Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

Podsumowanie

Wyjaśniono nowatorską metodę zmniejszania zmienności podczas wystawiania ryb na działanie narkotyków. Stwierdzono, że ryby wystawione na różne wzorce ekspozycji na etanol miały zmieniony poziom lęku podczas odstawienia w teście skotoksji jasnej/ciemnej.

Streszczenie

Testy lękowe u danio pręgowanego są często badane w połączeniu z zastosowaniem substancji farmakologicznych. W tych badaniach ryby są rutynowo łowione w sieci i transportowane między domowymi akwariami a zbiornikami dozującymi. Aby ułatwić podawanie związków, opracowano nowatorską metodę przenoszenia ryb między zbiornikami w celu podawania leków. Wkładki, które są przeznaczone do tarła, zostały użyte do przeniesienia grup ryb do roztworu leku, umożliwiając dokładne dozowanie wszystkich ryb w grupie. Zwiększa to precyzję i skuteczność dawkowania, co staje się bardzo ważne w przypadku długich harmonogramów wielokrotnego podawania leków. Wdrożyliśmy tę procedurę do wykorzystania w badaniu oceniającym zachowanie danio pręgowanego w teście jasnym/ciemnym po podaniu etanolu w różnych 21-dniowych harmonogramach. U ryb narażonych na dzienne umiarkowane ilości alkoholu stwierdzono istotną różnicę w preferencjach lokalizacyjnych po 2 dniach od odstawienia w porównaniu z grupą kontrolną. Nie zaobserwowano jednak istotnej różnicy w preferencjach lokalizacyjnych w grupie narażonej na cotygodniowe podawanie w napadach objadania się.

Ten protokół można uogólnić do stosowania ze wszystkimi rodzajami związków, które są rozpuszczalne w wodzie i może być stosowany w każdej sytuacji, gdy badane jest zachowanie ryb podczas lub po długich okresach podawania leków. Test jasny/ciemny jest również cenną metodą oceny zmian lękowych wywołanych odstawieniem.

Wprowadzenie

Danio rerio (Danio rerio) to mały gatunek teleost pochodzący z Indii, który jest użytecznym organizmem modelowym do badań behawioralnych¹ i medycznych^2,3. Danio pręgowany jest również powszechnie stosowany w testowaniu różnych substancji farmakologicznych w celu scharakteryzowania ich wpływu na zachowanie. Do zbadania zachowania danio pręgowanego po podaniu związków takich jak stymulanty⁴, przeciwlękowe⁵ i etanol^6-8 zastosowano różne dawki i schematy podawania leków.

Nasze laboratorium zbadało wpływ różnych schematów podawania etanolu na lęk i lokomocję danio pręgowanego w dobrze zweryfikowanym teście światło/ciemność ^9,20, powszechnie nazywanym również testem scototaksyjnym. Opracowano nową metodę podawania etanolu w celu zwiększenia skuteczności w przypadku powtarzalnego, codziennego podawania przez długi okres czasu (21 dni)⁶. Wcześniej stosowane metody były praktyczne, jednak staraliśmy się opracować metodę, która ograniczyłaby stosowanie sieci i związane z tym koszty czasowe i umożliwiła jednoczesne, precyzyjnie określone w czasie podawanie interesującego leku dużej liczbie ryb. W tradycyjnych badaniach z użyciem etanolu danio pręgowany jest sadzany w sieć i przenoszony z jednego zbiornika do drugiego zawierającego odpowiednią mieszaninę etanolu i wody^10-12. Chociaż metoda ta jest powszechnie akceptowana, chwytanie sieciami danio pręgowanego może zwiększyć zmienność czasu potrzebnego do wprowadzenia i usunięcia ryby z roztworu leku. W związku z tym dokładna ekspozycja na związek będący przedmiotem zainteresowania może się różnić w trakcie eksperymentu obejmującego wielokrotne dawkowanie. Pożądana jest zatem metoda, która ogranicza źródła błędów wynikające ze zmienności czasu transportu. Dzięki naszej metodzie jesteśmy w stanie przemieścić wszystkie ryby jednocześnie, co skutkuje identycznym czasem dozowania każdej ryby. Po ekspozycji na etanol (opisanej tutaj) danio pręgowany może być testowany w dowolnej liczbie testów behawioralnych, w tym tych, które oceniają lęk. Dozowanie grup ryb przy użyciu nowej metody ma praktyczne zastosowania wykraczające poza możliwość dokładnego odtworzenia i standaryzacji dawkowania między osobami badanymi i między grupami ryb. Pojawienie się nowego oprogramowania, które pozwala na śledzenie wielu ryb jednocześnie, może sprawić, że naukowcy będą wykorzystywać nasze metody, aby zapewnić powtarzalność i dokładność swoich eksperymentów. Biorąc pod uwagę powszechne zastosowanie danio pręgowanego jako organizmu modelowego w neuronauce behawioralnej, metoda ta zwiększy skuteczność i praktyczność w przyszłych badaniach farmakologicznych.

