość (RQ) docelowych mRNA w próbkach indukowanych w porównaniu z próbką nieindukowaną, stosując metodę "delta delta Cq (ΔΔCq)", jak pokazano za pomocą poniższego wzoru. Użyj genów porządkowych, takich jak GAPDH lub TBP, jako odniesienia.

figure-protocol-1
Aby dokładniej obliczyć względne wartości izoform splicingu, należy rozważyć zastosowanie wielu genów referencyjnych. Wyniki można analizować przy użyciu zmodyfikowanej metody kwantyfikacji wartości bezwzględnej opisanej przez Pfaffla i wsp. 33,34.

4. Badanie izoform spliców na poziomie białka

  1. Zbierz komórki w lodowatym buforze RIPA o pojemności 100 μl.
  2. Ustaw lizaty na lodzie na około 10 minut.
  3. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
  4. Zmierz stężenie białka za pomocą testów Bradforda.
  5. Rozcieńczyć próbki białek w buforze ładującym SDS i załadować 20-40 μg białek do 10% żeli SDS-PAGE.
  6. Uruchom żele SDS-PAGE pod ciśnieniem 20 mA przez 1,5 godziny.
  7. Przenieść białka do membran PVDF w mokrym układzie transferowym w temperaturze 4 °C przez 3 godziny przy napięciu 85 V. Dostosuj czas transferu do masy cząsteczkowej docelowych białek.
  8. Zablokuj membranę w 5% beztłuszczowym mleku na 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze 4 °C O/N. Zakres rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych wynosi zwykle od 1:200 do 1:5,000, należy eksperymentalnie określić optymalne rozcieńczenie dla każdego przeciwciała. Rozcieńczenie przeciwciał stosowanych w tym protokole można znaleźć w "Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu".
    1. Aby wykryć izoformy splicingu, użyj specyficznych przeciwciał, które rozpoznają określoną izoformę. Alternatywnie można użyć przeciwciała, które rozpoznaje epitop w konstytutywnym regionie kodującym egzon i jednocześnie wykrywać izoformy splicingu na podstawie ich różnych rozmiarów białek.
    2. W tym samym czasie monitoruj EMT poprzez immunoblotting pod kątem markerów EMT. Użyj E-kadheryny, γ-kateniny i okludyny jako markerów nabłonkowych, a fibronektyny, N-kadheryny i wimentyny jako markerów mezenchymalnych.
  10. Umyj membranę trzykrotnie TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) w odstępie 5 minut.
  11. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu 1:10 000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  12. Umyć membranę trzykrotnie TBS-T w odstępach 5-minutowych.
  13. Wizualizuj białko za pomocą systemu detekcji chemiluminescencji i wystaw błonę na film autoradiograficzny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury opisane powyżej zapewniają solidną metodę wykrywania alternatywnego łączenia podczas EMT. Poniżej przedstawiono przykładowe wyniki przełączania izoformy splicingu CD44 podczas EMT wywołanego skrętem.

EMT wywołany skrętem w komórkach HMLE/Twist-ER charakteryzował się przejściem od fenotypu nabłonka przypominającego bruk do wydłużonego fenotypu fibroblastycznego (Figura 2A), brakiem markerów nabłonkowych E-kadheryny, γ-kateniny i okludyny oraz regulacją w górę mezenchy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj procedura umożliwia wykrycie alternatywnego splicingu w indukowalnym modelu EMT. W związku z tym dynamiczne zmiany ekspresji izoformy splicingu mogą być uchwycone w całym przebiegu czasu EMT. Metoda ta ma przewagę nad stosowaniem różnych linii komórkowych reprezentujących nabłonek lub mezenchymal do porównania alternatywnego splicingu, ponieważ odrębne tła genetyczne z niespokrewnionych linii komórkowych mogą nadmiernie wpływać na alternatywne splicing. Jednak udana indukcja EMT musi zostać dokładnie potwie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Wensheng Liu za nieocenioną pomoc w obrazowaniu komórek. Praca ta była wspierana przez granty z amerykańskich National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation i A Sister's Hope Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-hydroksytamoksyfenSigmaH7904Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając 4-hydroksytamoksyfen w etanolu do 200 μM. Utrzymywać roztwór na poziomie -20 ° C chroniony przed światłem.
E.Z.N.A. Zestaw do izolacji całkowitego RNAOmega Bio-TekR6731Zestaw do izolacji całkowitego RNA
System odwrotnej transkrypcji GoScriptPromegaA5001do testu qRT-PCR
Odczynnik GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002do testu qRT-PCR
System LightCycler 480 do PCR w czasie rzeczywistymdo testu qRT-PCR
Przeciwciało CD44R& D SystemsBBA10Rozcieńczenie 1:1,000
Przeciwciało E-kadherynyTechnologia sygnalizacji komórkowej4065Rozcieńczenie 1:2,500 do immunoblottingu; Rozcieńczenie 1:50 dla immunofluorescencji
γ-kateninyprzeciwciało Cell Signaling Technology23091:1,000 rozcieńczenie
Przeciwciało okludynySanta Cruz Biotechnology Inc.sc-55621:500 rozcieńczenie
przeciwciało fibronektynyLaboratoria Transdukcji BD 610077rozcieńczenie 1:5,000
przeciwciało N-kadherynyLaboratoria transdukcji BD6109201:2,000 rozcieńczenie
Przeciwciało wimentynyNeoMarkersMS-129-p11:500 przeciwciało
GAPDHMillipore CorporationMAB374rozcieńczenie 1:10 000
Odczynnik do wykrywania blottingu Amasham ECL Western SystemchemiluminescencjiGE Health Life ScienceRPN2209
Odczynnik Sprzęt Roche

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218(2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19(2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Quantitative RT PCRImmunoblotting AssaysIsoform Specific PrimersEMT MarkersCD44 Splice IsoformsTwist Inducible ModelTamoxifen TreatmentCell Morphology Analysis

Powiązane artykuły