Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Summary

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Abstract

Padaczka, dotykająca około 1% populacji, obejmuje grupę zaburzeń neurologicznych charakteryzujących się okresowym występowaniem napadów, które zakłócają normalne funkcjonowanie mózgu. Pomimo leczenia obecnie dostępnymi lekami przeciwpadaczkowymi ukierunkowanymi na funkcje neuronalne, jedna trzecia pacjentów z padaczką jest oporna na farmakoleksję. W tym stanie chirurgiczna resekcja obszaru mózgu powodującego drgawki pozostaje jedynym alternatywnym leczeniem. Badania ludzkich tkanek padaczkowych przyczyniły się do zrozumienia nowych mechanizmów padaczkowych w ciągu ostatnich 10 lat. Rzeczywiście, tkanki te generują spontaniczne międzynapadowe wyładowania padaczkowe, a także farmakologicznie wywołane zdarzenia ictal, które można zarejestrować za pomocą klasycznych technik elektrofizjologicznych. Co ciekawe, matryce wieloelektrodowe (MEA), które są mikrowytwarzanymi urządzeniami zawierającymi szereg przestrzennie rozmieszczonych mikroelektrod, dają wyjątkową możliwość jednoczesnej stymulacji i rejestrowania potencjałów pola, a także potencjałów czynnościowych wielu neuronów z różnych obszarów tkanki. W związku z tym nagrania MEA stanowią doskonałe podejście do badania przestrzenno-czasowych wzorców spontanicznych zdarzeń internapadowych i wywołanych napadów padaczkowych oraz mechanizmów leżących u podstaw wystąpienia i rozprzestrzeniania się napadów. Tutaj opisujemy, jak przygotować ludzkie wycinki korowe z chirurgicznie wyciętej tkanki i rejestrować za pomocą MEA zdarzenia międzynapadowe i podobne do ictal ex vivo.

Introduction

Padaczka to przewlekła choroba, w której napady padaczkowe, które są przerywanymi, wzorzec wyładowań trwającymi od kilku sekund do kilkudziesięciu sekund na zapisach elektroencefalograficznych (EEG) związanych z objawami klinicznymi, przerywają stan międzynapadowy, charakteryzujący się obecnością synchronicznych wyładowań neuronalnych trwających dziesiątki milisekund i zwanych zdarzeniami internapadowymi¹. Dotyka około 1% światowej populacji i chociaż napady są kontrolowane u większości pacjentów, około jedna trzecia osób z padaczką nie wykazuje odpowiedniej odpowiedzi na leki przeciwpadaczkowe². W tym stanie, zwanym padaczką farmooporną, którego mechanizmy nadal muszą być jasno określone, chirurgiczna resekcja określonej części mózgu zidentyfikowanej jako strefa początku napadu pozostaje jedynym alternatywnym leczeniem dającym pozytywny wynik dla pacjentów. W ten sposób wycięte próbki z operacji dają możliwość zbadania mechanizmów wyładowań międzynapadowych oraz powstawania i rozprzestrzeniania się napadów padaczkowych, a także farmakooporności na żywotną ludzką tkankę ośrodkowego układu nerwowego ex vivo.

Matryce wieloelektrodowe (MEA), składające się z układu przestrzennie rozmieszczonych mikroelektrod, pozwalają na jednoczesną stymulację i rejestrację aktywności elektrofizjologicznej z kilku miejsc tkanki, zapewniając tym samym doskonałe podejście do badania czasoprzestrzennych wzorców spontanicznej i wywołanej aktywności. Technika ta, po raz pierwszy zastosowana do monitorowania zmian rozwojowych w zakresie aktywności hodowli komórek nerwowych³, a następnie dostosowana do ostrych i organotypowych wycinków mózgu i rdzenia kręgowego ^4-6, jest obecnie uważana za cenne narzędzie elektrofizjologiczne.

Obecny protokół opisuje, jak przygotować ludzkie wycinki korowe z chirurgicznie wyciętej tkanki i rejestrować za pomocą MEA wiarygodne zdarzenia międzynapadowe ex vivo i podobne do napadów z tych wycinków. Technika ta pozwala zatem na zajęcie się podstawowymi mechanizmami leżącymi u podstaw inicjacji, rozprzestrzeniania się i działania leków przeciwpadaczkowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i sieciowym. Wszystkie procedury stosowane do pozyskiwania, przygotowywania, przechowywania i rejestrowania ludzkich plastrów są tutaj szczegółowo opisane.

Protocol

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest zgodny z wytycznymi francuskiego "Comité Consultatif National d'Ethique" i jest deklarowany przez INSERM jako działalność windykacyjna.

