Konkurencja w Streptococcus pneumoniae jest wywoływana przez bakteriocyny, małe peptydy przeciwdrobnoustrojowe o działaniu hamującym w stosunku do pneumokoków i innych pokrewnych gatunków. Tutaj opisujemy zoptymalizowany test nakładki bakteryjnej, który pozwala na scharakteryzowanie aktywności bakteriocyny i spektrum hamowania, odporności specyficznej dla bakteriocyny oraz wykrywania wydzielanych peptydów quorum sensing.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Streptococcus pneumoniae kolonizuje wysoce zróżnicowaną społeczność wielomikrobiologiczną nosogardzieli, gdzie musi konkurować z organizmami rezydentami. Wykazaliśmy, że wytwarzane bakteryjnie peptydy przeciwdrobnoustrojowe (bakteriocyny) dyktują wynik tych konkurencyjnych interakcji. Wszystkie w pełni zsekwencjonowane szczepy pneumokokowe są nosicielami locus a backerocin-l ike peptide (blp). Locus blp koduje szereg różnych bakteriocyn i wszystkie wysoce konserwatywne składniki potrzebne do ich regulacji, przetwarzania i wydzielania. Różnorodność bakteriocyn znajdujących się w regionie odporności bakteriocynowej (BIR) locus jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do konkurencji pneumokokowej. Wraz z bakteriocynami w BIR znajdują się geny odporności, które są potrzebne do ochrony komórki produkcyjnej przed skutkami działania własnej bakteriocyny. Test nakładkowy jest szybką metodą badania dużej liczby szczepów pod kątem interakcji konkurencyjnych, w których pośredniczą bakteriocyny. Test nakładkowy pozwala również na scharakteryzowanie odporności specyficznej dla bakteriocyny oraz wykrycie wydzielanych peptydów wyczuwających kworum. Test przeprowadza się poprzez wstępne zaszczepienie płytki agarowej szczepem, który ma być badany pod kątem produkcji bakteriocyny, a następnie nałożenie miękkiej nakładki agarowej zawierającej szczep, który ma być badany pod kątem wrażliwości na bakteriocynę. Strefa prześwitu otaczająca ukłucie wskazuje, że szczep nakładki jest wrażliwy na bakteriocyny wytwarzane przez wstępnie zaszczepiony szczep. Jeśli nie obserwuje się żadnej strefy klirensu, oznacza to, że albo szczep nakładkowy jest odporny na wytwarzanie bakteriocyn, albo szczep wstępnie zaszczepiony nie wytwarza bakteriocyn. Aby określić, czy locus blp jest funkcjonalny w danym szczepie, test nakładkowy można dostosować do oceny wydzielania feromonów peptydowych przez wstępnie zaszczepiony szczep. W tym przypadku w nakładce zastosowano serię czterech szczepów lacZ-reporter o różnej specyficzności feromonowej.
Wprowadzenie
Streptococcus pneumoniae, powszechny kolonizator wielomikrobiologicznej społeczności nosogardzieli, jest w stanie konkurować z innymi pneumokokami i blisko spokrewnionymi gatunkami poprzez produkcję wytwarzanych bakteryjnie peptydów przeciwdrobnoustrojowych (bakteriocyny). Każdy w pełni zsekwencjonowany szczep pneumokoków przebadany do tej pory zawiera wersję locus eptydu bacyrocyny-l ike p, BLP. Wykazano, że wytwarzanie bakteriocyn przez pneumokoki ma istotny wpływ na wyniki zarówno konkurencji in vitro, jak i in vivo 1-4. Na dynamikę konkurencji wpływa ekspresja różnych bakteriocyn wraz z pokrewnymi białkami odpornościowymi w odpowiedzi na określony feromon peptydowy. Indukcja locus blp jest kontrolowana przez system quorum sensing, w którym feromon peptydowy, BlpC, wiąże się z kinazą czujnikową, BlpH, i inicjuje kaskadę sygnalizacyjną, w wyniku której następuje transkrypcja locusblp 5,6. Istnieją cztery warianty alleliczne BlpC, z których każda wiąże się z pokrewnym BlpH6. Aby komórka mogła przetrwać działanie własnej bakteriocyny, geny kodujące pokrewne białka odpornościowe są transkrybowane na tym samym operonie, co każdy z genów bakteriocyny. Zabijanie ma miejsce, jeśli konkurencyjny szczep nie jest w stanie zwiększyć locus blp w odpowiedzi na egzogenny feromon lub jeśli szczep nie ma specyficznego genu odporności wymaganego do ochrony. Kompleks transportowy, BlpAB, jest niezbędny do wydzielania i przetwarzania feromonu peptydowego i peptydów bakteriocyny2,4. Ostatnio wykazano, że znaczna część szczepów pneumokoków to "oszuści", co oznacza, że mają konserwatywną mutację w genie blpA, która uniemożliwia im wydzielanie feromonów i bakteriocyn1,2. Szczepy te są w stanie reagować na egzogenny BlpC2 wydzielany przez sąsiednie szczepy, co pozwala na produkcję białek odpornościowych.
