Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Summary

Ten artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyki synaptycznej przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie sacharozy. Opisano również późniejsze przygotowanie białek o gęstości postsynaptycznej. Preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Abstract

Techniki frakcjonowania subkomórkowego neuronów pozwalają na ilościowe określenie białek, które są transportowane do i z synapsy. Jak pierwotnie opisano pod koniec lat sześćdziesiątych, białka związane z błoną plazmatyki synaptycznej można wyizolować przez ultrawirowanie na gradiencie gęstości sacharozy. Po wyizolowaniu błon synaptycznych kompleks makrocząsteczkowy znany jako gęstość postsynaptyczna może być następnie wyizolowany ze względu na jego nierozpuszczalność w detergentach. Techniki stosowane do izolowania błon plazmatycznych synaps i białek o gęstości postsynaptycznej pozostają zasadniczo takie same po 40 latach i są szeroko stosowane w obecnych badaniach neurobiologicznych. Ten artykuł szczegółowo opisuje frakcjonowanie białek związanych z błoną plazmatyczną synaptyczną i gęstością postsynaptyczną przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy. Otrzymane preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Introduction

Neurony komunikują się za pomocą synaps, a jakość tej komunikacji jest regulowana w dużym stopniu przez zmiany w składzie białek w synapsie. W szczególności białka znajdujące się w gęstości postsynaptycznej uczestniczą w komunikacji neuronalnej poprzez ścisłe rusztowanie receptorów neuroprzekaźników z ich systemami transdukcji sygnału¹. Co więcej, trwałe zmiany w sile skuteczności synaptycznej są kontrolowane przez dodawanie lub usuwanie receptorów o gęstości postsynaptycznej^1-6. Dlatego izolacja i kwantyfikacja białek synaptycznych jest niezbędną i użyteczną techniką w celu uzyskania wglądu w sposoby, w jakie neurony reagują na bodźce i zmieniają skuteczność synaptyczną⁷. W artykule opisano powszechną technikę izolowania białek synaptycznych z tkanki mózgowej gryzoni poprzez ultrawirowanie na nieciągłych gradientach sacharozy. Frakcja błony plazmatycznej synaps może być wzbogacona i wyizolowana na podstawie jej gęstości w sacharozy, która została empirycznie określona jako podobna do 1,2 M sacharozy.

W zależności od kwestii biologicznej, subkomórkowe frakcje mogą być oddzielone ciągłymi lub nieciągłymi gradientami sacharozy lub Percollu. Ciągłe gradienty pozwalają na rozdzielenie białek na wiele frakcji; Może to być szczególnie przydatne do wykazania kolokalizacji białek w danej frakcji⁸. Jednak przygotowanie ciągłych gradientów jest bardziej pracochłonne i nie jest konieczne w przypadku wielu zastosowań. Nieciągłe gradienty są stosunkowo łatwiejsze do przygotowania i mogą być używane do rozdzielania białek na kilka, ogólnie zdefiniowanych frakcji. Nieciągłe gradienty, które składają się z trzech warstw sacharozy o rosnącej molarności, są szeroko stosowane do izolowania białek związanych z synaptyczną błoną plazmatyczną (SPM). Ta frakcja błony plazmatycznej synaps może być dalej przetwarzana do frakcji gęstości postsynaptycznej (PSD) poprzez obróbkę detergentem i izolację frakcji nierozpuszczalnej w detergentach.

Gdy ten proces został po raz pierwszy opisany w latach 60-tych^9,10, użyto mikroskopii elektronowej, aby zademonstrować organelle i błony, które z grubsza definiują błonę plazmatyczną synaptyczną i postsynaptyczne frakcje^{gęstości 9-14}. Badania te wykazały włączenie błon pre- i postsynaptycznych oraz pęcherzyków synaptycznych do frakcji SPM; Po obróbce detergentem widoczne były przede wszystkim gęstości postsynaptyczne o dużej gęstości elektronowej. W procedurze wstrząs hipotoniczny służy do uszczypnięcia procesów synaptycznych z ciała komórki¹⁰. Ten krok wykorzystuje fakt, że mitochondria są bardziej odporne na szok osmotyczny i pozostają nienaruszone, a więc osadzają się na dnie gradientu sacharozy (ryc. 1).

Korzystając z tej samej techniki wzbogacania, frakcje SPM i PSD zostały najpierw zdefiniowane biochemicznie za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i sekwencjonowania głównych składników białka^15-17. Następnie analiza western blot została wykorzystana do wykrycia i ilościowego określenia poziomów białek synaptycznych oraz dalszego zdefiniowania tych frakcji (ryc. 2). Użyliśmy tej techniki w naszych laboratoriach do ilościowego określenia zmian w poziomach synaptycznych transportera dopaminy, które występują, gdy locus Slc6a3 jest zduplikowany u myszy¹⁸. Zastosowaliśmy również tę technikę u myszy z niedoborem receptora NMDA, aby odkryć specyficzne dla synaps redukcje białek, które są częścią interaktomu DISC1¹⁹.