1. Resekcja ludzkiej tkanki padaczkowej

1. Pacjentów
   1. Pozyskaj tkankę mózgową od pacjentów cierpiących na nieuleczalną padaczkę. Uzyskaj pisemną świadomą zgodę przed zabiegiem.
   2. U wszystkich operowanych pacjentów z padaczką należy przeprowadzić obszerne badanie przedoperacyjne, w tym badanie neurologiczne, ocenę neuropsychologiczną, EEG powierzchniowe i neuroobrazowanie (MRI, a czasem ¹⁸FDG-PET; Ryc. 1A), a następnie pooperacyjne badanie histologiczne wyciętej tkanki (ryc. 1B). UWAGA: Operacja jest wskazana, gdy różnorodne eksploracje lokalizują podobnie strefę początku napadu i gdy korzyści z jej usunięcia przewyższają ryzyko chirurgiczne.
2. chirurgia
   1. Utrzymuj leki przeciwpadaczkowe przed operacją. Wykonać zabieg chirurgiczny w znieczuleniu ogólnym: indukcję wziewnym sewofluranem (6% dostarczony stosunek i 100% wdychana frakcja_O2), dożylnie sufentanyl (0,3 μg/kg) i antrakurium (0,5 mg/kg), a następnie leczenie podtrzymujące sufentanylem dożylnym (0,5 μg/kg/godz.) i wziewnym sewofluranem (1 MAC).
   2. Użyj systemu neuronawigacji, aby umożliwić precyzyjną lokalizację uszkodzonej kory mózgowej (ryc. 1C). Po nacięciu skóry wykonaj otwór w kości, a następnie kraniotomię za pomocą wiertła o wysokim rozlaniu. Delikatnie podnieś płat kostny i otwórz oponę twardą nożyczkami (ryc. 1D).
   3. Użyj śródoperacyjnych ultradźwięków, aby ułatwić identyfikację nieprawidłowej kory oraz narzędzi mikrochirurgicznych i aspiratora ultradźwiękowego pod mikroskopem operacyjnym.
   4. Koagulować i ciąć płaszczyznę pajęczynówkowo-pajęczynówkową zgodnie z granicami bruzdy. Użyj rozwarstwienia podskórnego, aby uwolnić korę z pia wokół obszaru uszkodzonego.
   5. Przeciąć istotę białą pod nieprawidłową korą, aby wykonać jednoczęściową resekcję "en bloc", oszczędzając jak najwięcej naczyń krwionośnych. Unikaj traumatycznych manipulacji korą mózgową.
   6. Wytnij plasterek o grubości 1 cm z wyciętej tkanki wzdłuż kierunku prostopadłego do powierzchni pial, w tym dna bruzdy i kory przejściowej.

2. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do przygotowania plastrów, inkubacji i zapisu

1. ACSF do przygotowania plastrów
   1. Przygotować 1 l ACSF^7,8 na bazie sacharozy, zawierającego (w mM): 250 sacharozy, 3 KCl, 25 NaHCO₃, 10 D-glukozy, 1 CaCl₂, 10 MgCl₂; rozpuścić te sole w wodzie dejonizowanej i natleniać roztwór karbogenem przez co najmniej 10 minut.
   2. Umieścić ~700 ml sacharozy ACSF w temperaturze -80 °C przez 50-60 min (lub -150 °C przez 15-20 min). Pozostałą część roztworu należy przechowywać pod natlenieniem w lodzie. UWAGA: ACSF do przygotowania plastrów można przechowywać w temperaturze 4 °C; w takim przypadku dodać CaCl₂ i MgCl₂ w dniu eksperymentu, przed schłodzeniem.
2. ACSF do inkubacji i rejestracji plastrów
   1. Przygotować co najmniej 3 litry zapisu ACSF^7,8, zawierającego (w mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 NaHCO₃, 10 D-glukozy, 1,6 CaCl₂, 1,3 MgCl₂; rozpuścić te sole w wodzie dejonizowanej i natlenić roztwór karbogenem. Przed dodaniem MgCl₂ zachowaj trochę ACSF, aby wykonać nagrania w 0 Mg²⁺ ACSF. UWAGA: Inkubacyjny/rejestrujący ACSF może być przechowywany w temperaturze 4 °C; w takim przypadku dodać CaCl₂ i MgCl₂ w dniu eksperymentu.