Chociaż prymitywne preparaty bakteriocyn z supernatantów mogą być przygotowywane ze szczepów producentów przy użyciu metod biochemicznych prowadzących do osiągnięcia czystości, to podejście to nie jest przydatne do badania dużych kolekcji izolatów i jeśli poziom ekspresji bakteriocyny jest niski w kulturach uprawianych w bulionie2,7-9. Test nakładkowy jest stosowany jako szybki sposób badania dynamiki konkurencji między szczepami, które mogą istnieć in vitro. W tym celu szczep pneumokoków jest wstępnie zaszczepiany na płytce agarowej i pozostawiany do wzrostu w celu osiągnięcia lokalnych stężeń bakterii wystarczających do indukcji locus blp. Drugi szczep jest następnie zaszczepiany w stopionym miękkim roztworze agaru, który jest następnie nakładany na wstępnie zaszczepiony szczep w celu zbadania wrażliwości. Aby ocenić aktywność locus blp (niezależną od aktywności hamującej), szczepy można nałożyć na serię trzech wcześniej opisanych szczepów reporterowych BlpC. Szczepy te zostały skonstruowane tak, aby zawierały jeden z trzech różnych alleli blPH, które reagują na trzy najczęstsze feromony BlpC wydzielane przez pneumokoki. Szczepy reporterowe mają zintegrowany gen lacZ, który jest pod kontrolą promotora zależnego od BlpH i przenoszą delecję w genie blpC, która zapobiega samostymulacji10,11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie szczepu producenta
- Smuga szczepu pneumokoków do przetestowania pod kątem produkcji bakteriocyny na 5% tryptycznym agarze sojowym z krwi owczej z zapasów zamrażarki -80 °C.
UWAGA: Użycie płytek krwi do początkowego wzrostu szczepu, który ma być badany pod kątem inhibicji, znacznie zwiększa odtwarzalność testu. Ponadto można stosować inne szczepy niepneumokokowe wytwarzające bakteriocyny, chociaż może być konieczne zmodyfikowanie warunków wzrostu dla konkretnego organizmu. Z powodzeniem zastosowaliśmy Streptococcus mitis i Lactococcus lactis w teście nakładkowym. - Inkubować płytkę przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Po inkubacji szczepu produkcyjnego przygotować płytkę z tryptycznym agarem sojowym (TSA), pipetując od 3 000 do 4 000 jednostek katalazy na płytki zawierające 25 ml TSA i rozprowadzić roztwór katalazy za pomocą sterylnych szklanych kulek. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na około 10 minut pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.
- Zbierz widoczną ilość bakterii na końcówkę pipety. Wbić końcówkę pipety w wysuszoną płytkę TSA.
UWAGA: Więcej niż jeden szczep producenta może zostać wbity w pojedynczą płytkę TSA. Ważne jest, aby rozmieścić dźgnięcia tak, aby powstałe aureole nie nakładały się na siebie.- Jeśli to możliwe, należy uwzględnić znanego producenta bakteriocyny jako kontrolę dodatnią, a szczep, który ma być użyty w nakładce, jako kontrolę ujemną.
UWAGA: Kontrole dodatnie i ujemne zostały wcześniej opublikowane i są dostępne na żądanie10.
- Jeśli to możliwe, należy uwzględnić znanego producenta bakteriocyny jako kontrolę dodatnią, a szczep, który ma być użyty w nakładce, jako kontrolę ujemną.
- Inkubować płytkę TSA zawierającą wielokrotne ukłucia w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin.
2. Wytwarzanie zapasów glicerolu ze szczepu nakładkowego
- Przygotować zapasy glicerolu (kultury wyhodowane do połowy fazy wykładniczej, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C po dodaniu glicerolu) przed dniem przeprowadzenia testu nakładkowego. Zaszczepić 5-10 kolonii szczepu pneumokoków w celu zbadania wrażliwości lub wydzielania feromonów w pożywce Todda-Hewitta 0,5% ekstraktem drożdżowym (THY).
UWAGA: Budowa reporterów indukowanych BlpC została wcześniej opisana2, a szczepy są dostępne na życzenie. - Inkubować 5-10 kolonii w szklanych probówkach z 5 ml THY ze szczelnie zamkniętymi pokrywkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
- Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, aż osiągną OD620 wynoszący od 0,3 do 0,5,
UWAGA: Zajmie to około 4-5 godzin, w zależności od użytego szczepu.- Delikatnie odwróć rurkę kilka razy przed pomiarem średnicy zewnętrznej.
