Telomeraza ulega ekspresji w mózgu noworodka, a także w różnych obszarach mózgu dorosłego. Przedstawiamy nietoksyczny, oszczędzający czas test TRAP do analizy aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu myszy i wykrywania różnic w aktywności telomerazy między mózgami myszy płci męskiej i żeńskiej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (TRAP)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Telomeraza, rybonukleoproteina, jest odpowiedzialna za utrzymanie długości telomerów, a tym samym promowanie integralności genomu, proliferacji i długości życia. Ponadto telomeraza chroni mitochondria przed stresem oksydacyjnym i nadaje odporność na apoptozę, co sugeruje jej możliwe znaczenie dla przetrwania niemitotycznych, wysoce aktywnych komórek, takich jak neurony. Wcześniej wykazaliśmy zdolność nowych aktywatorów telomerazy do zwiększania aktywności i ekspresji telomerazy w różnych regionach mózgu myszy oraz do ochrony komórek neuronów ruchowych przed stresem oksydacyjnym. Wyniki te wzmacniają pogląd, że telomeraza bierze udział w ochronie neuronów przed różnymi uszkodzeniami. Aby podkreślić rolę telomerazy w mózgu, porównujemy tutaj aktywność telomerazy w mózgu myszy płci męskiej i żeńskiej oraz jej zależność od wieku. Test TRAP jest standardową metodą wykrywania aktywności telomerazy w różnych tkankach lub liniach komórkowych. Tutaj pokazujemy analizę aktywności telomerazy w trzech regionach mózgu myszy poprzez niedenaturacyjną ekstrakcję białek przy użyciu buforu do lizy CHAPS, a następnie modyfikację standardowego testu TRAP.
W tym dwuetapowym teście, endogenna telomeraza wydłuża określony substrat telomerazy (starter TS) poprzez dodanie powtórzeń TTAGGG 6 bp (reakcja telomerazy). Produkty reakcji telomerazy są amplifikowane w reakcji PCR, tworząc drabinę DNA o przyrostach 6 pz. Analiza drabiny DNA odbywa się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości 4,5%, a następnie barwienia bardzo czułym barwieniem kwasem nukleinowym.
W porównaniu do tradycyjnego testu TRAP, który wykorzystuje radioaktywne dCTP znakowane 32P do wykrywania DNA i elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozwiązywania drabiny DNA, ten protokół oferuje nietoksyczny, oszczędzający czas test TRAP do oceny aktywności telomerazy w mózgu myszy, wykazując zdolność do wykrywania różnic w aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu myszy żeńskiej i męskiej.
Wprowadzenie
Telomeraza to rybonukleoproteina złożona z odwrotnej transkryptazy telomerazy (TERT), podjednostki katalitycznej telomerazy i składnika RNA (TERC). Kanoniczną rolą telomerazy jest zachowanie właściwej długości telomerów poprzez dodawanie powtarzających się sekwencji (TTAGGG) do końców telomerowych, promując w ten sposób integralność genomu i proliferację komórek1. Dodatkowe role przypisano TERT w komórkach, tj. nadaje on odporność na apoptozę indukowaną przez różne czynniki uszkadzające2, chroni ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste przed stresem oksydacyjnym3 i odgrywa rolę pro-survivalową w całkowicie zróżnicowanych neuronach poprzez asocjację z ziarnistościami TIA1 dodatniego RNA4
.TERT ulega ekspresji i jest aktywny głównie w komórkach dzielących się somatycznie i w większości typów nowotworów, podczas gdy ekspresja enzymu i poziomy aktywności są ściśle regulowane w komórkach niedzielących się5,6. Badania wykazały, że w mózgu gryzoni aktywność telomerazy staje się niewykrywalna do 10 dnia po urodzeniu, podczas gdy mRNA TERT utrzymuje się na niższym poziomie do dorosłości7. Inne badania wykazały aktywność telomerazy w strefie podkomorowej dorosłego, opuszki węchowej, hipokampie oraz w dorosłym móżdżku i korze mózgowej8. Niedawno wykazaliśmy, że nowe związki, które zwiększają ekspresję i aktywność telomerazy w mózgu i rdzeniu kręgowym, wywierają działanie neuroprotekcyjne u myszy z wstrzyknięciem N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), opóźniają początek i postęp stwardnienia zanikowego bocznego u myszy transgenicznych SOD1 i zwiększają przeżywalność neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym tych myszy9. Aby w pełni zrozumieć pro-survivalową rolę telomerazy w neuronach i mózgu, konieczne jest opracowanie prostego i stosunkowo czułego szybkiego testu do wykrywania aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu.
Protokół wielokrotnej amplifikacji telomerów (TRAP) jest dobrze znanym czułym testem łączącym kanoniczną aktywność telomerazy i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). W tym teście telomeraza dodaje powtórzenia TTAGGG do oligonukleotydu substratu telomerazy (startera TS), a następnie amplifikację PCR, która generuje drabinkę DNA 6 par zasad (bp) przy użyciu startera odwróconego TS – ACX. Rozdział 32DCTP znakowane P służą do wykrywania małej ilości produktów PCR. Drabina DNA jest rozwiązywana przez sekwencjonowanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Zarówno intensywność prążków DNA, jak i długość drabiny DNA odzwierciedlają odpowiednio ilość aktywnych cząsteczek enzymu i ich procesywność10.