3. Sprzęt do inkubacji i nagrywania Slice

1. Komora interfejsu do inkubacji plastrów
   1. Użyj komory na plasterki mózgu, aby utrzymać żywe plastry ex vivo w trybie interfejsu. UWAGA: Komora składa się z dolnej części, w której znajdują się elementy grzewcze i czujnikowe oraz ceramiczny bełkotka i jest wypełniona wodą destylowaną, oraz górnej części, w której plastry spoczywają na arkuszu tkanki soczewki w płaskiej przestrzeni pośrodku komory (rysunek 2A-B).
   2. Użyj dwóch oddzielnych drobnych rurek PTFE, przez które wstępnie natleniony ACSF dostaje się do komory. UWAGA: Rurki zwijają się spiralnie w podgrzanej wodzie i docierają do górnej części komory; Następnie roztwór wydostaje się za pomocą działania kapilarnego z tkanką soczewki, która przenosi roztwór do studzienek wyjściowych.
   3. Podłączyć rurki PTFE komory interfejsu do pompy perystaltycznej, aby umożliwić ciągłą perfuzję plastrów ze wstępnie natlenionym medium.
   4. Utrzymuj wysokie napięcie tlenu poprzez natlenianie karbogenem (95%_O2 i 5% CO₂) przez ceramiczny bełkot. UWAGA: Ta podgrzana i zwilżona mieszanina gazów dociera do plastrów w górnej części komory przez odpowiednie otwory.
   5. Utrzymuj temperaturę w górnej części komory, podłączając komorę do regulatora temperatury, za pomocą specjalnego dwustronnego, posiadającego złącze dla elementu grzejnego komory i zewnętrzny czujnik temperatury na jednym końcu. Umieść czujnik w pobliżu plastrów, aby sprawdzić temperaturę podczas inkubacji (Rysunek 2C).
2. Zapisy z matrycą wieloelektrodową
   1. Należy stosować płaskie układy wieloelektrodowe ze 120 elektrodami z azotku tytanu (średnica 30 μm) izolowanymi azotkiem krzemu i wewnętrzną elektrodą odniesienia, ułożonymi w matrycy 12 x 12 z odstępami od środka do środka 200 μm. UWAGA: Możliwe są inne konfiguracje o różnej średnicy i rozstawie elektrod. W szczególności chip MEA można poszerzyć w celu pobierania próbek z większych warstw tkanek ludzkich.
   2. Odbieranie sygnałów elektrycznych przy częstotliwości 10 kHz za pomocą systemu MEA2100-120 (wzmacniacz wstępny i filtrujący ze zintegrowaną akwizycją danych i przetwornikiem analogowo-cyfrowym, 16-bitowa rozdzielczość danych, zakres napięcia wejściowego i szerokość pasma regulowane za pomocą oprogramowania) za pomocą dedykowanego oprogramowania (MC_Rack). UWAGA: Scena główna MEA2100 jest wyposażona w metalową płytkę do mocowania podgrzewanego elementu perfuzyjnego za pomocą uchwytów magnetycznych, aby w sposób ciągły perfekować plastry przez całą sesję nagraniową.
   3. Przytrzymaj tkankę na MEA za pomocą małej domowej roboty platynowej kotwicy, która zapewnia dobre sprzężenie elektryczne między plastrem a elektrodami.

4. Przygotowanie komory interfejsu i narzędzi do rozcinania i krojenia

1. Komora interfejsu
   1. Napełnij dolną część komory interfejsu wodą destylowaną. Upewnij się, że poziom wody całkowicie zanurza element grzejny i znajduje się od 2 do 4 mm poniżej połączenia między dolną i górną częścią komory. Sprawdzaj ten poziom codziennie przed włączeniem ogrzewania, aby uniknąć uszkodzenia elementu grzejnego.
   2. Podłącz komorę do źródła karbogenu, wyposażonego w wtórny regulator przepływu do precyzyjnej regulacji ciśnienia gazu.
   3. Wytnij arkusz tkanki soczewki, aby dopasować się do płaskiej powierzchni komory plastra i umieść go blisko probówek z roztworem wejściowym, aby każdy pęcherzyk mógł uciec z linii wejściowej przed dotarciem do plasterków.
   4. Wytnij dwa kawałki nici bawełnianej o długości tak długiej, jak kawałek tkanki soczewki i umieść je wzdłuż głównych boków płaskiej powierzchni komory. UWAGA: Pomaga to nieznacznie podnieść poziom roztworu perfuzyjnego w komorze.
   5. Ustawić natężenie przepływu pompy perystaltycznej na 1 ml/min i aktywować pompę.
   6. Rozpocznij natlenianie wody w dolnej części komory.
   7. Ustaw temperaturę regulatora temperatury na 37 °C i włącz go. Przykryj górną część komory interfejsu kawałkiem parafilmu i odczekaj co najmniej 30 minut, aż temperatura wzrośnie i ustabilizuje się.
2. Narzędzia do rozwarstwiania i krojenia
   1. Przygotuj zestaw preparacyjny składający się z dwóch cienkich kleszczy, szpatułki, małej łyżki i ostrza; dwóch szklanych szalek Petriego, dwóch szczotek oraz kleju cyjanoakrylowego.
   2. Ustaw parametry wibratomu: grubość, 400 μm; częstotliwość, 70 - 90 Hz; amplituda, 0,9 - 1 mm, prędkość: 0,1 mm/sek.