W obecnym paradygmacie zastosowano powtarzający się schemat dawkowania, który w przybliżeniu odzwierciedla harmonogramy picia u ludzi. Ryby zostały losowo przydzielone do jednej z trzech grup: kontrolna, codziennie-umiarkowana lub cotygodniowa-objadanie się. Schemat dawkowania wynosił 21 dni, wybrany ze względu na to, że znacznie przekraczał czas ekspozycji w poprzednich badaniach⁷. Ryby kontrolne otrzymywały zero alkoholu, ryby codziennie umiarkowane otrzymywały 0,2% alkoholu raz dziennie, a ryby objadające się raz w tygodniu otrzymywały 1,4% alkoholu. Zadanie jasne/ciemne wykorzystano do oceny lęku po 2 dniach odstawienia. Jest to stosunkowo prosty do przeprowadzenia test, który wykorzystuje prostokątną arenę, w której ściany po jednej stronie są białe, a po drugiej ciemne⁹. Dorosłe rybo pręgowany zdecydowanie preferują ciemną stronę areny w warunkach kontrolnych^6,9,13. Zwiększony niepokój jest operacyjnie definiowany jako znacznie więcej czasu spędzonego w strefie ciemnej, a zmniejszony niepokój można założyć, gdy ryba spędza stosunkowo więcej czasu w strefie jasnej. Dzięki oprogramowaniu do śledzenia ruchu można również określić ilościowo inne zmienne informacyjne, w tym prędkość średnią, bezruch, meandrowanie i przejścia stref¹⁴.

Metoda dawkowania opracowana w naszym laboratorium może mieć zastosowanie do każdego badania, w którym rozpuszczalne w wodzie związki są podawane jednemu lub więcej danio pręgowanym. Wiele innych środków farmakologicznych, które mogą skorzystać z tej metodologii, jest obecnie testowanych na danio pręgowanym. Powszechnie testowane związki to nikotyna, chlordiazepoxide, buspiron i skopolamina, które rozpuszczają się w podobny sposób jak etanol; poprzez zmieszanie odpowiedniej ilości substancji chemicznej z wodą. W związku z tym ogólny zakres tej procedury jest znacznie szerszy i nie ogranicza się do etanolu. Co więcej, po wielokrotnym dawkowaniu narkotyków, zadanie jasne/ciemne jest tylko jednym z wielu testów behawioralnych, które można zastosować. Po podaniu leku lub podczas odstawienia, inne popularne testy, które można wykorzystać, obejmują nowatorski test nurkowania w butli¹⁵ i testy zachowań społecznych, takie jak płycizna¹⁶. Poniższa procedura nakreśli skuteczną metodę wielokrotnego przenoszenia grup ryb lub pojedynczych ryb do roztworów zawierających interesujący związek farmakologiczny. Dodatkowo opisany zostanie proces testowania lęku za pomocą testu światło/ciemność w grupach ryb, które są w stanie odstawienia po ekspozycji na długie harmonogramy podawania alkoholu.

Protokół

Wszystkie procedury i testy behawioralne zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu MacEwan na podstawie protokołu o numerze 06-11-12, który jest zgodny z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych.

