Artykuł metodologiczny

Ocena wytrzymałości wysiłkowej myszy bez użycia siatki uderzeniowej: alternatywa dla ćwiczeń wymuszonych

19.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51846

⸱

14 sierpnia 2014

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano metodę oceny wytrzymałości wysiłkowej u myszy laboratoryjnych bez użycia siatki uderzeniowej. Metoda ta jest humanitarnym udoskonaleniem, które może zmniejszyć zakłócający wpływ stresu na parametry eksperymentalne.

Streszczenie

Korzystając z laboratoryjnych modeli mysich, zaczyna się definiować szlaki molekularne odpowiedzialne za metaboliczne korzyści płynące z ćwiczeń wytrzymałościowych. Najczęstszą metodą oceny wytrzymałości wysiłkowej u myszy jest wymuszony bieg na zmotoryzowanej bieżni wyposażonej w siatkę amortyzacyjną. Zwierzęta, które przestają biegać, są popychane przez ruchomy pas bieżni na siatkę, która zapewnia elektryczny wstrząs stopy; Aby uciec przed negatywnym bodźcem, myszy wracają do biegania na pasku. Jednak zachowania unikające i stres psychologiczny spowodowany użyciem aparatu uderzeniowego mogą zakłócać ilościowe określanie wytrzymałości biegowej, a także zakłócać pomiary poziomu hormonów i cytokin w surowicy po wysiłku. W tym miejscu demonstrujemy i walidujemy udoskonaloną metodę pomiaru wytrzymałości biegowej u naiwnych myszy laboratoryjnych C57BL/6 na zmotoryzowanej bieżni bez użycia siatki wstrząsów. Kiedy myszy są wstępnie zaaklimatyzowane na bieżni, biegają dobrowolnie z prędkością chodu specyficzną dla każdej myszy. Użycie siatki uderzeniowej zostało zastąpione delikatną zachętą przez operatora za pomocą depresora języka, w połączeniu z wrażliwością na dobrowolną gotowość do biegania ze strony myszy. Wyraźne punkty końcowe do ilościowego określania czasu biegu do wyczerpania dla każdej myszy są zdefiniowane i odzwierciedlone w behawioralnych oznakach wyczerpania, takich jak rozłożona postawa i ciężkie oddychanie. Metoda ta jest humanitarnym udoskonaleniem, które zmniejsza również zakłócający wpływ stresu na parametry eksperymentalne.

Wprowadzenie

Otyłość, insulinooporność i cukrzyca typu 2 to powiązane ze sobą zaburzenia metaboliczne, które wywierają głęboki wpływ na zdrowie zarówno populacji amerykańskiej, jak i światowej 1-4. Ćwiczenia wytrzymałościowe mogą zapobiegać tym schorzeniom, a także je leczyć5,6. Ponadto ocena szybkości i wytrzymałości chodu jest wykorzystywana klinicznie jako testy diagnostyczne słabości, sarkopenii i konsekwencji innych zaburzeń, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc, u ludzi 7.

Szlaki biochemiczne leżące u podstaw korzystnego wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na skład ciała i wrażliwość na insulinę zaczynają być wyjaśniane, przy użyciu genetycznie lub farmakologicznie zmodyfikowanych myszy, które wykazują zwiększoną lub zmniejszoną zdolność wysiłkową 8-11. Jednak wiele takich badań wykorzystywało zmotoryzowane bieżnie wyposażone w siatki uderzeniowe, aby zmusić myszy do biegania 8-11. Zwierzęta, które przestają biegać, są popychane przez ruchomy pas bieżni na siatkę, która zapewnia elektryczny wstrząs stopy; Aby uciec przed negatywnym bodźcem, myszy wracają do biegania na pasku. Takie procedury mogą wprowadzać stres psychologiczny i zachowania unikające jako czynniki zakłócające wpływające na parametry eksperymentalne12. Inne metody pomiaru wytrzymałości, takie jak kwantyfikacja aktywności ambulatoryjnej za pomocą aparatu do przerywania wiązki lub kwantyfikacja biegu w klatce, mogą być zakłócone przez modulację cykli okołodobowych, lęk, niezamierzony treninglub zachowania związane z poszukiwaniem pożywienia. Co więcej, procedury te wymagają pojedynczego trzymania, co jest kolejnym źródłem stresu psychicznego dla myszy. Dlatego potrzebny jest bezpośredni pomiar wytrzymałości wysiłkowej, która nie jest zakłócona przez stres.

