Artykuł metodologiczny

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

18.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51852

⸱

10 października 2014

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, VU University Amsterdam

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

Streszczenie

W roślinach i zielonych algach światło jest wychwytywane przez kompleksy zbierające światło (LHC), rodzinę integralnych białek błonowych, które koordynują chlorofile i karotenoidy. In vivo białka te są fałdowane za pomocą pigmentów, tworząc kompleksy, które są wprowadzane do błony tylakoidowej chloroplastu. Duże podobieństwo właściwości chemicznych i fizycznych członków rodziny, wraz z faktem, że mogą one łatwo stracić pigmenty podczas izolacji, sprawia, że ich oczyszczanie w stanie rodzimym jest wyzwaniem. Alternatywne podejście do otrzymywania jednorodnych preparatów LHC zostało opracowane przez Plumleya i Schmidta w 1987roku1, którzy wykazali, że możliwe jest odtworzenie tych kompleksów in vitro zaczynając od oczyszczonych pigmentów i niesfałdowanych apoprotein, w wyniku czego uzyskano kompleksy o właściwościach bardzo zbliżonych do kompleksów natywnych. Otworzyło to drogę do wykorzystania rekombinowanych białek eksprymowanych przez bakterie do rekonstytucji in vitro. Metoda rekonstytucji jest skuteczna z wielu powodów: (1) można otrzymać czyste preparaty pojedynczych kompleksów, (2) skład pigmentu można kontrolować w celu oceny ich udziału w strukturze i funkcji, (3) rekombinowane białka mogą być mutowane w celu zbadania funkcjonalnej roli poszczególnych reszt (np. miejsc wiązania pigmentu) lub domeny białkowej (np. interakcja białko-białko, fałdowanie). Metoda ta została zoptymalizowana w kilku laboratoriach i zastosowana do większości kompleksów zbierających światło. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę odtwarzania kompleksów do zbierania światła in vitro stosowaną obecnie w naszym laboratorium, a także podane są przykłady opisujące zastosowania tej metody.

Wprowadzenie

Aparat fotosyntetyczny roślin i glonów zawiera integralne białka błonowe, które wiążą chlorofil a (chl a), b (chl b) i karotenoidy (car). Te kompleksy pigmentowo-białkowe są aktywne w zbieraniu energii świetlnej i przekazywaniu tej energii wzbudzenia do centrów reakcji, gdzie jest wykorzystywana do promowania separacji ładunków2. Są one również zaangażowane w regulacyjne mechanizmy sprzężenia zwrotnego, które chronią aparat fotosyntetyczny przed uszkodzeniami spowodowanymi silnym światłem3,4. Kompleksy do zbierania światła (LHC) składają się z dużej rodziny pokrewnych białek w roślinach i algach5.

Jednorodne oczyszczanie każdego członka rodziny zostało skomplikowane przez bardzo podobne właściwości chemiczne i fizyczne kompleksów. Ponadto procedury oczyszczania często powodują utratę pigmentów lub innych potencjalnych kofaktorów, takich jak lipidy. Rekonstytucja in vitro stanowi skuteczną metodę przezwyciężenia tych problemów. LHC związany z Photosystem II (LHC-II) został po raz pierwszy odtworzony in vitro przez Plumleya i Schmidta w 1987roku. Naukowcy wyekstrahowali zdelipidowane białko i pigmenty oddzielnie od chloroplastów roślinnych, a następnie połączyli zdenaturowane białko pod wpływem ciepła z pigmentami w obecności siarczanu dodecylu litu (LDS), po czym nastąpiły trzy cykle zamrażania i rozmrażania1. Wykazały one, że właściwości spektralne odtworzonych kompleksów LHC były bardzo podobne do kompleksów oczyszczonych z roślin. Łatwość rekonstytucji kompleksów pigmentowo-białkowych LHC, prawdopodobnie ze względu na jakąś wrodzoną cechę samoorganizacji, wraz z trudnością w izolowaniu oczyszczonych kompleksów z organizmów, doprowadziła do szybkiego przyjęcia tej metody przez innych badaczy. Rekonstytucja białek fotosyntetycznych z nadekspresją w Escherichia coli (E. coli) została osiągnięta przez Paulsena i współpracowników w 1990roku. U E. coli nadekspresja białek błonowych jest zwykle zawarta w ciałach inkluzyjnych, co ułatwia ich oczyszczanie. Rekonstytucję uzyskuje się poprzez denaturację termiczną ciał inkluzyjnych zawierających rekombinowane białko w obecności LDS, a następnie dodanie pigmentów, które inicjują fałdowanie białka. Składanie kompleksu LHCII jest procesem dwuetapowym: po pierwsze, chlorofil a jest wiązany w czasie krótszym niż 1 minuta; Po drugie, chlorofil B jest wiązany i stabilizowany przez kilka minut7.

Oprócz dostarczania wglądu w dynamikę fałdowania, rekonstytucja in vitro w połączeniu z mutagenezą ukierunkowaną na miejsce pozwoliła na identyfikację konkretnych aminokwasów ważnych dla stabilności (np. 8,9) lub koordynacji pigmentu (np. 10). Manipulowanie warunkami ponownego fałdowania poprzez dostosowanie parametrów, takich jak skład pigmentu lub detergenty, zidentyfikowało również elementy krytyczne dla prawidłowego fałdowania, takie jak zapotrzebowanie na ksantofile dla kompleksu LHCII (np. 1,11). Ponadto badanie właściwości poszczególnych pigmentów związanych z kompleksami było możliwe przy użyciu kompleksów odtworzonych in vivo (np. 10).

Opisana tutaj metoda zaczyna się od izolacji pigmentów (chlorofilów i karotenoidów) ze szpinaku i zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii. Następnie szczegółowo opisano ekspresję i oczyszczanie białka LHC z E. coli w postaci ciał inkluzyjnych, po czym następuje rekonstytucja LHC, a następnie oczyszczanie za pomocą kolumny powinowactwa Ni. W ostatnim etapie odtworzone kompleksy są dalej oczyszczane przez wirowanie w gradionym tempie sacharozy w celu usunięcia wolnych pigmentów i niesfałdowanych apoprotein. Protokół ten stanowi zoptymalizowaną procedurę obejmującą kilka modyfikacji, które zostały wprowadzone przez różne laboratoria na przestrzeni czasu1,6,10,12–14.