Ten tradycyjny test ma kilka głównych trudności: niebezpieczeństwo narażenia na substancje radioaktywne, duże i trudne do opanowania sekwencjonowanie PAGE oraz zużycie czasu działania żelu i naświetlenie filmu produktu radioaktywnego (w obu przypadkach przez noc).
Ten protokół oferuje ulepszony test oparty na miniżelu agarozowym nieradioaktywnym. Drabinka DNA 6 pz jest rozwiązywana przy użyciu 4,5% żelu agarozowego o wysokiej rozdzielczości, a wykrywanie odbywa się za pomocą bardzo czułego barwienia kwasem nukleinowym. Połączenie użycia miniżelu agarozowego o wysokiej rozdzielczości i wrażliwego barwienia kwasem nukleinowym zapewnia łatwy w obsłudze test, eliminuje niebezpieczeństwo narażenia na radioaktywność i znacznie skraca całkowity czas trwania testu z 3 dni do kilku godzin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną ds. eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Ben-Guriona (IL-39-08-2010).
1. Ekstrakcja białka mózgu myszy
- Przygotować 3 probówki po 15 ml każda, zawierające 5 ml roztworu Ringera i umieścić probówki na lodzie.
- Poświęć mysz za pomocą znieczulenia izofluranem (UWAGA – użyj kaptura chemicznego) na 10-20 sekund, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i natychmiastowe ścięcie.
- Usuń mózg z czaszki i płucz przez kilka sekund lodowatym roztworem Ringera, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej.
- Za pomocą ostrza chirurgicznego oddziel móżdżek (CR) i pień mózgu (BS) od kory czołowej. Następnie oddziel móżdżek od pnia mózgu i odetnij płat czołowy (FL) od kory czołowej; Usuń opuszkę węchową z płata czołowego. Umieść 3 obszary mózgu w wyznaczonych probówkach o pojemności 15 ml.
- Homogenizować tkankę w każdej probówce. Dodaj świeży, lodowaty roztwór Ringera, tak aby każda probówka zawierała taką samą objętość i wirować przez 7 minut przy 800 x g.
- Usunąć supernatant i dodać 100 μl buforu do lizy CHAPS do każdej probówki. Dobrze wymieszać, przepuszczając roztwór kilka razy (~10) przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 21 G i inkubować na lodzie przez 30 minut.
- Przenieść zawartość każdej probówki do nowej probówki do mikrowirówki i wirować przez 30 minut przy 13 000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i oznaczyć stężenie białka przy użyciu wcześniej ustalonej metody. Przechowywać ekstrakty białkowe w porcjach po 10 μl w temperaturze -80 °C.
2. Test TRAP Przygotowanie instrumentów, roztworów reakcyjnych i obliczenia rozcieńczenia białka
- Przygotować odpowiednią liczbę znakowanych probówek do mikrowirówek do rozcieńczeń ekstraktu białkowego i buforu reakcyjnego telomerazy. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, należy wykonywać wszystkie pipetowanie zgodnie z protokołem, używając końcówek filtrujących.
- Rozmrozić następujące roztwory na lodzie: mieszanina reakcyjna TRAP 10x, starter TS, dNTP, UPW i ekstrakty białkowe (patrz tabela materiałów dla odczynników i stężeń odczynników).
- Rozcieńczyć roztwór ekstraktu białkowego do końcowego stężenia 1 μg/μl przy użyciu ultraczystej wody (UPW).
3. Reakcja telomerazy
- Przygotować mieszaninę reakcyjną telomerazy, dodając do probówki mikrowirówki: 2 μl mieszanki TRAP (10x), 1 μl startera TS (0,1 μg), 1 μl dNTP (10 mM) i 15 μl UPW. W przypadku wielu próbek pomnóż wyżej wymienione objętości przez liczbę próbek plus 1.
- Dodać 19 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej probówki reakcyjnej i dodać 1 μl rozcieńczonego ekstraktu białkowego (1 μg białek) do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 20 μl.
- Umieścić probówki reakcyjne w łaźni wodnej podgrzanej o temperaturze 30 °C na 45 minut.
4. Reakcja PCR
- Piętnaście minut przed końcem reakcji telomerazy rozmrozić następujące roztwory: starter ACX, bufor Titanium Taq, UPW.
- Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR, dodając do probówki mikrowirówki: 2,5 μl buforu tytanowego Taq (10x), 1 μl startera ACX (0,1 μg), 2 μl UPW (1 μl, gdy stosuje się IC) i 0,5 μl polimerazy tytanowej Taq (50x). W przypadku wielu próbek należy pomnożyć wyżej wymienione objętości przez liczbę próbek plus 2.