Aby uniknąć tych problemów, nasze laboratorium opracowało i zatwierdziło metodę oceny maksymalnej zdolności do biegania i utrzymania prędkości biegu u niewytrenowanych, naiwnych myszy korzystających z bieżni z napędem silnikowym, która nie jest wyposażona w siatkę amortyzatorów. Przestrzeń na końcu pasa bieżni, w której zwykle znajduje się siatka uderzeniowa, staje się platformą do odpoczynku dla myszy i zapewnia miejsce dla myszy, które odmawiają biegania, aby usiąść, dopóki nie zostaną usunięte z aparatu. Myszy są zachęcane do biegania przez ludzkiego obserwatora za pomocą delikatnego stukania lub dotykania depresorem języka, w połączeniu z wrażliwością na dobrowolną gotowość do biegania ze strony myszy. Metoda ta została wykorzystana do ilościowego określenia różnic w wytrzymałości wysiłkowej między genetycznie zmodyfikowanymi i kontrolnymi myszami C57BL / 6, które różnią się ekspresją cytokiny pochodzącej z mięśni interleukiny-15 (IL-15)16,17. Ta metoda jest humanitarnym udoskonaleniem, które zmniejsza mylące skutki negatywnego wzmocnienia spowodowanego użyciem siatki uderzeniowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedura opisana tutaj została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt VA Puget Sound Institutional i jest zgodna z Przewodnikiem ILAR dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Zdecyduj wcześniej, czy konieczne jest pobranie krwi lub tkanek wkrótce po wysiłku, a jeśli tak, określ odstęp czasu po wysiłku na przeprowadzenie takich procedur. Przykłady obejmują określenie indukowanego wysiłkiem uwalniania hormonów lub cytokin do krążenia (konieczność pobrania krwi), określenie wywołanej wysiłkiem fizycznym ekspresji gatunków mRNA będących przedmiotem zainteresowania (konieczność eutanazji, a następnie pobrania tkanek). Jeśli wskazane jest pobranie krwi lub tkanek bezpośrednio po wysiłku, należy mieć pod ręką materiały do tych zabiegów w sali zabiegowej. Uzyskaj zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej i działaj zgodnie z wytycznymi regulacyjnymi. Nie wszystkie eksperymenty wymagają pobrania krwi lub tkanek po wysiłku; Proste porównanie wytrzymałości biegowej może być wszystkim, czego potrzeba.
  2. Zdecyduj z wyprzedzeniem o grupach eksperymentalnych i procedurach poćwiczeniowych dla myszy (patrz opis powyżej).
  3. Umieść bieżnię na solidnym stole w cichym pomieszczeniu przeznaczonym do tej procedury podczas prób biegowych.
  4. Ustaw bieżnię na pasy wielkości myszy i pod kątem odpowiednim do protokołu. Nachylenie +5o jest tutaj wykorzystywane do zapobiegania uszkodzeniom mięśni spowodowanym ćwiczeniami ekscentrycznymi (wydłużanie mięśnia w tym samym czasie co skurcz), które występują podczas biegania w dół.
  5. Umieść chłonną wkładkę pod pasem bieżni, aby złapać kał.

2. Aklimatyzacja myszy do bieżni

Zdecyduj, czy konieczna jest grupa myszy prowadzących siedzący tryb życia (bez ćwiczeń), i wystaw myszy prowadzące siedzący tryb pracy na bieżni bez biegania, jak opisano w krokach 2.1 - 2.5. Określ, czy wymagane są 2 lub 4 grupy eksperymentalne, np. Siedzący tryb życia/ćwiczenia (2 grupy); Ćwiczone kontrole/ćwiczone leczenie (2 grupy, bez zwierząt prowadzących siedzący tryb życia); lub siedzący tryb życia / ćwiczenia x kontrola / leczenie (4 grupy). "Leczeniem" może być genotyp transgeniczny lub nokautujący, schemat farmakologiczny, specjalna dieta lub inna eksperymentalna interwencja.