Protokół

1. Całkowita ekstrakcja pigmentu z liści szpinaku

  1. Homogenizować jedną garść liści szpinaku (~20 g) w 100 ml zimnego buforu do mielenia (patrz Tabela 1) za pomocą blendera przez 20 sekund.
  2. Przefiltrować roztwór przez dwie warstwy nylonowej tkaniny o średnicy porów 20 μm i odwirować filtrat o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zawiesić osad zawierający chloroplasty za pomocą miękkiego pędzla w 1 ml zimnego buforu do przemywania (patrz Tabela 1). Po ponownym zawieszeniu osadu dodać 50 ml buforu do przemywania i odwirować roztwór o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad (tylakoidy) w 50 ml buforu do przemywania (patrz Tabela 1).
  5. Odwirować roztwór o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć supernatant. W tym momencie wykonaj następujące kroki w ciemności, aby uniknąć utleniania pigmentu.
  6. Dodać ~ 20 ml 80% acetonu buforowanego Na2CO3 (patrz Tabela 1) w celu ekstrakcji pigmentów. Pozostaw roztwór na lodzie na 10 minut, od czasu do czasu wirując.
  7. Granulować składniki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeśli pigmenty nie zostaną całkowicie wyekstrahowane, osadek będzie miał zielony kolor i krok 1.6 należy powtórzyć.
  8. Zebrać supernatant do rozdzielacza. Dodać 0,4 objętości eteru dietylowego, energicznie wstrząsnąć i otworzyć zawór, aby odpuścić gaz.
  9. Dodać 0,8 objętości 0,33 M NaCl i energicznie wymieszać. Odczekaj ~10 minut, aż warstwy się rozdzielą. Faza eterowa na wierzchu zawiera wyekstrahowane pigmenty. Usuń przezroczystą dolną fazę.
    UWAGA: Jeśli separacja nie jest wyraźna, zamroź i rozmroź roztwór, aby poprawić separację faz.
  10. Usunąć eter, wlewając go z górnej części rozdzielacza do odpowiedniego szklanego pojemnika. Wysuszyć, dodając łyżkę granulowanego bezwodnego siarczanu sodu. Zamieszaj roztwór i odczekaj ~5 minut, aby środek osuszający wchłonął wodę z eteru.
    UWAGA: Powtórz ten krok, jeśli siarczan sodu wydaje się całkowicie zbity ze sobą; Powinno być kilka swobodnie unoszących się kryształów, gdy eter jest wystarczająco wysuszony. Jeśli utworzy się warstwa wody, usuń ją pipetą Pasteura przed dodaniem dodatkowego bezwodnego siarczanu sodu.
  11. Zdekantować eter do nowego szklanego pojemnika, pozostawiając siarczan sodu w postaci stałej.
  12. Odparować eter w obrotowym speedvacu lub pod strumieniemN2.
  13. Pigmenty należy całkowicie rozpuścić w 10 ml 100% acetonu.
  14. Rozcieńczyć niewielką ilość (~3 μl) w 1 ml 80% acetonu i zmierzyć widma absorpcyjne oraz określić stosunek Chl a/b i stężenie Chl metodą opisaną przez Porra i wsp. (1989)Rozdział 15.
  15. Podwielokrotność pigmentów należy podzielić i wysuszyć w obrotowym speedvacu lub pod strumieniemN2, aż aceton zostanie całkowicie odparowany. Wysuszone pigmenty przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja karotenoidów ze szpinaku

  1. Wykonaj kroki od 1.1 do 1.5. W tym momencie wykonaj następujące kroki w ciemności, aby uniknąć utleniania pigmentu.
  2. Zawiesić osad tylakoidów w ~ 50 ml 96% etanolu buforowanego Na2CO3 (patrz Tabela 1) w celu ekstrakcji pigmentów. Pozostaw roztwór na lodzie na 5 minut.
  3. Granulować składniki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeśli pigmenty nie zostaną całkowicie wyekstrahowane, granulka będzie miała zielony kolor i krok 2.2 należy powtórzyć.
  4. Zebrać supernatant i dodać 0,1 objętości 80% KOH (w/v), aby zainicjować zmydlanie.
  5. Pozostawić roztwór w temperaturze 4 °C O/N, szczelnie zamknięty i chroniony przed światłem.
  6. Zebrać roztwór do rozdzielacza. Dodać 1 objętość eteru dietylowego i delikatnie wymieszać.
  7. Dodać 0,8 objętości 0,33 M NaCl i delikatnie wymieszać. Odczekaj ~10 minut, aż warstwy się rozdzielą. Pomarańczowa faza eterowa na wierzchu zawiera zmydlone karotenoidy. Usuń zieloną dolną fazę, opróżniając ją przez zawór odcinający lejka.
  8. Dodaj 3 objętości wody i delikatnie wymieszaj, aby usunąć wodorotlenek potasu. Pozwól warstwom się rozdzielić. UWAGA: Jeśli górna faza wydaje się mętna, dodaj niewielką ilość NaCl (np. 3 g NaCl w 200 ml roztworu) i delikatnie zamieszaj do rozpuszczenia.
  9. Usunąć dolną fazę, opróżniając ją przez zawór odcinający lejka.
  10. Wykonaj kroki od 1.10 do 1.13.
  11. Rozcieńczyć niewielką ilość (~3 μl) w 1 ml 80% acetonu i zmierzyć widma absorpcyjne przy 440 nm w 80% acetonie. Aby określić stężenie, należy użyć średniego współczynnika ekstynkcji dla karotenoidów (ε440 = 255)16 według następującego wzoru: Samochód [mg/ml] = (Abs440 nm/225) x 11 (droga optyczna) = 1 cm.
  12. Podwielokrotność karotenoidów należy podzielić na składniki i wysuszyć w urządzeniu speedvac lub pod strumieniemN2, aż cały eter dietylowy zostanie odparowany. Wysuszone pigmenty przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Całkowita ekstrakcja pigmentu i karotenoidów z Chlamydomonas reinhardtii

  1. Hoduj C. reinhardtii na stałym podłożu TAP17 na szalce Petriego, rozprowadzając niewielką ilość płynnej kultury na powierzchni. Rosnąć pod ciągłym strumieniem świetlnym o wielkości 20 μmol zdjęcia PSA m-2 sec-1, aż do wyświetlenia zielonej warstwy komórek.
  2. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, zebrać niewielką ilość C. reinhardtii ze stałej pożywki TAP i umieścić komórki w 500 ml pożywki TAP17 w kolbie o pojemności 1 l. Hoduj kulturę w temperaturze 25 °C z mieszaniem 170 obr./min pod ciągłym strumieniem świetlnym 20 μmol photos PSA m-2 sec-1.
  3. Po 5-6 dniach hodowla powinna osiągnąć koniec fazy logarytmicznej (6 x 106 komórek/ml lub 2-2,5 gęstości optycznej przy 750 nm). Odwirować kulturę przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Aby uzyskać całkowitą ekstrakcję pigmentu, wykonaj kroki od 1.6 do 1.15.
  5. Wydajność całkowitego ekstraktu pigmentowego rozpoczynająca się od 500 ml pełnej kultury wzrostu C. reinhardtii wynosi około 5 ml roztworu o stężeniu 0,5 mg chl a+b / ml.
  6. W przypadku ekstrakcji karotenoidów wykonaj kroki od 2.2 do 2.12.

