Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
PA od dawna używane jako platforma do badania sił trakcyjnych komórek ze względu na łatwość produkcji i możliwość dostrojenia ich elastycznych właściwości. Gdy podłoże jest pokryte białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, komórki przylegają do żelu i wywierają siły, powodując deformację żelu. Deformacja zależy od przyczepności komórek i właściwości elastycznych żelu. Jeśli pole odkształcenia powierzchni jest znane, przyczepność powierzchniową można obliczyć za pomocą teorii sprężystości. Deformacja żelu jest zwykle mierzona poprzez równomierne osadzanie koralików znaczników fluorescencyjnych w żelu. Sondy przemieszczają się, gdy żel się odkształca. Sondy w pobliżu powierzchni żelu są śledzone. Przemieszczenia zgłaszane przez te sondy są uważane za przemieszczenia powierzchniowe. Ich głębokości od powierzchni są ignorowane. Założenie to wprowadza błąd w obliczeniach siły pociągowej. Aby uzyskać precyzyjny pomiar sił komórek, kluczowe znaczenie ma poznanie lokalizacji kulek. Opracowaliśmy technikę, która wykorzystuje prostą chemię do zamykania fluorescencyjnych kulek znacznikowych o średnicy 0,1 i 1 μm w żelach PA w odległości do 1,6 μm od powierzchni. Szkiełko nakrywkowe pokrywamy poli-D-lizyną (PDL) i koralikami fluorescencyjnymi. Roztwór żelu PA jest następnie umieszczany między szkiełkiem nakrywkowym a przylegającą powierzchnią. Kulki fluorescencyjne przenoszą się do roztworu żelu podczas utwardzania. Po polimeryzacji żel PA zawiera kulki fluorescencyjne na płaszczyźnie blisko powierzchni żelu.
Wprowadzenie
Mechaniczne oddziaływanie żywej komórki z jej lokalnym środowiskiem było powszechnie badane przy użyciu żeli PA. Substraty te opierają się na prostym, dobrze scharakteryzowanym protokole ustanowionym przez Dembo i Wanga w 1997roku1. Jedną z głównych zalet tych substratów jest to, że ich sztywność można dostroić poprzez modyfikację stężeń poszczególnych składników roztworu żelu. Stanowi to pożądaną platformę do badania interakcji komórek ze środowiskami o różnej sztywności. Kiedy żele PA są pokryte białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), komórki przylegają do nich, generując siłę. W wyniku działania siły komórkowej żel odkształca się jako ciało elastyczne. Odkształcenie to zależy od wielkości siły wywieranej przez komórki i właściwości sprężystych żelu. W różnych badaniach wykorzystano żele PA do zbadania sił trakcji komórkowej.
W jednej z odmian produkcji żelu PA, fluorescencyjne mikrosfery (kulki) są osadzone w całym żelu, aby określić ilościowo siły pociągowe komórek na żelach o różnej sztywności2. Po przyłożeniu siły ogniwa kulki przemieszczają się ze swojego początkowego położenia po odkształceniu żelu. Pole odkształcenia jest mierzone na podstawie pojedynczych przemieszczeń ściegu. To pole odkształceń jest wykorzystywane z teorią sprężystości i właściwościami sprężystymi żelu do obliczania sił trakcyjnych. Pomiary te dostarczają informacji na temat tego, w jaki sposób komórki mechanicznie wyczuwają i oddziałują ze swoim lokalnym mikrośrodowiskiem3.
W wielu powszechnie stosowanych protokołach wytwarzania żelu PA, kulki są mieszane z żelem PA w jego płynnym, niespolimeryzowanym stanie. W pełni spolimeryzowany żel PA zawiera kulki fluorescencyjne w całej swojej objętości. Podczas obliczania sił trakcyjnych komórki monitorowane są kulki znajdujące się najbliżej powierzchni żelu (granica faza komórka-podłoże). Zakłada się, że przemieszczenia tych kulek występują na powierzchni hodowli komórkowej w celu uproszczenia obliczeń siły. Rzeczywiste położenie kulek w głębokości żelu jest ignorowane. Jednak w elastycznym ośrodku (takim jak żel PA) koralik bliżej punktu przyłożenia siły przesunie się bardziej niż koralik, który jest dalej od punktu. Tak więc traktowanie przemieszczenia punktu (w miejscu zgrubienia) dystalnie od powierzchni jako tego na powierzchni powoduje niedoszacowanie trakcji komórkowych. Stopień błędu zależy od odległości ściegu od powierzchni. Błędu nie można oszacować bez wiedzy o położeniu ściegu.