1. Przygotuj zbiorniki dozujące, roztwory i harmonogram podawania

1. Należy przygotować harmonogram podawania w taki sposób, aby zwierzętom podawano dawkę w tym samym środowisku i o tej samej porze dnia, aby uniknąć zakłóceń czasowych lub stronniczości w stosunku do bodźców wzrokowych.
2. Zdobądź tyle identycznych, przezroczystych polipropylenowych zbiorników tarłowych o pojemności 1,5 l, ile jest konieczne dla liczby wielkości grup. Używaj grup po 8 ryb w zbiorniku, co pozwala na badanie 2 grup ryb dziennie w dalszej części procedury (patrz krok 3). Użyj jednego zbiornika retencyjnego i jednego zbiornika dozującego na grupę (2x całkowita liczba grup).
   1. Umieść wkładki tarłowe o średnicy 400 μm we wszystkich zbiornikach retencyjnych. Napełnij zbiorniki wodą siedliskową lub wodą z odwróconej osmozy o odpowiedniej temperaturze (dla danio pręgowanego 25-28 °C), która jest zgodna z temperaturą, w której ryby są zwykle trzymane.
      UWAGA: Mogą wystąpić niepożądane interakcje chemiczne między niektórymi lekami a składnikami chemicznymi buforowanej wody siedliskowej. W takiej sytuacji należy użyć wody z odwróconej osmozy buforowanej minimalną ilością soli akwariowych lub bez soli akwariowych do podawania leków, a także dla grup kontrolnych.
   2. Upewnij się, że zbiorniki znajdują się w neutralnym środowisku, aby uniknąć kondycjonowania ryb na zewnętrzne bodźce wizualne podczas dawkowania.
3. Przygotuj roztwór leku. Wymieszaj odpowiednią ilość leku z wodą siedliskową w zbiornikach tarłowych. Przygotować 0,2% roztwór etanolu, łącząc 3 ml etanolu wysokiej jakości (95% etanolu nieskażonego) z 1,497 ml wody. Przygotować 1,4% roztwór etanolu, łącząc 21 ml etanolu z 1,479 ml wody.

2. Procedura podawania siatek dla ryb i etanolu

1. Ostrożnie wyjąć ryby ze zbiorników siedliskowych i przenieść je do odpowiedniego zbiornika retencyjnego zawierającego wkładkę tarłową. Najlepiej umieścić ryby we wkładzie tarłowym, aby całkowicie wyeliminować siatkę.
2. Gdy wszystkie ryby znajdują się w odpowiednich zbiornikach, delikatnie wyjmij wkładkę tarłową ze zbiornika retencyjnego i umieść ją w odpowiednim zbiorniku z roztworem leku (Rysunek 1A).
   1. Zapisz czas dozowania zgodnie z wymaganiami. Użyj 30 minut w roztworze etanolu do opisanej tutaj procedury.
   2. Jeśli to możliwe, poproś asystentów o pomoc w przenoszeniu wszystkich grup eksperymentalnych do roztworu leku jednocześnie, aby zapewnić precyzyjny czas dawkowania. Alternatywnie, należy przenosić jedną grupę na raz i śledzić czasy dawkowania poszczególnych grup (Rysunek 1A).
3. Pod koniec wymaganego okresu dawkowania wyjąć ryby z roztworu etanolu, ostrożnie wyjmując wkładkę tarłową z roztworu leku i delikatnie umieszczając ją z powrotem w zbiorniku retencyjnym.
4. Delikatnie ułóż ryby w sieci w zbiornikach przetrzymywanych i umieść je z powrotem w ich siedliskach do następnego zaplanowanego czasu dawkowania lub umieść wkładkę tarłową z powrotem w zbiorniku retencyjnym, aby wyeliminować siatkę.
5. Jak wspomniano wcześniej, jeśli to możliwe, w ramach parametrów wyposażenia pomieszczeń dla zwierząt, zwierzęta powinny być trzymane w tym samym zbiorniku i wkładce tarłowej, które są używane jako zbiornik trzymany. Pozwoli to całkowicie wyeliminować kompensowanie podczas procedury administracyjnej.