4. Oczyszczanie ciał inkluzyjnych

  1. Sklonuj sekwencję kodującą interesującego nas białka LHC do wektora ekspresji, który skutkuje stopionym C-końcowym znacznikiem He przy użyciu standardowych procedur biologii molekularnej. Przekształć ten konstrukt w szczep gospodarza E. coli, taki jak BL21 (DE3).
  2. Przygotować bufor do lizy, bufor detergentu, bufor trytonu, TE (tabela 1), 1 M izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) i pożywkę LB18 z odpowiednimi antybiotykami.
  3. Pobrać pojedynczą kolonię E. coli zawierającą klon ekspresyjny ze świeżo prążkowanej płytki do ~ 5 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami, stosując standardowe procedury6. Rosnąć w temperaturze 37 °C z mieszaniem 220 obr./min przez co najmniej 16 godzin.
  4. Dodać 2,5 ml kultury O/N do 1 l kolby Erlenmeyera z 250 ml LB uzupełnionymi odpowiednim antybiotykiem.
  5. Hoduj komórki przez 2-3 godziny (lub do momentu, gdy OD600 wyniesie ~0,6) w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min.
  6. Dodać IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Kontynuuj wzrost komórek w temperaturze 37 °C z prędkością 220 obr./min przez 3-4 godziny.
  7. Odwirowywać kulturę przez 10 minut przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C w wstępnie zważonej probówce wirówkowej. Dokładnie odrzucić supernatant i określić wagę osadu, ponownie ważąc i odejmując wagę probówki wirówkowej.
  8. Zawiesić osad komórek E. coli w 0,8 ml/g buforu do lizy przez energiczne wirowanie.
    UWAGA: Alternatywnie, granulat komórkowy można zamrozić w temperaturze -80C do późniejszego wykorzystania. Jeśli zaczynasz od zamrożonego granulatu, pozostaw do całkowitego rozmrożenia przed dodaniem buforu do lizy.
  9. Dodać 2 mg lizozymu na gram komórek i inkubować na mokrym lodzie z okazjonalnym wirowaniem przez 30 minut.
  10. Dodać 20 μg/ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCl, 20 μg/ml RNAse. Wirować i umieszczać na lodzie na 30 min.
  11. Dodać 2 ml zimnego buforu detergentu na gram komórek. Dobrze wymieszaj i utrzymuj RT przez 5 minut.
  12. Przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml (w razie potrzeby podzielić na dwie probówki). Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia ciał wtrącających.
  13. Dodać 1 ml zimnego buforu Triton i całkowicie zawiesić osad przez sonifikację (3 impulsy x 5 s x 50% mocy w odstępach 20 sekund). UWAGA: Umieść rurkę w małej zlewce otoczoną lodowatą wodą, aby była zimna podczas sonifikacji. W przypadku wielu probówek, po ponownym zawieszeniu należy połączyć zawieszone ciała inkluzyjne w jedną rurkę.
  14. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia ciał wtrącających.
  15. Powtórz kroki 4.13 i 4.14 dwa razy.
  16. Ponownie zawiesić inkluzje w 1 ml zimnego TE z sonifikacją w celu ostatecznego przepłukania w celu usunięcia buforu Triton. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia ciał wtrącających.
  17. Zawiesić osad w 1 ml zimnego TE metodą sonifikacji.
  18. Oceń stężenie białka za pomocą standardowych metod, takich jak test Bradforda19. Przechowywać podwielokrotności ciał inkluzyjnych w temperaturze -20 °C.

5. Rekonstytucja

Protokół ten zwykle daje 1-2 ml odtworzonego białka o OD 4, gdy absorbancja jest mierzona w regionie Qy (600-750 nm). Ilość można dowolnie regulować, jednak należy zadbać o zachowanie odpowiednich proporcji podczas zabiegu.

  1. Przygotować następujące roztwory zgodnie z opisem w Tabeli 1: 2x Bufor do rozpuszczenia, 20% OG, 2 M KCl, TE. Wykonaj następujące czynności przy słabym oświetleniu.
  2. Ponownie zawiesić 800 μg ciał inkluzyjnych LHC w sumie 400 μl TE w probówce do mikrofuge o pojemności 2 ml. Dodać 400 μl 2x Bufor do rozpuszczania i krótko
    3. przetrząsnąć.
  3. Dodać 0,6 μl β-merkaptoetanolu (zapas 14,8 M), aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM. Podgrzewać białko przez 1 minutę w temperaturze 98 °C. Krótko wirować i umieszczać w temperaturze RT na 3 minuty.
  4. Ponownie zawiesić 500 μg całkowitych wysuszonych pigmentów chlorofilowych plus 80 μg pigmentów karotenoidowych w 30 μl 100% EtOH przez energiczne wirowanie przez 1 minutę lub umieścić w sonikatorze kąpielowym na 1-2 minuty.
  5. Odwiruj mieszankę pigmentów ~30 sekund w temperaturze 15 800 x g w temperaturze 4 °C i upewnij się, że nie ma granulki. Jeśli jest granulka, powtórz wirowanie i/lub sonifikację. WAŻNE: Po ponownym zawieszeniu i odwirowaniu natychmiast dodaj pigment do białka, w przeciwnym razie może się ono agregować i będzie wymagało ponownego zawieszenia.
  6. Powoli dodawaj mieszankę pigmentów do schłodzonego białka podczas wirowania. Kontynuuj wirowanie przez 5-10 sekund i umieść rurkę na mokrym lodzie. Uważaj, aby nie wirować zbyt energicznie, ponieważ białko może przelać się przez górną część rurki.
  7. Dodać 94 μl 20% oktylu β-D-glukopiranozydu (OG) (stężenie końcowe 2%), krótko zmieszać i trzymać na lodzie przez 10 minut.
  8. Dodać 90 μl KCl 2 M (końcowe stężenie 150-200 mM), krótko zmieszać i trzymać na lodzie 20 minut. UWAGA: w tym czasie można rozpocząć przygotowanie kolumny (sekcja 6).
  9. Wirować przez 10 minut w temperaturze 15 800 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu (wytrąconego LDS) do probówki o pojemności 10 ml. Przechowywać w chłodnym miejscu i chronić przed światłem.