Potrzeba prostej metody zamykania koralików bardzo blisko powierzchni hodowli komórkowej została zaspokojona za pomocą kilku technik. Jednym ze sposobów jest zwiększenie gęstości kulek w całym żelu, tak aby w górnej płaszczyźnie ogniskowej znajdowała się wystarczająca liczba kulek, aby mierzyć ruch bardzo blisko powierzchni. Inna technika polega na zbudowaniu konfokalnej komory obrazowania do obrazowania żywych komórek w taki sposób, że zbierane jest światło tylko z koralików w najwyższej płaszczyźnie ogniskowej4. Inna metoda polega na nałożeniu niezwykle cienkiej warstwy żelu PA zawierającego kulki na już spolimeryzowany żel bez kulek5. Wadą każdej z tych technik jest to, że dokładna lokalizacja kulek w żelu nie jest znana. Wprowadza to błąd w obliczeniach pola przemieszczenia ściegów, a tym samym w obliczeniach sił ogniw. Inna technika polega na sprzężeniu kulek z górną powierzchnią już spolimeryzowanego żelu PA za pomocą Sulfo-SANPAH6. Ta technika zapewnia, że kulki znajdują się rzeczywiście tylko na wierzchu żelu PA, ale stopień, w jakim są one osadzone w głębokości żelu, jest nieznany. Może to potencjalnie stworzyć lokalną topografię komórek, która może zmienić zachowanie komórek, ponieważ wcześniejsze prace sugerowały, że komórki mogą wyczuć wypychanie kilku mikronów odsiebie. Niedawno opracowano technikę modelowania żeli PA za pomocą fluorescencyjnych markerów punktowych fibronektyny o średnicy 1 μm w regularnym układzie8. W tym przypadku głębokość markerów fluorescencyjnych jest znana i wynosi zasadniczo zero, ponieważ wzór fibronektyny jest pośrednio drukowany na powierzchni żelu. Jednak ta metoda nie zapewnia ciągłego środowiska, do którego komórki mogą się przyłączać, ponieważ białko ECM jest ograniczone do kropek o średnicy 1 μm. Metoda pełnej integracji kulek śledzących w żelach PA i ograniczenia ich do znanego miejsca bardzo blisko powierzchni nie została jeszcze ustalona.
Tutaj rozwijamy technikę ograniczania fluorescencyjnych kulek o średnicy od sub-μm do μm do płaszczyzny ogniskowej bardzo blisko powierzchni hodowli komórkowej w żelu PA. Żel jest zwykle utwardzany przez umieszczenie niespolimeryzowanego płynnego roztworu żelu między dwiema szklanymi płytkami. Jedna z płytek jest funkcjonalizowana tak, aby żel mocno do niej przylegał. Drugi jest niefunkcjonalny i jest usuwany po utwardzeniu żelu. Modyfikujemy tę zdejmowaną szklaną powierzchnię, pokrywając ją warstwą koralików. Po umieszczeniu płynnego żelu między funkcjonalizowaną a pokrytą perełkami szklaną powierzchnię, kulki przenoszą się do żelu podczas jego utwardzania. Ogranicza to odległość integracji kulek z żelem w odległości 1,6 μm od powierzchni. Szalki Petriego ze szklanym dnem są używane jako przylegająca powierzchnia, na której utwardza się żel. Aby utworzyć płaską górną powierzchnię żelu podczas polimeryzacji, do umieszczenia żelu na płytce Petriego ze szklanym dnem stosuje się okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe. Przed wyprodukowaniem żelu szkiełko nakrywkowe górnej szkła jest powlekane poli-D-lizyną (PDL), co daje dodatni ładunek powierzchniowy. PDL jest przedmuchiwany sprężonym powietrzem, a na szkiełkach nakrywkowych osadza się roztwór kulek w wodzie. Wykorzystujemy karboksylowane mikrokulki fluorescencyjne, które przenoszą ładunek ujemny i oddziałują z dodatnio naładowaną powierzchnią powstałą w wyniku leczenia PDL. Po zdmuchnięciu roztworu ściegu z szkiełka nakrywkowego sprężonym powietrzem, pojedyncza warstwa ściegów pozostaje elektrostatycznie sprzężona z suchym szkiełkiem nakrywkowym. Powłoka PDL nie wpływa na przyczepność szkła do powierzchni żelu, ponieważ szkiełka są nieuszkodzone i usunięte z żelu PA w pełni nienaruszone.