  1. Pozwól myszy zaaklimatyzować się w sali zabiegowej w przetransportowanej klatce domowej, z kolegami z klatki, przez 1-2 godziny.
  2. Wybierz pojedynczą mysz i zapisz numer znacznika; zważ mysz i zapisz wagę.
  3. Umieść mysz w bieżni bez włączonego silnika w celu aklimatyzacji, około 5 minut. Włącz zasilanie, bez uruchomionego pasa bieżni i pozwól myszy przyzwyczaić się do hałasu maszyny przez kolejne 5 minut.
  4. W tym momencie usuń myszy z grup "siedzących" (jeśli są używane; patrz uwaga 1) z bieżni i wróć je do klatki lub przeprowadź procedury po ćwiczeniach zgodnie z projektem eksperymentalnym (patrz uwaga 2).

3. Rozpoczęcie testu Run-to-Exhaustion

  1. Po aklimatyzacji przekręć pas na niską prędkość (10 m/min), gdy zwierzę eksploruje pas, a nie na platformie.
  2. Delikatnie postukaj lub unieś tylne kończyny myszy za pomocą depresora języka, jeden do trzech razy, aby zachęcić niechętne zwierzęta do pozostania na bieżni i biegania.
    UWAGA: Większość myszy biega z łatwością, ale czasami zatrzymują się na krótkie okresy. W takim przypadku użyj depresora języka, aby delikatnie postukać lub podnieść tył zwierzęcia, aby zachęcić do wznowienia biegu. Często myszy nie trzeba dotykać depresorem języka; Zauważenie zbliżającej się do nich ręki z depresorem języka powoduje, że myszy biegają jeszcze trochę.
  3. Uruchom stoper laboratoryjny, gdy mysz pracuje z początkową prędkością 10 m/min.
  4. Powoli zwiększaj prędkość, gdy mysz znajduje się na górze (pod górę) paska, w krokach co 1 m/min, mniej więcej co 2 minuty.
  5. Zmniejsz szybkość do poprzedniego ustawienia, jeśli mysz wielokrotnie uruchamia się w krótkich seriach, a nie w stałym tempie.
  6. Określ maksymalną stałą prędkość biegu każdej myszy (zwykle 14 - 17 m/min dla myszy C57BL/6), dostosowując prędkość i obserwując mysz. Zapisz tę prędkość.
    UWAGA: Położenie zwierzęcia na bieżni wskazuje badaczowi co do gotowości zwierzęcia do biegania z większą prędkością. Jeśli mysz znajduje się na drugim końcu (pod górę) i ma zamiar wbiec na ścianę, jest gotowa do biegu z większą prędkością. Jeśli mysz biega w stałym tempie na środku bieżni, może osiągać maksymalną prędkość lub wymagać dalszej regulacji, w zależności od jakości biegu.