6. Oczyszczanie kolumny niklowej

  1. Przygotować następujące roztwory zgodnie z opisem w tabeli 1: bufor OG, bufor płuczący OG, bufor elucyjny.
  2. Podłącz kolumnę Ni-Sepharose (1 ml) lub jej odpowiednik do pompy perystaltycznej, upewniając się, że żadne powietrze nie dostanie się do wnętrza kolumny podczas tego kroku i następnych kroków.
  3. Ustaw prędkość pompy na 1 ml/min i przepłucz kolumnę 5-10 ml wody, aby usunąć roztwór do przechowywania.
  4. Zrównoważyć kolumnę z 3-4 ml buforu OG.
  5. Dodać 3-4 ml buforu OG do próbki białka i załadować do kolumny. UWAGA: jeśli białko znajdowało się na lodzie dłużej niż 10 minut po usunięciu LDS, należy ponownie wirować w temperaturze 15 800 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie dodatkowe wytrącenia LDS.
  6. Przepłukać kolumnę 5 ml buforu OG.
  7. Przepłukać kolumnę 2 ml buforu do płukania OG.
  8. Eluować związane białko za pomocą 3 ml buforu elucyjnego. Zebrać zieloną elucję, która zawiera odtworzone białko. UWAGA: Zwykle jest to łącznie około 1 ml.

7. Wirowanie w gradionym przepływie sacharozy

  1. Przygotować następujące roztwory zgodnie z opisem w tabeli 1: roztwór sacharozy, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6.
  2. Napełnić probówki ultrawirówek roztworem sacharozy i zamrażać w temperaturze -20 °C O/N lub -80 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Wyjmij probówkę z zamrażarki i pozostaw do niezakłóconego rozmrożenia w temperaturze 4 °C. UWAGA: Proces zamrażania/rozmrażania tworzy gradient od 0,1 do 1 M sacharozy. Probówka o pojemności 15 ml zwykle rozmraża się w ciągu około 3 godzin.
  4. Ostrożnie usunąć z góry tę samą objętość, co zielona frakcja wymyta z kolumny sefarozy niklu w kroku 6.8. Następnie powoli załaduj odtworzoną próbkę na wierzch, aby uniknąć zakłócenia gradientu.
  5. Wyważ probówki i wiruj z prędkością 200 000 x g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW-41 lub SW-60 przez 18 godzin, ustawionego na wolne przyspieszanie i zatrzymywanie się bez hamulców.
  6. Ostrożnie wyjmij gradient z uchwytu probówki za pomocą kleszczy. Użyj strzykawki z długą igłą z otworem, aby zebrać frakcję od góry. UWAGA: Alternatywnie zbieraj frakcje od dołu, przekłuwając rurkę igłą i zbierając krople.

Wyniki

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę rekonstytucji chlorofilu a/b białka wiążące in vitroTechnika ta umożliwia fałdowanie tych kompleksów pigment-białko in vitro zaczynając od apoproteiny, którą można uzyskać poprzez nadekspresję w systemie heterologicznym, oraz pigmentów ekstrahowanych z roślin lub alg. Po rekonstytucji zrefoldowany kompleks pigment-białko jest oczyszczany z nadmiaru pigmentów i niefoldowanej apoproteiny w dwóch etapach. Pierwszy etap (Rycina 1 A-B) opiera się na obecności znacznika His-tag na C-końcu białka, co umożliwia usunięcie znacznej części nie związanych pigmentów. Drugi etap oczyszczania wykorzystuje wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy, (Rycina 2), gdzie białko rozfałdowane zazwyczaj migruje wolniej niż zielony prążek zawierający białko zrekonstytuowane. Celem rekonstytucji in vitro jest uzyskanie kompleksów o właściwościach identycznych z właściwościami naturalnymi. Aby zilustrować ten wynik, właściwości spektroskopowe an in vivo kompleks zbierający światło porównuje się z tym samym kompleksem LHC poddanym rekonstytucji in vitro13,20,21Widmo absorpcyjne kompleksów LHC w zakresie widzialnym (od 350 nm do 750 nm) zależy od składu pigmentowego kompleksu, a także od otoczenia pigmentu (w tym od białka), i stanowi zatem czułe narzędzie do weryfikacji jakości rekonstytucji. W Rycina 3, widmo absorpcyjne CP24, chlorofilu a/b białko wiążące z Arabidopsis thaliana, zrekonstytuowany in vitro, jest porównywany ze widmem tego samego kompleksu oczyszczonego z Arabidopsis tylakoidy21W widmach można rozpoznać przejście Qy oraz pasmo Soreta Chl a (piki przy 671/439 nm) oraz Chl b (piki przy 649/466 nm). Kompleksy natywne i zrekonstytuowane wykazują identyczne widma absorpcyjne, co wskazuje na niemal identyczny skład i organizację pigmentów. Do oceny jakości zrekonstytuowanego kompleksu można wykorzystać spektroskopię fluorescencji. Widma emisji fluorescencji mierzy się po pobudzeniu przy różnych długościach fal, które preferencyjnie pobudzają różne pigmenty: Chl a przy 440 nm, Chl b przy 475 nm, a ksantofile przy 500 nm. W prawidłowo sfałdowanym kompleksie białko-pigment, Chl b a ksantofile przekazują energię wzbudzenia głównie do Chl a w ciągu kilku pikosekund, a fluorescencja pochodzi z układu w równowadze termicznej, co skutkuje pojedynczym pikiem o tym samym kształcie i tych samych maksimach dla wszystkich trzech długości fal wzbudzenia (Rycina 4A–B). Obecność Chl b niekoordynowana z białkiem może zostać zidentyfikowana poprzez dodatkowy piki lub ramię w okolicy 650 nm przy wzbudzeniu przy 475 nm (Rysunek 4C). Obecność wolnego Chl a zamiast tego prowadzi do dodatkowej emisji w okolicach 675 nm, która występuje głównie przy wzbudzeniu przy 440 nm. Widma emisji fluorescencji przy wzbudzeniu przy 475 nm zarówno w przypadku kompleksów CP24 zrekonstytuowanych, jak i natywnych (Rycina 4D) wykazują pojedynczy pik przy 681 nm, co wskazuje na prawidłowe sfałdowanie zrekonstytuowanego kompleksu. Dodatkowym potwierdzeniem prawidłowej rekonstytucji kompleksu pigment-białko są pomiary dichroizmu kołowego (CD). Sygnał CD w obszarze widzialnym zależy od oddziaływań ekscytonicznych między pigmentami, przez co jest bardzo czuły nawet na niewielkie zmiany w organizacji chromoforów22. Rycina 5 przedstawia widma CD zrekonstytuowanego oraz natywnego białka CP24 z typowymi pikami charakterystycznymi przy 681 nm, 650 nm i 481 nm. Podsumowując, wysokie podobieństwo właściwości spektroskopowych natywnego i zrekonstytuowanego białka CP24 potwierdza, że procedura rekonstytucji pozwala na otrzymanie kompleksów o strukturze zbliżonej do natywnej, które nadają się do in vitro badania białek zbierających światło.