- Jeśli eksperyment nie może zostać przeprowadzony tego samego dnia lub szczep będzie używany wielokrotnie w przyszłości, należy przygotować zapasy glicerolu i wznowić eksperyment w późniejszym terminie. W przypadku zapasów glicerolu dodaj glicerol do kultur do końcowego stężenia 20%. Porcje kultur rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. UWAGA: Próbki można przechowywać przez miesiące w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wytwarzasz zapasów glicerolu, użyj próbek bezpośrednio do testu nakładkowego.
3. Test nakładki
- Tuż przed nałożeniem nakładki należy wymieszać składniki nakładki. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 5 ml THY, 3 000-4 000 U katalazy i 200 μl kultury bulionowej szczepu nałożonego na nakładkę, która była uprawiana tego dnia lub glicerolu z kultury, która została rozmrożona w temperaturze pokojowej. W przypadku stosowania szczepu reporterowego dodać 50 μl X-gal (40 mg/ml) do mieszaniny nakładki. Użyj jednej stożkowej rurki na płytkę.
- Zrównoważyć mieszaninę nakładki w temperaturze pokojowej przed dodaniem stopionego TSA.
- Wyjmij płytkę TSA z dźgniętym szczepem z inkubatora. Rozpuść stały TSA w kuchence mikrofalowej i trzymaj w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C, aż będzie gotowy do użycia. Dodać 3 ml stopionego TSA z 1,5% agarem schłodzonym do 55 °C do nałożonej mieszaniny.
- Przygotuj nałożoną mieszaninę bezpośrednio przed pipetowaniem, mieszanina zacznie bardzo szybko krzepnąć. UWAGA: Jeśli nakładka zacznie krzepnąć przed poszyciem, wyniki będą nieinterpretowalne.
- Wymieszać nałożoną mieszaninę, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków do mieszaniny. Powoli nakładać mieszaninę pipetą bezpośrednio na wbitą płytkę TSA. Trzymaj talerz na blacie przez kilka minut, pozwalając agarowi stwardnieć.
- Nie obracaj płytki w celu rozprowadzenia mieszanki nakładki, spowoduje to wciągnięcie wzrostu z dźgniętej kultury do nakładki.
- Ostrożnie umieścić płytkę TSA z nakładką w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 O/N (około 16-18 godzin).
- Obserwuj płytki po nocnym wzroście. Płytki powinny wydawać się nieprzezroczyste w wyniku wzrostu szczepu nakładki, z wyjątkiem obszarów, w których wystąpiło hamowanie lub sygnalizacja feromonów. Pojawią się one odpowiednio jako czyste lub niebieskie strefy wokół ugodzonego szczepu.
UWAGA: Chociaż pomiary średnicy niebieskiego lub prześwitu można określić w celu oceny ilościowej, różnice w średnicy mogą się również różnić w zależności od ilości bakterii, które zostały wbite w płytkę. Test nakładkowy jest testem jakościowym, każda ocena ilościowa powinna być interpretowana z ostrożnością. Każde widoczne oczyszczenie w porównaniu z kontrolą ujemną uznaje się za aktywność.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W teście nakładkowym (overlay assay) możliwe są dwa wyniki. Po inkubacji przez noc powinien być widoczny wzrost szczepu wprowadzonego metodą nakłuwania. Na Rysunku 1A szczep nakładkowy jest wrażliwy na produkowane bakteriocyny. Wokół szczepu nakłutego można zaobserwować strefę zahamowania wzrostu. Dodatkowo możliwe jest rozprzestrzenienie się szczepu nakłutego w mieszaninie nakładkowej, co widoczne jest na Rysunku 1A. Na Rysunku 1B szczep nakładkowy jest odporny na wydzi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten test nakładkowy jest szybkim sposobem określenia zakresu aktywności producentów bakteriocyny i wykazania interakcji konkurencyjnych, które mogą wystąpić między szczepami pneumokoków. Test nakładkowy można dostosować do stosowania do badań przesiewowych wielu szczepów pod kątem produkcji bakteriocyny na jednej płytce. Za pomocą tego testu z powodzeniem przeprowadziliśmy badania przesiewowe dużych zbiorów szczepów, używając 48-pinowego replikatora do inokulacji płytek SBA z jednej połowy płytki 96-dołkowej. Po całonocn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar sojowy tryptykazy z 5% krwią owczą | Fisher | B21261X | Do wzrostu z kultur zamrażarskich |
| Katalaza | Sigma | C100-500mg | 4,741 Ilość na talerz |
| Bulion Todd Hewitt + Ekstrakt drożdżowy (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g THB, 5 g ekstraktu drożdżowego, 1 l autoklawu ddH2O |
| Tryptyka Rosół sojowy + Płytki agarowe (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g TS, 15 g agaru, 1 l autoklawu ddH2O |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktopiranozyd (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Rozpuścić w dimetyloformamidzie |
| Płytki Petriego | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Mierzy OD620 kultur | ||
| 37 ° C łaźnia | |||
| 37 ° Inkubator C z | |||
| 15 ml |
Bibliografia
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751(2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