4. Punkty końcowe i myszy, które się zatrzymują

  1. Za pomocą depresora języka delikatnie postukać lub unieść tylne kończyny zwierząt, które się zatrzymują, aby zachęcić do wznowienia biegu (zob. uwaga 3.2). Nie zatrzymuj timera w przypadku tymczasowych przerw w działaniu.
  2. Zidentyfikuj i usuń myszy, które odmawiają biegania. Zwróć na to uwagę w karcie katalogowej. W zależności od projektu eksperymentalnego, myszy, które odmówią, mogą zostać ponownie przetestowane w innym dniu
    UWAGA: Niektóre myszy całkowicie odmawiają biegu. Takie myszy będą biegać w krótkich seriach, a następnie zatrzymują się, aby oczyścić lub "pedałować", to znaczy usiąść na platformie i używać przednich nóg na pasie. Postawa tych myszy jest zgarbiona, ze wszystkimi czterema stopami umieszczonymi pod zwierzęciem, aby nie zostać wepchniętym z powrotem na bieżnię przez depresor języka. Czasami mysz staje się agresywna w stosunku do depresora języka, gdy nie chce uciekać, gryzie depresor języka lub wspina się na niego jako sposób ucieczki. W ciągu pierwszych 5 minut próby staje się jasne, czy mysz będzie działać, czy nie. Usuń myszy, które odmawiają ucieczki, z analizy, ale nie licz ich jako myszy "siedzących".
  3. Zidentyfikuj wyczerpane myszy i zatrzymaj stoper.
    UWAGA: Wyczerpanie definiuje się jako trzy następujące po sobie zatrzymania i odmowę wznowienia biegu pomimo delikatnej zachęty, a także fizyczne oznaki wyczerpania, takie jak ciężki oddech i rozłożona postawa. Myszy wracają do zdrowia po wyczerpaniu w ciągu 30 do 60 minut.
  4. Zapisz całkowity czas spędzony na bieganiu ze wszystkimi prędkościami.
  5. W zależności od projektu eksperymentalnego, albo należy zwrócić mysz do klatki, albo przeprowadzić natychmiastowe procedury powysiłkowe, takie jak pobranie krwi lub tkanki, zgodnie z wytycznymi instytucji.
  6. Wytrzyj pasek do czysta chusteczką bakteriobójczą po przetestowaniu każdej myszy z osobna, aby zapach poprzedniej myszy nie wpływał na zachowanie kolejnych testowanych myszy.
  7. Przetestuj następną mysz. Użyj nowego depresora języka dla każdej myszy. Myszy, które przebywają w tej samej klatce, mogą być testowane sekwencyjnie tego samego dnia bez dodatkowej aklimatyzacji do sali zabiegowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza procedura pomiaru wytrzymałości wysiłkowej dokładnie odzwierciedla profil molekularny i metaboliczny różnych szczepów myszy C57BL/6, które różnią się ekspresją cytokiny IL-15 16,17. Myszy transgeniczne z nadekspresją IL-15 (myszy IL-15 TG) wykazują znacznie wydłużony czas biegu do wyczerpania w porównaniu z kontrolnymi myszami z tego samego miotu, podczas gdy myszy z brakiem IL-15 (myszy IL-15 KO) wykazują znacznie skrócony czas biegu przed osiągnięciem wyczerpania (Rysunek 1A). Opub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano tutaj metodę oceny wytrzymałości podczas dobrowolnego biegania u myszy laboratoryjnych przy użyciu zmotoryzowanej bieżni bez użycia siatki wstrząsów. Metoda ta może ujawnić różnice między podliniami myszy C57BL / 6, które różnią się ekspresją cytokiny IL-15, co z kolei powoduje różnice w ekspresji czynników leżących u podstaw wytrzymałości wysiłkowej16,17. Zgodnie z zasadami "trzech R" w naukach o zwierzętach laboratoryjnych, metoda ta może być stosowana jako bardziej humanitarna alternatywa lub udosko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wspierane przez Merit Review #BX001026 z Departamentu Spraw Weteranów (LSQ) oraz wykorzystanie zasobów i obiektów w VA Puget Sound Health Care System, Transgenic Resource Core w University of Washington Nathan Shock Center of Excellence in the Basic Biology of Aging (NIA #5P30AG-013280) oraz University of Washington Diabetes Endocrinology Research Center (NIH #P30 DK-17047). Dziękujemy Cynthii Pekow DVM i Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, które udzieliły pomocnych komentarzy do manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Otwarta bieżnia dla gryzoni Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMTen numer katalogowy dotyczy modeli bez siatki amortyzatorów. Kratki przeciwwstrząsowe można usunąć ręcznie ze starszych modeli (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYzwykle zamawiane za pośrednictwem lokalnego zakładuZawiera 10% alkoholu izopropylowego; można użyć dowolnego równoważnego produktu.
Depresory językaDowolny lokalny dostawca
Zegar laboratoryjnyDowolny dostawca
Myszy IL-15 TG *JAX, Bar Harbor, ME011002Mysi transgen IL-15 ulegający ekspresji ze zmodyfikowanego ludzkiego promotora aktyny alfa-szkieletowej ze zmienioną sekwencją sygnałową ułatwiającą wydzielanie.
Myszy C57BL/6J (typ dziki)*JAX, Bar Harbor, ME000664Myszy kontrolne dla myszy IL-15 TG
IL-15 KO*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MHomozygotyczne myszy z IL-15 "nokaut" na tle C57BL/6
C57BL/6NTac (typ dziki)*Taconic Farms, Germantown, NYMyszy kontrolne B6-Mdla IL-15 KO*
Opcjonalnie; linie myszy i zabiegi mogą być specyficzne dla eksperymentu protokół.

Bibliografia

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bie nia dla myszydobrowolne bieganiealternatywa dla siatki elektrycznejaklimatyzacja do bie nipunkty ko cowe wyczerpaniatransgeniczne IL 15maksymalna pr dko sta adelikatne zach canieczas do wyczerpania

Powiązane artykuły