Schemat chromatografii; powinowactwo do Ni w celu oczyszczania białka LHCII; proces rozdzielania pigmentów.
Rycina 1. Przedstawienie oczyszczania rekombinowanych białek LHC z tagiem His za pomocą kolumny niklowej. (A) Podczas oczyszczania białka z tagiem His, składające się zarówno z kompleksów zrekonstytuowanych (zielony sześciokąt), jak i białek niezrekonstytuowanych/zagregowanych (pomarańczowy sześciokąt), wiążą się z powierzchnią Ni-Sepharose (niebieska plamka), podczas gdy niepowiązane pigmenty (małe kolorowe plamki) przepływają przez kolumnę. (B) Po przemyciu kolumny buforem elucyjnym zawierającym imidazol, białka zrekonstytuowane i niezrekonstytuowane są zbierane w eluacie.

Chromatografia kolumnowa pigmentów; schemat rozdziału; identyfikacja LHCII; podział warstw pigmentu.
Rysunek 2. Gradient sacharozy zrekonstytuowanego LHCII po oczyszczaniu na kolumnie niklowej. Zrekonstytuowane kompleksy zostają oddzielone od wolnego pigmentu za pomocą gradientu gęstości. Ciemnozielony prążek reprezentuje zrekonstytuowany LHCII, a bladoszielone tło składa się z wolnych pigmentów.

Wykres widma absorpcyjnego; nCP24 vs rCP24. Długość fali (nm) vs absorpcja.
Rycina 3. Widma absorpcyjne zrekonstytuowanego białka CP24 (rCP24, czerwona linia) oraz białka natywnego (nCP24, czarna linia) wyizolowanego z Arabidopsis thaliana. Na obu widmach można rozpoznać przejścia Qy i Soret dla Chl a (piki przy 671/439 nm) oraz Chl b (piki przy 649/466 nm). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Passarini et al. 201421.

Widma fluorescencji przy 440, 475, 500 nm; wykres przedstawiający piki emisji w zależności od długości fali.
Rycina 4. Widma emisji fluorescencji. Widma emisji fluorescencji zrekonstytuowanego kompleksu CP24 typu dzikiego (A) oraz znormalizowane do maksimum (B), wykazujące efektywny transfer energii z Chl b i ksantofili do Chl a. (C) Widma emisji fluorescencji zrekonstytuowanego CP24 (rCP24) i kompleksu natywnego (nCP24) wyizolowanego z Arabidopsis thaliana. Widma zostały znormalizowane do maksimum piku (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres widm dichroizmu kołowego; długość fali względem CD dla analizy białek nCP24 i rCP24.
Rycina 5. Widma dichroizmu kołowego. Rekonstytuowany kompleks CP24 (rCP24, czerwona linia) oraz kompleks natywny (nCP24, czarna linia) wyizolowany z Arabidopsis thaliana wykazują bardzo podobne widma.

Wykres widm absorpcji przedstawiający CP29_A2 i CP29_WT wraz z różnicą, długość fali 400-700 nm.
Rycina 6. Widma absorpcji dzikiego typu CP29 (CP29_WT) oraz zmutowanego CP29 (CP29_A2). Zielona linia przedstawia różnice między dwoma wykresami.

Wszystkie bufory można przechowywać w temperaturze 4 °C.
SkładnikiStężenie końcoweUwagi dodatkowe
Bufor do rozcieraniaSorbitol0.4 M
Tricyna0.1 MpH 7.8
NaCl10 mM
MgCl25 mM
Mleko w proszku0.5% w/v
Bufor do płukaniaSorbitol50 mM
Tricyna5 mMpH 7.8
EDTA10 mMpH 8
Bufor do lizyTris50 mMpH 8
Sacharoza2.5% w/v
EDTA1 mMpH 8
Bufor z detergentemNaCl200 mM NaCl
Kwas deoksycholowy1% w/v
NONIDET P-401% w/v
Tris20 mMpH 7.5
EDTA2 mMpH 8
beta-merkaptoetanol10 mM
Bufor z TritonemTriton X-1000.5% w/v
Tris20 mMpH 7.5
beta-merkaptoetanol1 mM
Bufor TETris50 mMpH 8
EDTA1 mMpH 8
Bufor do rekonstytucjiHEPES200 mM
Sacharoza5% w/v
Dodecylosiarczan litu (LDS)4% w/v
Benzamidyna2 mM
Kwas aminokapronowy10 mM
Bufor OGOktyloglukozyd1% w/v
Sacharoza12.5% w/v
NaCl0.2 M
HEPES20 mM
Imidazol10 mM
Bufor do płukania OGn-Dodecyl-beta-D-maltozyd (β-DM)0.06% w/v
HEPES40 mMpH 7.5-9
NaCl0.2 M
Bufor do elucjiImidazol0.5 M
n-Dodecyl-beta-D-maltozyd (β-DM)0.06% w/v
HEPES40 mMpH 8
NaCl0.2 M
Roztwór sacharozySacharoza20% w/v
n-Dodecyl-beta-D-maltozyd (β-DM)0.06% w/v
HEPES0.01 MpH 7.6
Aceton 80% buforowany węglanem soduAceton80% v/v
Węglan sodu1 M
Etanol 96% buforowany węglanem soduEtanol96% v/v
Węglan sodu1 M

Tabela 1. Lista buforów i roztworów użytych w tym protokole.