Płytki Petriego ze szklanym dnem są doprowadzane do przylegania poprzez obróbkę 97% 3-aminopropylo-trimetoksyslianu i 0,5% aldehydu glutarowego. Żele PA o pożądanej sztywności powstają poprzez zmieszanie odpowiednich stężeń bisakrylamidu i akrylamidu w standardowej procedurze9. Kroplę roztworu żelu pipetuje się na szalkę Petriego ze szklanym dnem. Szklane szkiełko nakrywkowe zawierające kulki służy do przekładania żelu z szalką Petriego. Po utwardzeniu żelu górne szkiełko nakrywkowe jest usuwane, pozostawiając kulki zatopione w żelu PA w odległości 1,6 μm od powierzchni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wytwarzanie i funkcjonalizacja żeli PA o różnej sztywności z fluorescencyjnymi mikrosferami osadzonymi w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej.
1. Funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych na górną szybę
- Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe (#1.0, średnica 12 mm) wodą z mydłem, a następnie etanolem, aby usunąć zbędny kurz.
- Umieść szkiełka nakrywkowe na rusztowanej powierzchni (np. uchwycie końcówki do pipet) w taki sposób, aby się nie stykały, aby ułatwić interakcję z szkiełkami nakrywkowymi.
- Pokryj całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych poli-D-lizyną (0,1 mg/ml) przez 1 godzinę (Rysunek 1A).
- W tym czasie należy wykonać rozcieńczenie 1:10 000 roztworu koloidu o średnicy 0,1 μm, czerwonych fluorescencyjnych mikrosfer z wodą dejonizowaną (DI), aby uzyskać gęstość cząstek około 1 mikrosfery na 20μm2 na powierzchni żelu. Na rysunku 2 przedstawiono wyniki różnych rozcieńczeń. Rozcieńczenie to może być modyfikowane w celu zaspokojenia potrzeb określonych eksperymentów.
- Umieść rozcieńczony roztwór w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 30 minut.
- Po 1 godzinie za pomocą pęsety ostrożnie podnieś każdą szkiełko nakrywkowe i wysusz suszarką na powietrzu. Umieść suche szkiełka nakrywkowe z powrotem na startej powierzchni.
- Usunąć rozcieńczony roztwór koloidu z łaźni ultradźwiękowej i odpipetować 150 μl na każde szkiełko nakrywkowe. Pozostaw na 10 minut (Rysunek 1B).
- Użyj pęsety, aby ostrożnie podnieść każdą szkiełko nakrywkowe i wysuszyć suszarką powietrzem. Umieść suche szkiełka nakrywkowe na startej powierzchni i przechowuj w ciemności, aż będą gotowe do użycia.
2. Przygotowanie żelu PA bezpośrednio na szklanych płytkach Petriego
- Rozgrzej płytę grzejną do 100 °C.
- Rozłóż żądaną liczbę szalek Petriego ze szklanym dnem (szalka 35 mm z mikrostudzienką 14 mm, #1.0) na płaskiej powierzchni w dygestoriach chemicznych.
- Przykryj szklaną część każdej mikrostudzienki na płytce Petriego 97% 3-aminopropylotrimetoksyslianem (3-APTES) na 7 minut w celu aktywacji chemicznej. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć przypadkowego kapania 3-APTES na powierzchnię tworzywa sztucznego na szalce Petriego, aby uniknąć degradacji polistyrenu.
- Po 7 minutach napełnij szalkę Petriego wodą DI i wyrzuć do pojemnika na odpady.
- Powtórz krok 2.4 3x dla każdej potrawy, a następnie potrząśnij szalką Petriego, aby usunąć nadmiar wody. Umieść szalki Petriego na płycie grzejnej, aż szklana część wyschnie.
- Wyjmij szalki Petriego z płyty grzejnej i wróć na płaską powierzchnię do dygestoria chemicznego.
- W dygestorium chemicznym przygotować roztwór 0,5% aldehydu glutarowego i dobrze przykryć szklaną porcję każdej szalki Petriego roztworem na 30 minut. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć przypadkowego kapania aldehydu glutarowego na powierzchnię plastiku na szalce Petriego, aby uniknąć degradacji plastiku.
- Po 30 minutach napełnij szalkę Petriego wodą demineralizowaną i wyrzuć do pojemnika na odpady w celu wypłukania i usunięcia aldehydu glutarowego.
- Powtórz krok 2.4 3x dla każdej potrawy, a następnie potrząśnij szalką Petriego, aby usunąć nadmiar wody. Umieść szalki Petriego na płycie grzejnej, aż szklana część wyschnie.