5. Przygotowanie ludzkiego plastra kory mózgowej

1. Wyjąć ACSF na bazie sacharozy z zamrażarki w temperaturze -80 °C i wymieszać w celu uzyskania pewnego rodzaju błota pośniegowego. Natlenić go karbogenem, umieścić ~250 ml w szklanej butelce i przechowywać w butelce Dewara wypełnionej lodem, udając się do sali operacyjnej szpitala po tkankę. W międzyczasie utrzymuj resztę w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Podczas operacji neurochirurg wycina niewielki blok tkanki korowej. Natychmiast umieścić próbkę w lodowatej sacharozie ACSF w celu przeniesienia do laboratorium.
2. Czas potrzebny na transfer ze szpitala do laboratorium należy ograniczyć do maksymalnie 30 minut. W laboratorium wyjmij natleniony ACSF na bazie sacharozy z zamrażarki o temperaturze -20 °C, wymieszaj go do uzyskania błota pośniegowego, napełnij szalkę Petriego i tackę buforową wibratomu i rozpocznij natlenianie obu karbogenów. Ostrożnie wyjmij kawałek ludzkiej tkanki z butelki łyżką i włóż go na szalkę Petriego (ryc. 2D).
3. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń skrzepy krwi, naczynia i opony mózgowe, aby uniknąć oporu podczas krojenia. Usuń opony mózgowe, składające się z pia-matter, zaczynając od boków bloku tkankowego, uważając, aby nie uszkodzić powierzchni korowej. Za pomocą ostrza odetnij bok tkanki, aby uzyskać płaską powierzchnię, która zostanie przyklejona do płytki próbki wibratomu. UWAGA: Opony mózgowe, składające się z materii pia, usuwa się zaczynając od boków bloku tkankowego, zwracając uwagę, aby nie uszkodzić powierzchni kory mózgowej.
4. Jeśli blok tkanki jest większy niż komora MEA, przed przyklejeniem go do płytki próbki należy wyciąć kawałek o odpowiednich wymiarach (ryc. 2E).
5. Przyklej tkankę, aby uzyskać poprzeczne plastry kory mózgowej, włóż ją do tacki buforowej i pokrój plastry o grubości 400 μm z niską prędkością (0,1 mm/s) (ryc. 2F).
6. Wyciąć kawałki tkanki soczewki o wymiarach plasterka; za pomocą szpatułki i pędzla przenieść plastry na te tkanki soczewki i inkubować je w komorze fazowej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem nagrań (Rysunek 2G-I). Ciągle przechowuj plastry w tych samych warunkach aż do użycia. UWAGA: Umieszczanie plasterków na papierze do soczewek jest ważnym krokiem ułatwiającym zarówno perfuzję dolnej strony plastrów, jak i wyjmowanie plasterków z komory interfejsu przed nagraniem.
   1. Podczas przenoszenia plastrów na tkankę soczewki należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie, unikając dotykania szczoteczką obszaru warstwy korowej.
   2. Przygotuj plastry pojedynczo i natychmiast przenieś każdy z nich do komory interfejsu, aby zapewnić odpowiedni dopływ tlenu i temperaturę; pokrój blok wyciętej tkanki tak szybko, jak to możliwe.

6. Przygotowanie konfiguracji MEA do nagrań

1. Podłącz system perfuzyjny do pompy perystaltycznej, a system MEA do komputera. Natlenić ACSF nagrania. Umieść pusty chip MEA wewnątrz amplifier.
2. Ustaw regulator temperatury elementu kaniuli tak, aby osiągnął 37 °C w komorze MEA i rozpocznij perfuzję z prędkością 5-6 ml/min. UWAGA: Zwykle konieczne jest ustawienie temperatury o 3-4 °C wyższej niż żądana, w zależności od temperatury w pomieszczeniu i natężenia przepływu.
   1. Sprawdź temperaturę w komorze MEA za pomocą dokładnego termometru, umieszczając go jak najbliżej środka, nie dotykając obszaru elektrody.
3. Uruchom oprogramowanie do nagrywania i sprawdź, czy wszystkie elektrody MEA są dobrze połączone i czy nie ma szumów spowodowanych perfuzją.
4. Rozpocznij MEA_Monitor, aby sprawdzić działanie stołu kamery.

7. Transfer wycinka z komory interfejsu do chipa MEA w celu nagrania

1. Wlej trochę podgrzanego ACSF do szklanej szalki Petriego; za pomocą kleszczy weź plasterek z komory interfejsu, chwytając go przez tkankę soczewki i włóż do szalki Petriego. Ostrożnie oderwij plasterek od tkanki. Jeśli poziom roztworu w komorze interfejsu zostanie starannie dostosowany w czasie inkubacji, plasterek oderwie się od tkanki soczewki tylko poprzez zanurzenie go w roztworze; W przeciwnym razie użyj małej szczotki, aby ułatwić oderwanie.
2. Napełnij chips MEA odrobiną ACSF i za pomocą szpatułki przenieś do niego plasterek. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura delikatnie usuń roztwór, aby plasterek przylegał do obszaru elektrody i przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej kotwicy. Dodać 1 ml ACSF do nagrywania, umieścić chip MEA w amplifier i rozpocząć perfuzję z prędkością 5-6 ml/min (rysunek 2J-L).
3. Sprawdź pozycję wycinka w obszarze nagrywania MEA za pomocą MEA_Monitor, dostosuj ją w razie potrzeby, aby nagrywać z warstw korowych i zrobić zdjęcie. Rozpocznij nagrywanie.