- Dodać 6 μl mieszaniny PCR do każdej probówki PCR i dodać całą objętość reakcji telomerazy (20 μl) do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 26 μl.
- Włóż probówki PCR do termocyklera PCR i uruchom następujący program:
- 90 °C – 2 min.
- 94 °C – 30 sek.*
- 60 °C – 30 sek.*
- 72 °C – 45 sek.*
- 72 °C – 2 min.
Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
* = 34 cykle
5. Przygotowanie mini-żelu agarozowego, bieganie próbek i barwienie żelem
- Dodać 25 ml schłodzonego buforu do elektroforezy (TBE) i mieszadło do zlewki o objętości 2-4 razy większej od roztworu buforowego i powoli wsypać 1,125 g proszku agarozy o wysokiej rozdzielczości (HR), podczas gdy roztwór jest szybko mieszany. Wyjmij mieszadło, przykryj zlewkę folią spożywczą i wbij mały otwór w celu wentylacji. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej na "niskiej" mocy przez 3 minuty, a następnie przełącz na "wysoką" moc i podgrzewaj roztwór w krótkich impulsach, uważając, aby nie spowodować rozlania. Zwróć uwagę, że gdy piana powstała w wyniku ogrzewania stanie się dużymi bąbelkami i zniknie po kilku sekundach, agaroza jest gotowa.
- Przelać żel do poziomego aparatu do mini-żelu, po zestaleniu się żelu w temperaturze pokojowej pozostawić żel do schłodzenia przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed użyciem.
- Załadować każdy tor 25 μl próbki TRAP (20 μl produktów TRAP PCR i 5 μl 6-krotnego barwnika w żelu) i uruchomić pod napięciem 110 V przez 3 godziny w chłodni o temperaturze 4 °C.
- Przygotuj barwnik kwasem nukleinowym 3x roztwór roboczy, dodając 15 μl 10 000x barwienie kwasów nukleinowych, roztwór podstawowy do 50 ml podwójnej wody destylowanej (DDW) z 0,1 M NaCl (0,29 g). Plamić żel przez 20 minut, delikatnie wstrząsając.
- Użyj transiluminatora UV o długości fali 302 nm, aby zobaczyć pasma DNA drabinki TRAP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ekstrakty białkowe z całych komórek przygotowano z płata czołowego (FL), pnia mózgu (BS) i móżdżku (CR), pochodzące od 3 samic i 3 samców myszy CD-1 w wieku 1 i 3 miesięcy dla zmodyfikowanego testu TRAP oraz od 3 samców myszy CD-1 w wieku 2 miesięcy dla radioaktywnego testu TRAP. Aktywność telomerazy wykrywano w 1 µg ekstraktu białkowego przy użyciu zmodyfikowanego testu TRAP oraz w 2 µg ekstraktu białkowego dla radioaktywnego testu TRAP. Wykrywanie aktywności telomerazy za pomocą radioaktywnego testu TRAP oraz zmodyfiko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza aktywności telomerazy w mózgu myszy za pomocą testu TRAP składa się z 4 głównych etapów: 1) ekstrakcja białek z określonych obszarów tkanki mózgowej 2) wydłużenie startera TS przez telomerazę - reakcja telomerazy 3) amplifikacja produktów reakcji telomerazy przez PCR 4) oddzielenie produktów PCR za pomocą żelu agarozowego o wysokiej rozdzielczości.
Ten zmodyfikowany test TRAP rozwiązuje dwie główne trudności, które wynikają z tradycyjnego testu: zastosowanie radioaktywnych dCTP do czuł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez technologię B.G. Negev i wkład Lindy Powers.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Wykonany ręcznie, wymieszaj następujące ilości w UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (zakupiony od Sigma). Podwielokrotności są zamrażane w temperaturze -20 °C. | ||
| Roztwór | Wykonany ręcznie, wymieszaj następujące składniki w DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4· H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glukoza bezwodna. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Ostrożnie obchodź się z kapturem chemicznym |
| dNTPs (10 mM) | Podkład Sigma | D7295 | |
| TS (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA uporządkowane w formacie SUCHYM i UPW dodane zgodnie z wymaganym stężeniem | |
| Starter ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTACCCCTAACC-3') | Sigma | DNA zamówione w formacie SUCHYM i UPW dodane zgodnie z wymaganymi stężenie | |
| Tytan Taq Polimeraza / Bufor | Clontech | S1792 / S1793 | |
| Agaroza o wysokiej rozdzielczości | Sigma | A4718 | Każda wysokiej jakości agaroza o wysokiej rozdzielczości może być nasycona |
| Aparat mini-żelowy | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Barwienie kwasem nukleinowym (GEL-RED) | Podkład IC Biotium | 41003 | |
| (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA uporządkowane w formacie SUCHYM i dodane do wody ultraczystej zgodnie z wymaganym stężeniem | |
| Bufor do lizy CHAPS | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9852S | Dodaj PMSF (inhibitor proteazy) do końcowego stężenia 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| Myszy CD-1 | HARLAN Laboratories INC. |
Bibliografia
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602(2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