3. Testy behawioralne

1. Uzyskaj jasną/ciemną arenę o szerokości 9,5 cm, długości 55 cm i głębokości 9,5 cm z białą wodoodporną podłogą (Rysunek 1B). Przymocuj biały i wodoodporny papier nieodblaskowy do wewnętrznych ścian areny za pomocą rzepów, tak aby połowa areny była pokryta na biało, a połowa na czarno. Napełnij arenę do głębokości 5 cm wodą z siedliska o temperaturze 25-28 °C. Utrzymuj tę temperaturę przez cały czas trwania testów.
2. Zminimalizuj zewnętrzne bodźce wzrokowe, konstruując białą trójstronną obudowę, w której ma być usytuowana arena. Upewnij się, że obszar testowy ma rozproszone oświetlenie górne, które nie powoduje odbić na powierzchni wody, a jednocześnie jest wystarczająco jasne dla oprogramowania do śledzenia ruchu lub ręcznej kwantyfikacji post-hoc na podstawie obrazów wideo.
3. Umieść arenę w obudowie i ustaw parametry nagrywania i analizy ruchu w oprogramowaniu do śledzenia zachowań. Ustaw czas trwania próby na 5-15 minut, w zależności od pytania badawczego.
   UWAGA: Tutaj wykorzystaliśmy 5 min.
4. Przetransportuj grupę ryb, które mają być badane, na obszar badawczy w zbiorniku siedliskowym i umieść je poza ogrodzeniem areny. Aklimatyzować ryby przez 10 minut.
5. Delikatnie złap rybę z odpowiedniej grupy i umieść ją na środku jasnej/ciemnej areny, pamiętając, aby wypuścić rybę, gdy jest ustawiona równolegle do długiej osi areny, aby uniknąć odchylenia ryby do jasnej lub ciemnej strefy.
6. Rozpocznij nagrywanie zachowania natychmiast po wypuszczeniu zwierzęcia. Uważaj na wszelkie problemy z oprogramowaniem podczas śledzenia ryb lub skakanie lub zawieszanie się ryb. Obróć arenę o 180° po przetestowaniu połowy badanych, aby zapobiec wszelkim zakłóceniom wynikającym z uprzedzeń wynikających z tego, który koniec areny jest zorientowany w kierunku otwartego końca obudowy.
7. Po zakończeniu próby delikatnie zasiać siatkę i przenieść rybę z areny do zbiornika retencyjnego lub zbiornika siedliskowego.

4. Analiza

1. Zbadaj czas spędzony w jasnych i ciemnych strefach. Dla każdej grupy i każdej ryby uzyskaj względny czas spędzony w jasnych i ciemnych strefach i przeanalizuj za pomocą testu t dla jednej próbki (lub testu rang podpisanego Wilcoxona dla danych nieparametrycznych; różnica od (połowa całkowitego czasu próby) 150 sekund), aby określić, czy grupy znacząco preferują jeden obszar nad drugim.
2. Aby porównać preferencje, oblicz indeks preferencji, odejmując czas spędzony w jasnej strefie od czasu spędzonego w ciemnej strefie i porównaj różnice między grupami. Testy t mogą być używane do porównywania dwóch grup. Porównaj wiele grup za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, wykorzystując test post hoc HSD Tukeya, jeśli to konieczne (lub test Kruskala-Wallisa z testem post hoc wielokrotnego porównania Dunna dla danych nieparametrycznych).
3. Porównaj prędkość, liczbę przejść stref, meandrowanie i bezruch w grupach. W razie potrzeby należy użyć jednokierunkowej analizy wariancji z wykorzystaniem testu post hoc HSD Tukeya (lub testu Kruskala-Wallisa z testem post hoc Dunna z wielokrotnym porównaniem dla danych nieparametrycznych).

Wyniki

Aby zachować dokładność i kontrolę w badaniach farmakologicznych z wykorzystaniem rybek zebra, ważne jest, aby czas trwania podawania etanolu był spójny i precyzyjny, zgodnie z powyższym opisem. Nasza procedura może zwiększyć łatwość i przepustowość procesu dawkowania. Podawanie etanolu w schemacie tygodniowego napadu (weekly-binge) lub codziennego umiarkowanego (daily-moderate) doprowadziło do zmiany poziomu lęku, mierzonego testem jasne/ciemne, w porównaniu z grupami kontrolnymi. Podczas testów przeprowadzonych dwa dni...

Dyskusja

Wcześniejsze badania dotyczące podawania leków danio pręgowanemu polegały po prostu na siatce ryb w celu przetransportowania ich z ich domowego zbiornika do roztworu leku^12,16. Zakładanie sieci nie zawsze jest spójne i często trwa dłużej niż oczekiwano ze względu na reakcję ucieczki danio pręgowanego, który charakteryzuje się znaczną zmiennością osobniczą. Tradycyjne metody przenoszenia, choć przydatne, można ulepszyć, zmniejszając całkowity czas spędzany przez ryby poza wodą, a także zmniejszając zmienność cz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trzystrefowy system obudowy laboratoryjnej	Aquatic Habitats	N/A
Zbiornik do tarła 1.5 L z przegrodą 400 μm	Aquatic Habitats	N/A
Czysty etanol zbożowy	Luxco, INC	N/A
Oprogramowanie do śledzenia ruchu Ethovision XT	Noldus Information Technology
Pipeta	Eppendorf Canada
Arena jasna/ciemna	Własny produkt		Wykonać zgodnie z opisem procedury. Szerokość 9.5 cm, głębokość 9.5 cm, długość 55 cm.