Results

Rejestracja aktywności ludzkiego wycinka kory mózgowej rozpoczyna się podczas perfuzji tkanki z normalnym zapisem ACSF (jak wcześniej opisano)^7,8. W tym stanie, gdy tkanka jest dobrze zachowana podczas operacji, a później podczas transferu tkanek ze szpitala i przygotowania plastrów, można zaobserwować spontaniczną aktywność, w postaci małych zdarzeń przypominających incydenty międzynapadowe, wykrywane z małych skupisk elektrod MEA. Wyładowania międzynapadowe polegały na potencjale pola, zwykle dwufazowym, składającym się z początkowego ostrego ugięcia ujemnego, dochodzącego do kilkudziesięciu mikrowoltów, po którym następowała dłuższa fala przeciwna trwająca kilkadziesiąt milisekund. Szybkie działania wielooddziałowe są zwykle osadzone w potencjale pola głównie w początkowej części. Reprezentatywny przykład aktywności podobnej do międzynapadowej zilustrowano na rysunku 3Aii, na którym pokazano ślad zarejestrowany przez elektrodę MEA.

Aby zarejestrować napady padaczkowe z ludzkich wycinków kory mózgowej in vitro, konieczne jest ich perfuzję za pomocą "epileptogennego" ACSF, w którym^Mg2+ jest nieobecny, a K⁺ jest podniesiony do 6 mM, aby zwiększyć pobudliwość tkanek¹ (sam wzrost K⁺ z 3 do 6 mM nie wystarcza do wywołania napadów; dane nie pokazane). Po rozpoczęciu perfuzji z 0 Mg^{2 +} 6 mM K ⁺ ACSF aktywność wycinków korowych stopniowo wzrasta, a pierwszy napad pojawia się w ciągu 15 do 20 minut (15,4 ± 1,7 min, n = 10, od 5 pacjentów; Rysunek 3 Ai). Wywołaliśmy aktywność podobną do ictal, jak pokazano na rycinie 3, u 75% badanych pacjentów i w 66,7% wszystkich zarejestrowanych wycinków.

Aktywność epilepsji jest rejestrowana z sąsiednich elektrod układu MEA, a porównanie dynamiki początkowej zdarzeń potencjału pola pozwala na badanie miejsca ich powstania i propagacji. Reprezentatywny napad zarejestrowany z wycinka ludzkiej kory mózgowej za pomocą systemu MEA pokazano na rycinie 3B (reprezentatywny ślad napadu zarejestrowany przez pojedynczą elektrodę MEA pokazano w wyższej rozdzielczości czasowej na rysunku 3 Aiii). Należy zauważyć, że napad jest rejestrowany z prawie wszystkich elektrod chipa MEA, co wskazuje, że jest on w stanie rozprzestrzeniać się na duży obszar korowy. Ponadto, patrząc na pojedyncze ślady zarejestrowane z każdej elektrody, można zaobserwować postępującą propagację napadu w tkance: w rzeczywistości zaczyna się on najpierw w obszarze korowym pokrywającym prawą połowę układu elektrod i stopniowo rozprzestrzenia się na obszar pokrywający lewą połowę (tj. porównaj ślady z elektrody L6 i B6; Rysunek 3B).

Rycina 1: Dysplazja korowa i jej chirurgiczne usunięcie. Ogniskowa dysplazja korowa typu Taylora (biała strzałka) osadzona w bruździe lewego płata czołowego jest uwidoczniona na przedoperacyjnym rezonansie magnetycznym (A), a następnie potwierdzona przez badanie histologiczne (B) znakowanie kinazą MAP; pasek skali: 200 μm) pokazujący rozwarstwienie kory mózgowej, nieprawidłowe neurony i ślad na neuronach z niepełną migracją w dolnej istocie białej. Podczas operacji dysplazja jest zlokalizowana zgodnie z danymi MRI za pomocą systemu neuronawigacji (C). Wizualizacja zakrętu zawierającego dysplazję podczas operacji (D).