Mieszanka Chla a/b mixChla a/bChl aChl bNeoViolaLuteChl totChl/Car
nCP26-2.2±0.056.22.80.610.381.0294.5±0.1
rCP2682.71±0.056.572.430.720.320.9793.9±0.04
rCP265.52.25±0.056.232.770.770.30.9694.0±0.1
rCP2632.08±0.046.082.920.760.31.0494.1±0.1
rCP2611.7±0.055.73.30.70.30.994.3±0.05
rCP260.31.11±0.044.74.280.70.30.994.2±0.2
rCP260.050.23±0.011.45.60.580.241.1173.1±0.06
rCP26<0.010.11±0.010.76.30.640.31.0873.06±0.06

Tabela 2. Zawartość pigmentów w natywnym kompleksie CP26 w porównaniu do zrekonstytuowanych kompleksów białkowo-pigmentowych o różnych stosunkach Chl a/b Ratios39.

Dyskusja

Białka błonowe nie są tak łatwe do zbadania. Izolacja natywnych białek błonowych jest skomplikowana ze względu na konieczność rozpuszczania dwuwarstwy lipidowej za pomocą detergentów, które mogą uszkodzić białko i usunąć niezbędne kofaktory. Białka te mogą być również obecne w niewielkich ilościach w błonach biologicznych lub być zmieszane z blisko spokrewnionymi białkami, jak w przypadku kompleksów do zbierania światła, co utrudnia oczyszczanie pojedynczych kompleksów. Heterologiczna ekspresja białek w E. coli i rekonstytucja in vitro dają możliwość uniknięcia tych problemów. Rekonstytucja i oczyszczanie in vitro sfałdowanych białek prowadzi do powstania kompleksów, które mają cechy bardzo podobne do cech natywnych kompleksów20,21,23, a zatem mogą być wykorzystywane do badania kompleksów, których nie można oczyścić do jednorodności 24–27.

Metoda ta wykorzystuje szpinak, który jest łatwo dostępny przez cały rok, jako źródło całkowitego pigmentu i preparatów karotenoidowych. W przypadku niektórych rekonstytucji białek rodzimych dla glonów preferowane jest stosowanie pigmentów oczyszczonych z glonów ze względu na różne składy pigmentów. Stosunek Chl a/b i stosunek Chl/car pozostaje taki sam niezależnie od źródła pigmentu.

Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że skuteczność rekonstytucji wynosi zwykle około 35%28. W związku z tym konieczne jest usunięcie niezwiązanych pigmentów i niesfałdowanej apoproteiny z roztworu po rozpuszczeniu. W niniejszym protokole przedstawiono dwuetapowy protokół oczyszczania (patrz również wyniki). Należy jednak zauważyć, że etap gradientu sacharozy nie pozwala na całkowite oddzielenie apo i holobiałka. W przypadku większości analiz nie stanowi to problemu, ponieważ apoproteina nie zawiera pigmentów, a tym samym nie zakłóca pomiarów funkcjonalnych. Jednak w przypadku, gdy konieczne jest całkowite usunięcie apoproteiny z frakcji zawierającej odtworzony kompleks (na przykład w celu obliczenia stechiometrii pigmentu do białka), można zastosować kolumnę do wymiany anionowej (szczegółowe informacje można znaleźć w Passarini i in. 200929 ).

Zdolność do ponownego zawijania rekombinowanych białek zbierających światło za pomocą izolowanych pigmentów in vitro daje możliwość "manipulowania" kompleksami poprzez modyfikację "środowiska" rekonstytucji na różne sposoby, zmieniając w ten sposób charakterystykę powstałego kompleksu. Na przykład, zmiana składu pigmentu podczas rozpuszczenia może spowodować powstanie kompleksu o zmienionym składzie pigmentowym. Cecha ta może być wykorzystana do badania wpływu różnych pigmentów na strukturę i stabilność kompleksu. Zwykle preparat pigmentowy otrzymywany ze szpinaku ma stosunek Chl a/b 3:1 i stosunek Chl/samochód 2,9:1. W takim stosunku zazwyczaj powstaje odtworzone białko o takich samych właściwościach jak białko natywne. Jednak dostosowanie stosunku Chl a/b poprzez dodanie oczyszczonego Chl a lub b może wpływać na wiązanie różnych pigmentów ze względu na różną selektywność miejsc wiązania30–33. Jest to możliwe, ponieważ większość miejsc wiązania pigmentu nie jest całkowicie selektywna dla Chl a lub Chl b, ale może pomieścić oba, chociaż z różnym powinowactwem10,30,34. W podobny sposób wykazano również, że miejsca wiązania karotenoidów są w stanie pomieścić więcej niż jeden gatunek ksantofilu8,35–38. Różne rekonstytucje CP26, innego kompleksu pigmentowo-białkowego roślin wyższych, przy użyciu różnych kompozycji pigmentowych przedstawiono w tabeli 2 39. Rekonstytucje te wykorzystano do oceny powinowactwa miejsc wiązania do poszczególnych pigmentów39. Warto zauważyć, że aby otrzymać kompleks o takim samym składzie pigmentowym jak natywny, stosunek Chl a/b mieszanki pigmentów musi wynosić 3:1. Wydaje się, że tak jest w przypadku wszystkich kompleksów LHC wyższych roślin20,40.

Połączenie biologii molekularnej z techniką rekonstytucji pozwala na bardziej szczegółowe zbadanie właściwości kompleksu wiążącego Chl. Znaczenie różnych domen białkowych dla stabilności i fałdowania kompleksów lub ich udziału w interakcjach białko-białko zostało określone przez skrócenie apoproteiny lub przeprowadzenie mutagenezy losowej8,41–44. Pojedyncze reszty aminokwasowe ważne dla koordynacji różnych pigmentów mogą być zmieniane poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu analizy właściwości poszczególnych pigmentów lub oceny ich udziału w funkcji i stabilności kompleksu10,28,29,45–52. Rycina 6 przedstawia odtworzony Lhcb4 (CP29) z mutacją histydyny w pozycji 216,53. Porównanie składu pigmentowego kompleksów typu dzikiego i zmutowanego pokazuje, że mutacja indukuje utratę jednej cząsteczki Chl a, co wskazuje, że miejsce docelowe mieści Chl a w kompleksie WT. Różnice w widmach absorpcyjnych WT i mutantu, po normalizacji do zawartości pigmentu, pokazują również właściwości absorpcyjne utraconego pigmentu. W tym przypadku różnicę można dostrzec w głównym piku przy długości fali 680 nm, co wskazuje, że Chl a koordynowany przez His216 absorbuje na tej długości fali (więcej szczegółów na temat tego mutanta i właściwości spektroskopowych można znaleźć w Mozzo et al. 200853). Analiza mutacji może być również wykorzystana do określenia wpływu środowiska na właściwości spektroskopowe pigmentów54.