- Przed zmieszaniem składników roztworu żelu PA należy przesunąć funkcjonalizowane szkiełka szkiełkowe do okapu oparów chemicznych w taki sposób, aby były łatwo dostępne, co pozwoliłoby na szybkie ułożenie żelu na płytkach Petriego ze szklanym dnem po wymieszaniu roztworu żelu.
- W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml należy wymieszać 40% bisakryloamidu, 2% akrylamidu i kwasu akrylowego w bezpośrednich odstępach w stężeniach wymienionych w tabeli 1 (dostosowanym do opublikowanego protokołu10), aby uzyskać pożądaną elastyczność matrycy.
- Dodać 100 mM HEPES, 10% nadsiarczanu amonu i TEMED w ilościach podanych w tabeli 1 odpowiadających pożądanej elastyczności matrycy, aby uzupełnić roztwór żelu.
- Natychmiast odpipetować 15 μl roztworu żelu na środek szklanej części szalek Petriego.
- Natychmiast podnieś funkcjonalną szklaną szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety.
- Odwróć szkiełko pokrywy tak, aby kulki fluorescencyjne znajdowały się z boku stykającego się z roztworem żelu.
- Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynnego żelu PA tak, aby funkcjonalizowana strona stykała się z żelem (Rysunek 1C). Uwaga: W celu uzyskania najlepszych rezultatów zaleca się, aby druga osoba pełniła rolę dodawania szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć możliwości częściowej polimeryzacji podczas pipetowania płynnego roztworu żelu PA na wiele szalek Petriego.
- Odwróć wszystkie szalki Petriego, aby uniknąć wpływu grawitacji na nanocząstki fluorescencyjne polimeryzujące do niższych poziomów żelu PA.
- Odczekać co najmniej 35 minut lub do momentu, gdy roztwór podstawowy żelu PA wyraźnie spolimeryzuje w probówce wirówkowej.
- Odwróć szalki Petriego z powrotem i napełnij je PBS, aby pomóc w usunięciu szkiełka nakrywkowego.
- Ostrożnie zetknąć się ze szklaną częścią szalki Petriego i konturem szkiełka nakrywkowego, zeskrobując pęsetą obwód szkiełka nakrywkowego. Wykonaj kilka cykli, aż szkiełko nakrywkowe zostanie usunięte. Usuń szkiełko nakrywkowe i wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na ostre odpady.
- Po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych, kulki fluorescencyjne zostaną przeniesione do żelu (rysunek 1D). Całkowicie przykryj żele PA PBS, umieść pokrywkę szalki Petriego na każdej szalce i przechowuj w temperaturze 4 °C.
3. Funkcjonalizujący żel PA z fibronektyną
- Przygotować następujące wstępnie zmieszane roztwory zgodnie z opisem w ustalonym protokole11: roztwór do namaczania (137 mM NaCl, 5% (v/v) glicerolu) i 2x bufor koniugacyjny (0,2 M kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES), 10% (v/v) glicerol, pH 4,5).
- Użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć cały PBS z naczyń ze szklanym dnem zawierających żele PA.
- Nasącz roztwór pipetą na każdy żel tak, aby żel był całkowicie zanurzony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
- Podgrzać chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) i N-hydroksysulfosukcynimid (NHS) do temperatury pokojowej.
- Wymieszaj 10x roztwory EDC (150 mM, 19 mg/ml w wodzie DI) i NHS (250 mM, 29 mg/ml w wodzie DI).
- Wymieszaj 1 część 10x EDC, 1 część 10x NHS, 3 części wody DI i 5 części 2x bufor koniugacyjny.
- Użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć roztwór do namaczania. Upewnij się, że cały płyn został usunięty z powierzchni żelu.
- Dodać tyle roztworu NHS/EDC, aby pokryć powierzchnię żelu i napełnić szklane dno szalki Petriego (150–250 μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
- Rozmrozić fibronektynę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu wymieszaj sterylną wodę DI, aby uzyskać roztwór fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml.
- Użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć roztwór NHS/EDC. Upewnij się, że cały płyn został usunięty z powierzchni żelu.
- Do każdego żelu dodać 150 μl roztworu fibronektyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 35 minut, aby umożliwić przyłączenie fibronektyny.
- Po 35 minutach dodać PBS do każdej szalki Petriego i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
4. Eksperymenty z siłą trakcyjną
- Podgrzej pożywkę komórkową, PBS i trypsynę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Spłucz żele 5x sterylnym PBS, odsysając PBS między płukaniami i pozostaw pod przykryciem w kapturze.