Rycina 2: Sprzęt i procedura przygotowania plastrów ludzkiej kory mózgowej. Komora interfejsu służy do utrzymywania ludzkich wycinków korowych ex vivo (A); plastry spoczywają na arkuszu tkanki soczewki w płaskiej części górnej części komory (B), gdzie czujnik temperatury (C, po lewej), podłączony do regulatora temperatury (C, po prawej, góra) za pomocą dwustronnego (C, po prawej, u dołu), jest umieszczony w celu utrzymania temperatury 37 °C przez cały czas inkubacji plastra. Po uzyskaniu umieść wycięty blok tkanki na szalce Petriego wypełnionej lodowatym ACSF (D) na bazie sacharozy i usuń skrzepy krwi, naczynia i opony mózgowe, aby ułatwić krojenie. Jeśli blok tkankowy jest większy niż komory MEA, należy wyizolować kawałek o odpowiednich wymiarach za pomocą ostrza (E) i przykleić go do płytki próbki wibratomu (F). Wytnij plastry o grubości 400 μm i za pomocą szpatułki (G) przenieś je na kawałki tkanki soczewki (H) i inkubuj w komorze interfejsu (I). Przed nagraniem usuń tkankę soczewki, zanurzając plasterek w szalce Petriego wypełnionej ACSF i przenieś ją do chipa MEA wypełnionego ACSF za pomocą szpatułki (J). Usuń roztwór, aby plaster przylegał do MEA (K) i utrzymuj go na miejscu za pomocą platynowej kotwy. Umieść MEA we wzmacniaczu (L), rozpocznij perfuzję i nagrywanie.

Rycina 3: Zapisy MEA napadów padaczkowych w warstwach ludzkiej kory mózgowej. (A) Reprezentatywny ślad aktywności wycinka ludzkiej kory mózgowej zarejestrowany przez elektrodę MEA pokazano w panelu i. W obecności normalnego ACSF możliwe jest zaobserwowanie spontanicznej aktywności podobnej do międzygrupowej (mały szary prostokąt, powiększony w panelu ii); następnie, gdy rozpocznie się perfuzja z 0 Mg^{2 +} 6 mM K⁺ ACSF, pierwszy napad pojawia się po ~15 minutowym opóźnieniu, a po nim następują inne zdarzenia w odstępie 2-3 minut. Panel iii pokazuje napad w dużym szarym prostokącie w panelu i z powiększoną skalą. Niebieski ślad ilustruje powiększenie aktywności, zgodnie z niebieską linią i strzałką. Panel iv) pokazuje dane zilustrowane w panelu iii) górnoprzepustowe filtrowane przy 250 Hz, które po powiększeniu ujawniają aktywność wielu jednostek (niebieski ślad). (B) Reprezentatywny zapis napadu padaczkowego w obecności 0 Mg^{2 +} 6 mM K⁺ ACSF ze wszystkich elektrod MEA. Każdy kwadrat reprezentuje elektrodę o wymiarach 12 x 12 MEA i pokazuje 80-sekundowe okno czasowe; linia przerywana wskazuje położenie powierzchni kory mózgowej względem układu MEA.

Discussion

Padaczka farmooporna jest rzadkim schorzeniem, które można badać w tkance ludzkiej in vitro. Pozwala to na badanie epileptycznej kory mózgowej człowieka, która wykazuje specyficzne defekty, które są tylko częściowo odtwarzane w modelach zwierzęcych. Opisana tu metoda pozwala na przygotowanie i rejestrację ex vivo ludzkich tkanek pooperacyjnych z zachowaną żywotnością komórkową i sieciami tak, aby spontanicznie wytwarzały aktywność padaczkową. Zachowanie aktywności podobnej do zarejestrowanej in vivo ma kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów genezy działań patologicznych. Co więcej, takie metody pozwalają na badanie tkanek ludzkich i unikanie niedoskonałych zwierzęcych modeli choroby. Jednak badanie tkanki ludzkiej wymaga synchronizacji między neurochirurgami a laboratorium eksperymentalnym. Transport tkanek wymaga szczególnej ostrożności, aby nie był traumatyczny. Ponadto zarówno ilość próbki, jak i tkanki jest ograniczona. Wreszcie, głównym problemem jest dostęp do odpowiednich tkanek kontrolnych. Dzięki temu preparatowi tkanki pooperacyjne spontanicznie wytwarzają wydzieliny przypominające wydzieliny międzynapadowe w prawidłowym ACSF^7,8. Zdarzenia podobne do napadów mogą być również wywoływane w zmodyfikowanym, prodrgawkowym ACSF, dzięki czemu można badać mechanizmy inicjacji napadu i przejścia ze stanu międzynapadowego do napadów.