Podsumowując, białka zbierające światło można łatwo odtworzyć in vitro , w wyniku czego powstają kompleksy pigment-białko o bardzo podobnych właściwościach do kompleksów natywnych. W ten sposób eliminowane są trudności związane z izolacją natywnych białek, a jednocześnie dostarczane są preparaty białkowe o wysokiej wydajności i czystości do dalszych badań. Podkreślono znaczenie stosunku 3:1 Chl a/b w tworzeniu autentycznego kompleksu, a w celu zilustrowania zastosowań tej techniki podano przykłady odtworzonych LHC typu dzikiego i zmutowanego.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych przez grant ERC dla RC oraz przez Holenderską Fundację Badań nad Materią (FOM) poprzez program FOM (10TM01).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HisTrap HPGE Healthcare17-5247-01
Ściereczka nylonowa 20 μ m pores
Miękki pędzel malarski dla artystów 
NONIDET P-40Sigma74385
Beta-DMSigmaD4641
DNAazaThermoScientificEN0525
Mleko
RNAazaThermoScientificEN0531
Sonicator
Octyl β- D-glukopiranozydSigmaO8001 
Ultrawirówka XLBeckman-Coulter
TAP mediumpatrz referencje 17
LB mediumpatrz numer referencyjny 19
w proszku