- Dodać 1 ml trypsyny na 25cm2 do kolby zawierającej komórki. Po wyjęciu komórek z kolby rozcieńczyć trypsynę pożywką komórkową i policzyć komórki. Na podstawie powierzchni żelu określ liczbę komórek wymaganych na żel, aby uzyskać końcową gęstość wysiewu komórek wynoszącą 3,000 komórek/cm2. Rozcieńczyć lub zagęścić zawiesinę w taki sposób, aby 150 μl mieszaniny komórka-pożywka zawierało taką liczbę komórek. Podwielokrotność 150 μl zawiesiny komórkowej na każdy żel.
- Umieścić szalki Petriego zawierające komórki w inkubatorze na 30 minut. Następnie ostrożnie wyjmij szalki Petriego i napełnij pozostałą część szalki Petriego pożywką (około 2 ml) tak, aby powierzchnia szalki była całkowicie zanurzona.
- Umieść szalki Petriego z powrotem w inkubatorze do czasu uzyskania obrazu.
- Przygotuj mikroskop i system akwizycji danych do obrazowania: włóż obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie, włóż pryzmat kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC), wybierz mCherry lub równoważny filtr fluorescencyjny i włącz komorę środowiskową.
- Po przygotowaniu do obrazowania wyjmij jedną szalkę Petriego z inkubatora i delikatnie umieść ją na stoliku mikroskopu. Zdejmij pokrywę szalki Petriego w celu obrazowania DIC.
- Zlokalizuj pojedynczą komórkę i przechwyć pojedynczy nieruchomy obraz komórki w formacie DIC.
- Nie przesuwając stolika mikroskopu, przełącz tryb obrazowania na fluorescencję. Skoncentruj się na mikrosferach fluorescencyjnych i zapisz obraz mikrosfer .
- Ostrożnie usunąć pożywkę komórkową z szalki Petriego za pomocą pipety i dodać 0,05% trypsyny-EDTA.
- Wyobraź sobie mikrosfery pod komórką po odłączeniu komórek.
- Użyj analizy prędkości obrazu cząstek (PIV) w ImageJ12, aby obliczyć pole przemieszczenia spowodowane siłami komórkowymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazowanie konfokalne wykorzystano do potwierdzenia, że koraliki znajdowały się rzeczywiście pod powierzchnią żelu oraz do ilościowego określenia ich dokładnej lokalizacji w głąb żelu. Pozwolono, aby koraliki fluorescencyjne o innej długości fali niż te wewnątrz żelu osadziły się na jego powierzchni, a następnie obliczono odległość między zatopionymi nanocząsteczkami fluorescencyjnymi a koralikami na powierzchni za pomocą algorytmu identyfikacji centroidu. Położenie koralika na powierzchni żelu służy jako punkt odniesie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas stosowania tej techniki niezbędne jest prawidłowe rozcieńczenie roztworu kulek oraz wybór kulek w oparciu o pożądany średnicę, sztywność podłoża z żelu PA oraz skalę wielkości zjawisk badanych w planowanym eksperymencie.
Należy zachować ostrożność podczas rozcieńczania roztworu kulek przed funkcjonalizacją górnych szkiełek nakrywkowych. Odległość między kulkami na powierzchni żelu można zmieniać poprzez modyfikację stopnia rozcieńczenia roztworu koloidalnego. Zbyt duże rozcieńczenie ro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Programowi Interdyscyplinarnej Inicjatywy Innowacyjnej, University of Illinois, grant 12035. S.K. został sfinansowany na UIUC z grantu National Science Foundation (NSF) 0965918 IGERT: Szkolenie następnego pokolenia badaczy w zakresie mechaniki komórkowej i molekularnej oraz bionanotechnologii. Praca ta była częściowo wspierana przez grant z węzła nanoBIO Narodowej Fundacji Nauki (ECC-1227034).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczynniki | |||
| 97% 3-aminopropylo-trimetoksysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% aldehydu glutarowego | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M roztwór buforowy HEPES | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Akrylamid | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisakryloamid | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0,1 i mikro; m Mikrosfery fluorescencyjne (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronektyna, Człowiek, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Nadsiarczan amonu | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Milipor poli-D-lizyny | A-003-E | ||
| Chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroksysulfosukcynimid (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0,05% Trypsyna-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Kwas akrylowy | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materiały | |||
| 35 mm Szklane naczynie dolne ze szkłem nakrywkowym 14 mm Micro-Well #1 | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Szkiełka nakrywkowe szklane, średnica 12 mm. | Ted Pella, Inc. | Numer katalogowy 26023 |
Bibliografia
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , Chapter 10, Unit 1 16(2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929(2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