Tkanka ludzka może być utrzymywana przy życiu do 10 godzin w warunkach interfejsu. Plastry uznano za żywotne, gdy spontanicznie obserwowano aktywność wielojednostkową lub potencjały pola i gdy takie działania były wywoływane przez zwiększenie pobudliwości poprzez zewnątrzkomórkowy wzrost potasu i / lub spadek magnezu. Chociaż występuje zmienność aktywności, prawdopodobnie odzwierciedlająca różnice w patologiach i obszarach korowych, zbadaliśmy cechy padaczkowe tkanki tylko w zdrowych wycinkach wykazujących spontaniczne wyładowania międzynapadowe i wywołane ictal. W celu zachowania witalności i aktywności tkanek, komora interfejsu jest używana do przechowywania plastrów w temperaturze 36-37 °C w celu odzyskania przed zapisem w systemie MEA. Rzeczywiście, kilka grup wyraźnie wykazało zalety systemu przechowywania opartego na interfejsie w porównaniu ze standardowym przechowywaniem zlewek oraz znaczenie temperatury dla zachowania aktywności sieci, takiej jak spontaniczne ostre tętnienia fal lub oscylacje wywołane cholinergią^9,10. Przechowywanie interfejsów plasterków było wcześniej wykorzystywane do rejestrowania aktywności padaczkowej z ludzkich wycinków hipokampa i podbrzusza^1,11. Przy obecnej technice MEA, po okresie rekonwalescencji po krojeniu w warunkach interfejsu, aktywność sieci jest rejestrowana w warunkach zanurzenia, w obecności wysokiego natężenia przepływu (5-6 ml/min) w temperaturze 37 °C, za pomocą systemu MEA. Zmniejszona średnica (1,8 cm) chipa MEA, która wyznacza komorę o małej objętości (<1,5 ml), wraz ze zwiększonym natężeniem przepływu, zwiększa dopływ tlenu do warstwy, co, jak wykazano, jest krytycznym czynnikiem dla spontanicznych i farmakologicznie wywołanych działań sieciowych^9,10. Co więcej, zmniejszona ilość krążącego ACSF ułatwia przeprowadzanie testów farmakologicznych.

Procedura krojenia jest jednak traumą dla tkanek¹². Zarówno architektura neuronów, jak i homeostaza chlorków wydają się być zaburzone na powierzchni tkanki (50 μm). Pochodzenie czynności rejestrowanych przez chipy MEA, które pobierają próbki tkanki głównie powierzchownie bez głębokiej penetracji, może wynikać z obszarów dotkniętych urazami. Jednak nasze dane pokazują, że potencjały pola zewnątrzkomórkowego wykrywane lokalnie są rejestrowane w większości elektrod MEA, a poprzednie prace pokazują, że są one zintegrowane w odległości od 100 do 200 μm od miejsca rejestracji¹³, co sugeruje, że napady zarejestrowane w naszym preparacie prawdopodobnie nie są wytwarzane przez obszary uurazowe. Ponadto w badaniach przeprowadzonych z użyciem elektrod wolframowych umożliwiających głęboką penetrację, aktywność padaczkowa rejestrowana w tkankach ludzkich jest podobna do obserwowanej u pacjentów z padaczką^1,7,8.

Kolejnym ograniczeniem zapisu tkanek ex vivo jest przerwanie połączeń między różnymi obszarami mózgu, ograniczając w ten sposób dynamiczne neuromodulacje. Może to wyjaśniać, dlaczego w takiej tkance nie rejestruje się spontanicznie żadnego zdarzenia podobnego do ictal, ale musi być wywołane przez manipulację jonową lub stymulację farmakologiczną zwiększającą pobudliwość. W związku z tym w tym protokole zdarzenia podobne do napadów są indukowane przez połączenie zmiany zewnątrzkomórkowego K ⁺ z 3 do 6 mM i zmniejszenia zewnętrznego Mg^{2 +} z 1,3 mM do Mg^{2 +} wolnego ACSF, w celu zwiększenia pobudliwości tkanek i usunięcia bloku receptora NMDA zależnego od Mg^{2 +}. Rzeczywiście, wcześniej wykazano, że aktywność padaczkowa indukowana w ludzkich wycinkach kory nowej i hipokampa przy użyciu ACSF wolnego od Mg^{2 +} przypomina napady elektrograficzne zarejestrowane in vivo¹⁴. Poza tym wykazano, że wydzieliny padaczkowe uzyskane w wycinkach płata skroniowego stają się oporne na klinicznie stosowane leki przeciwdrgawkowe po długotrwałej ekspozycji na ACSF^15,16 wolne od Mg²⁺, co stanowi model do badania farmoopornych zdarzeń podobnych do napadów in vitro.