Bibliografia

  1. Plumley, F. G., Schmidt, G. W. Reconstitution of chlorophyll a/b light-harvesting complexes: Xanthophyll-dependent assembly and energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 146-150 (1987).
  2. Croce, R., van Amerongen, H. Light-harvesting and structural organization of Photosystem II from individual complexes to thylakoid membrane. Journal of photochemistry and photobiology B Biology. 104 (1-2), 142-153 (2011).
  3. Li, Z., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and responding to excess light. Annual review of plant biology. 60, 239-260 (2009).
  4. De Bianchi, S., Ballottari, M., Dall’osto, L., Bassi, R. Regulation of plant light harvesting by thermal dissipation of excess energy. Biochemical Society transactions. 38 (2), 651-660 (2010).
  5. Neilson, J. A. D., Durnford, D. G. Structural and functional diversification of the light-harvesting complexes in photosynthetic eukaryotes. Photosynthesis research. 106 (1-2), 57-71 (2010).
  6. Paulsen, H., Rümler, U., Rüdiger, W. Reconstitution of pigment-containing complexes from light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein overexpressed in Escherichia coli. Planta. 181 (2), 204-211 (1990).
  7. Horn, R., Grundmann, G., Paulsen, H. Consecutive binding of chlorophylls a and b during the assembly in vitro of light-harvesting chlorophyll-a/b protein (LHCIIb). Journal of molecular biology. 366 (3), 1045-1054 (2007).
  8. Cammarata, K. V., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of a light-harvesting gene product: deletion mutagenesis and analyses of pigment binding. Biochemistry. 31 (10), 2779-2789 (1992).
  9. Paulsen, H., Hobe, S. Pigment-binding properties of mutant light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 205 (1), 71-76 (1992).
  10. Bassi, R., Croce, R., Cugini, D., Sandonà, D. Mutational analysis of a higher plant antenna protein provides identification of chromophores bound into multiple sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (18), 10056-10061 (1999).
  11. Paulsen, H., Finkenzeller, B., Kühlein, N. Pigments induce folding of light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 215 (3), 809-816 (1993).
  12. Caffarri, S., Croce, R., Cattivelli, L., Bassi, R. A look within LHCII differential analysis of the Lhcb1-3 complexes building the major trimeric antenna complex of higher-plant photosynthesis. Biochemistry. 43 (29), 9467-9476 (2004).
  13. Giuffra, E., Cugini, D., Croce, R., Bassi, R. Reconstitution and pigment-binding properties of recombinant CP29. European journal of biochemistry / FEBS. 238 (1), 112-120 (1996).
  14. Rogl, H., Kosemund, K., Kühlbrandt, W., Collinson, I. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography. FEBS letters. (1-2), 21-26 (1998).
  15. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
  16. Davies, B. H. Identification of carotenoids by their absorption characteristics. Biochem J. 103 (2), (1967).
  17. Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  18. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  20. Wientjes, E., Croce, R. The light-harvesting complexes of higher-plant Photosystem I Lhca1/4 and Lhca2/3 form two red-emitting heterodimers. The Biochemical journal. 433 (3), 477-485 (2011).
  21. Passarini, F., Xu, P., Caffarri, S., Hille, J., Croce, R. Towards in vivo mutation analysis knock-out of specific chlorophylls bound to the light-harvesting complexes of Arabidopsis thaliana - the case of CP24 (Lhcb6). Biochimica et biophysica acta. , (2014).
  22. Georgakopoulou, S., van der Zwan, G., Bassi, R., van Grondelle, R., van Amerongen, H., Croce, R. Understanding the changes in the circular dichroism of light harvesting complex II upon varying its pigment composition and organization. Biochemistry. 46 (16), 4745-4754 (2007).
  23. Croce, R., Müller, M. G., Caffarri, S., Bassi, R., Holzwarth, A. R. Energy transfer pathways in the minor antenna complex CP29 of photosystem II a femtosecond study of carotenoid to chlorophyll transfer on mutant and WT complexes. Biophysical journal. 84 (4), 2517-2532 (2003).
  24. Schmid, V. H., Cammarata, K. V., Bruns, B. U., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of the photosystem I light-harvesting complex LHCI-730 heterodimerization is required for antenna pigment organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (14), 7667-7672 (1997).
  25. Castelletti, S., Morosinotto, T., Robert, B., Caffarri, S., Bassi, R., Croce, R. Recombinant Lhca2 and Lhca3 subunits of the photosystem I antenna system. Biochemistry. 42 (14), 4226-4234 (2003).
  26. Storf, S., Jansson, S., Schmid, V. H. R. Pigment binding, fluorescence properties, and oligomerization behavior of Lhca5, a novel light-harvesting protein. The Journal of biological chemistry. 280 (7), 5163-5168 (2005).
  27. Mozzo, M., Mantelli, M., Passarini, F., Caffarri, S., Croce, R., Bassi, R. Functional analysis of photosystem I light-harvesting complexes (Lhca) gene products of Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et biophysica acta. 1797 (2), 212-221 (2010).
  28. Remelli, R., Varotto, C., Sandonà, D., Croce, R., Bassi, R. Chlorophyll binding to monomeric light-harvesting complex. A mutation analysis of chromophore-binding residues. The Journal of biological chemistry. 274 (47), 33510-33521 (1999).
  29. Passarini, F., Wientjes, E., Hienerwadel, R., Croce, R. Molecular basis of light harvesting and photoprotection in CP24 unique features of the most recent antenna complex. The Journal of biological chemistry. 284 (43), 29536-29546 (2009).
  30. Giuffra, E., et al. Analysis of some optical properties of a native and reconstituted photosystem II antenna complex, CP29 pigment binding sites can be occupied by chlorophyll a or chlorophyll b and determine spectral forms. Biochemistry. 36 (42), 12984-12993 (1997).
  31. Pagano, A., Cinque, G., Bassi, R. In vitro reconstitution of the recombinant photosystem II light-harvesting complex CP24 and its spectroscopic characterization. The Journal of biological chemistry. 273 (27), 17154-17165 (1998).
  32. Kleima, F. J., et al. Decreasing the chlorophyll a/b ratio in reconstituted LHCII structural and functional consequences. Biochemistry. 38 (20), 6587-6596 (1999).
  33. Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et biophysica acta. 1556 (1), 29-40 (2002).
  34. Hobe, S., Trostmann, I., Raunser, S., Paulsen, H. Assembly of the major light-harvesting chlorophyll-a/b complex Thermodynamics and kinetics of neoxanthin binding. The Journal of biological chemistry. 281 (35), 25156-25166 (2006).
  35. Croce, R., Weiss, S., Bassi, R. Carotenoid-binding sites of the major light-harvesting complex II of higher plants. The Journal of biological chemistry. 274 (42), 29613-29623 (1999).
  36. Hobe, S., Niemeier, H., Bender, A., Paulsen, H. Carotenoid binding sites in LHCIIb. Relative affinities towards major xanthophylls of higher plants. European journal of biochemistry / FEBS. 267 (2), 616-624 (2000).
  37. Jahns, P., Depka, B., Trebst, A. Xanthophyll cycle mutants from Chlamydomonas reinhardtii indicate a role for zeaxanthin in the D1 protein turnover. Plant Physiology and Biochemistry. 38 (5), 371-376 (2000).
  38. Wehner, A., Grasses, T., Jahns, P. De-epoxidation of violaxanthin in the minor antenna proteins of photosystemII, LHCB4, LHCB5, and LHCB6. The Journal of biological chemistry. 281 (31), 21924-21933 (2006).
  39. Croce, R., Canino, G., Ros, F., Bassi, R. Chromophore organization in the higher-plant photosystem II antenna protein CP26. Biochemistry. 41 (23), 7334-7343 (2002).
  40. Caffarri, S., Passarini, F., Bassi, R., Croce, R. A specific binding site for neoxanthin in the monomeric antenna proteins CP26 and CP29 of Photosystem II. FEBS letters. 581 (24), 4704-4710 (2007).
  41. Hobe, S., Förster, R., Klingler, J., Paulsen, H. N-proximal sequence motif in light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein is essential for the trimerization of light-harvesting chlorophyll a/b complex. Biochemistry. 34 (32), 10224-10228 (1995).
  42. Kuttkat, A., Hartmann, A., Hobe, S., Paulsen, H. The C-terminal domain of light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein is involved in the stabilisation of trimeric light-harvesting complex. European journal of biochemistry / FEBS. 242 (2), 288-292 (1996).
  43. Rupprecht, J., Paulsen, H., Schmid, V. H. Protein domains required for formation of stable monomeric Lhca1- and Lhca4-complexes. Photosynthesis research. 63 (3), 217-224 (2000).
  44. Yang, C., et al. The negatively charged amino acids in the lumenal loop influence the pigment binding and conformation of the major light-harvesting chlorophyll a/b complex of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (11), 1463-1470 (2008).
  45. Rogl, H., Kühlbrandt, W. Mutant trimers of light-harvesting complex II exhibit altered pigment content and spectroscopic features. Biochemistry. 38 (49), 16214-16222 (1999).
  46. Yang, C., Kosemund, K., Cornet, C., Paulsen, H. Exchange of pigment-binding amino acids in light-harvesting chlorophyll a/b protein. Biochemistry. 38 (49), 16205-16213 (1999).
  47. Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. Mutation analysis of Lhca1 antenna complex. Low energy absorption forms originate from pigment-pigment interactions. The Journal of biological chemistry. 277 (39), 36253-36261 (2002).
  48. Morosinotto, T., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. The nature of a chlorophyll ligand in Lhca proteins determines the far red fluorescence emission typical of photosystem I. The Journal of biological chemistry. 278 (49), 49223-49229 (2003).
  49. Ballottari, M., Mozzo, M., Croce, R., Morosinotto, T., Bassi, R. Occupancy and functional architecture of the pigment binding sites of photosystem II antenna complex Lhcb5. The Journal of biological chemistry. 284 (12), 8103-8113 (2009).
  50. Croce, R., et al. Origin of the 701-nm fluorescence emission of the Lhca2 subunit of higher plant photosystem I. The Journal of biological chemistry. 279 (47), 48543-48549 (2004).
  51. Morosinotto, T., Mozzo, M., Bassi, R., Croce, R. Pigment-pigment interactions in Lhca4 antenna complex of higher plants photosystem I. The Journal of biological chemistry. 280 (21), 20612-20619 (2005).
  52. Mozzo, M., Morosinotto, T., Bassi, R., Croce, R. Probing the structure of Lhca3 by mutation analysis. Biochimica et biophysica acta. 1757 (12), 1607-1613 (2006).
  53. Mozzo, M., Passarini, F., Bassi, R., van Amerongen, H., Croce, R. Photoprotection in higher plants the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (10), 1263-1267 (2008).
  54. Wientjes, E., Roest, G., Croce, R. From red to blue to far-red in Lhca4 how does the protein modulate the spectral properties of the pigments. Biochimica et biophysica acta. 1817 (5), 711-717 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja pigment wekspresja bia ekultrawirowanie w gradiencie sacharozyspektroskopia fluorescencyjnadichroizm ko owywi zanie chlorofilukontrola sk adu pigment wmutageneza bia ek rekombinowanych
In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.