MEA umożliwiają rejestrację zarówno potencjałów polowych, jak i aktywności wielojednostkowych składających się na neuronalne potencjały czynnościowe ex vivo. Tak więc MEA są potężnym narzędziem elektrofizjologicznym w porównaniu z EEG, które badają potencjały pola generowane przez synchroniczne działania zespołów neuronalnych in vivo, ale nie dają dostępu do zachowań pojedynczych neuronów¹⁷. Chociaż nowsze mikroelektrody mogą rejestrować in vivo wielojednostkowe czynności polegające na neuronalnych potencjałach czynnościowych, są one inwazyjne, więc ich zastosowanie ogranicza się głównie do celów badawczych podczas zapisów wewnątrzczaszkowych. W szczególności zapisy MEA stanowią technikę z wyboru do badania czasoprzestrzennych wzorców zdarzeń padaczkowych, mechanizmów kontrolujących początek i rozprzestrzenianie się napadów oraz działanie klasycznych i nowych leków przeciwpadaczkowych. Co ciekawe, aby rozwikłać typy komórek i podstawy sygnalizacji wyładowań padaczkowych, techniki sortowania kolców i testy farmakologiczne powinny być połączone z technikami MEA. Chociaż MEA mogą dawać dostęp do pojedynczych kolców, nie dostarczają informacji o właściwościach synaptycznych i biofizycznych. W przyszłości inne techniki powinny być sprzężone z zapisami MEA, aby lepiej próbkować zachowanie komórek, aktywność sieci i sygnalizację synaptyczną. Na przykład obrazowanie fluorescencyjne w celu rozwikłania śladów neuronów lub komórek glejowych, a także dynamiki jonów, można połączyć z zapisami MEA. Dalsza analiza histologiczna post hoc może również ujawnić specyficzne zmiany typów komórek, białek lub receptorów, tak aby lokalizacja aktywności padaczkowej mogła być skorelowana z określonymi rearanżacjami struktury nerwowej. System MEAs może być również osadzony w układzie patch-clamp w celu skorelowania pojedynczych komórek lub przewodnictwa z aktywnością populacji. W przyszłości można również zastosować narzędzia optogenetyczne, pod warunkiem, że ludzkie plastry będą mogły być hodowane w dłuższej perspektywie, tak jak ma to miejsce w przypadku plastrów organotypowych, tak aby można było przeprowadzić transfekcję lub zakażenie określonych typów komórek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komora Brain Slice-2: Interfejs	AutoMate Scientific, Inc.	S-BSC2	Wymaga oddzielnego regulatora temperatury
2-kanałowy regulator temperatury Systemy	wielokanałowe, Niemcy	TC02	Umożliwia podłączenie i korzystanie z 2 komór interfejsu.
Specjalny do podłączenia TC01 do S-BSC2 z zewnętrznym odniesieniem PT100	Multichannel Systems, Niemcy	CA3	Numer referencyjny PT100 znajduje się w pobliżu plastrów
6-pinowe złącze wtykowe z	systemami wielokanałowymi	TS-PT100	Zewnętrzne odniesienie do CA3
Stacja robocza MEA do nagrywania danych ze 120-elektrodowych MEA	Multichannel Systems, Niemcy	MEA2100-120	Zawiera stację czołową MEA2100-120 i płytę interfejsu MEA2100. www.multichannelsystems.com
Matryca mikroelektrod do	systemów wielokanałowych	120MEA200/30	Rozstaw elektrod: 200 i mikro; m; średnica elektrody: 30 i mikro; m; Szklany pierścień: wysokość 6 mm. Możliwe różne konfiguracje (rozstaw, średnica, pierścień).
Stół do mikroskopu wideo	Systemy wielokanałowe, Niemcy	MEA-VMT-1	Stół z mikroskopem wideo pod spodem do obrazowania pola elektrod MEA we wzmacniaczu umieszczonym na stole i przesyłania obrazu do komputera.
Kaniula perfuzyjna	Systemy wielokanałowe, Niemcy	PH01	Podgrzewana kaniula perfuzyjna z czujnikiem temperatury; temperaturę można zaprogramować za pomocą kontrolera TC02
MC_Rack	Multichannel Systems, Niemcy		Oprogramowanie do akwizycji i rejestracji
danych Magnetyczny uchwyt perfuzyjny	Systemy wielokanałowe, Niemcy	MPH	Magnetyczny uchwyt perfuzyjny na element PH01 do mocowania kaniuli perfuzyjnej i połączenia systemu perfuzyjnego z masą wzmacniacza
Oprogramowanie Neuroexplorer	Nex Technologies		do analizy danych; info@neuroexplorer.com
Pompa perystaltyczna (jednostka napędowa)	Gilson	F155001	0,01 do 48 rp
Pompa perystaltyczna (głowica pompy)	Gilson	F117800	R2 dwukanałowa
Aspirator ultradźwiękowy	Integra Life sciences, USA	Cusa Excel +	Umożliwia subpialne rozwarstwienie kory
Neuronawigacja	Isis Solutions, Francja	Surgiscope	Umożliwia identyfikację struktury mózgu w czasie rzeczywistym na przedoperacyjnym MRI
Vibratome HM 650 V	Microm		Block krojenie na 400 μ m grubych plastrów