Z analizy western blot jasno wynika, że frakcje SPM zawierają białka błony pęcherzyków synaptycznych, markery endosomów, białka mitochondrialne, syntetyczne enzymy związane z błoną i cząsteczki transdukcji sygnału, a także integralne składniki gęstości postsynaptycznej i błon plazmatycznych^{synaptycznych 20-23}. Nawet frakcje PSD mogą być zanieczyszczone licznymi białkami mitochondrialnymi i może być konieczne wykonanie drugiej sedymentacji gradientowej lub dodatkowych etapów oczyszczania w celu ich usunięcia¹³. Ostatnio ilościowa spektrometria mas dostarczyła listę ponad 100 białek w samej gęstości postsynaptycznej, a także wskazanie względnej obfitości tych składników^24,25.

Protocol

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami i został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Wydziału Medycyny i Farmacji Uniwersytetu w Toronto.

1. Przygotuj wymagane odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 1

1. Dodać inhibitory proteazy i fosfatazy (jeśli to konieczne) do wszystkich roztworów sacharozy, i ddH₂O w stężeniach podanych w tabeli 1. WAŻNE: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze 4 °C i wstępnie schłodź wszystkie odczynniki i sprzęt przed rozpoczęciem eksperymentu. Oznacz wszystkie probówki, w tym probówki ultrawirówkowe, markerem permanentnym.

2. Sekcja odpowiedniego obszaru mózgu

1. Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy lub ścięcie głowy. Trzymanie i eutanazja zwierząt zgodnie z polityką instytucjonalną i rządową dotyczącą opieki nad zwierzętami.
2. Szybko usuń mózg z czaszki i umieść go na schłodzonym bloku preparacyjnym
.
3. Wypreparuj odpowiedni obszar mózgu ze świeżej tkanki i przejdź do kroku 3.

3. Homogenizacja tkanek za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego napędzanego silnikiem

1. Umieścić 50-100 mg (dla SPM) lub 100-200 mg (dla PSD) wyciętej tkanki w znakowanej probówce polipropylenowej o pojemności 13 ml zawierającej 4 ml 0,32 M buforowanego roztworu sacharozy HEPES. Przenieść próbkę do stożkowego młynka/homogenizatora do bibułek szklano-teflonowych o pojemności 15 ml, ustawić napęd silnika na 900 obr./min (ustawienie 7) i homogenizować próbkę za pomocą 12 uderzeń w ciągu 30 sekund. Użyj innego homogenizatora szklano-teflonowego między próbkami lub przepłucz homogenizator zimną wodą destylowaną między próbkami i wytrzyj do sucha chusteczką Kimwipe. UWAGA: Do 4 g tkanki można homogenizować w 4 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES, jednak zaleca się użycie mniejszej ilości tkanki, aby zapewnić prawidłowe frakcjonowanie.
2. Przenieść homogenizowaną próbkę z powrotem do tej samej probówki polipropylenowej o pojemności 13 ml. Odłożyć 100 μl homogenatu i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszej kwantyfikacji białka i analizy Western blot całkowitej frakcji białkowej.

4. Wirowanie z niską prędkością w celu usunięcia frakcji jądrowej (daje supernatant S1)

1. Odwirować homogenat w rotorze o stałym kącie nachylenia przy 900 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (S1) do nowej, oznakowanej probówki o pojemności 13 ml i ponownie zawiesić osad frakcji jądrowej (P1) w 500 μl 0,32 M sacharozy buforowanej przez HEPES. UWAGA: Frakcja (P1) może być przechowywana w temperaturze -80 °C i używana do analizy western blot frakcji jądrowej.

5. Wzbogacenie surowej frakcji synaptosomalnej (daje osad P2)

1. Odwirować supernatant (S1) przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (S2) i zarezerwować 500 μl w probówce do mikrowirówki do przechowywania w temperaturze -80 °C w celu późniejszej kwantyfikacji białka i analizy western blot cytozolowej/lekkiej frakcji błonowej. Zawiesić pozostały granulat surowej frakcji synaptosomalnej (P2) w 1 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES, a następnie dodać kolejne 3 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES.
2. Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (S2') i zarezerwować 500 μl w probówce do mikrowirówki do przechowywania w temperaturze -80 °C w celu późniejszej kwantyfikacji białka i analizy western blot cytozolowej/lekkiej frakcji błonowej. Zachowaj przemyty surowy granulat synaptosomalny (P2') w probówce polipropylenowej.

6. Liza (wstrząs hipoosmotyczny) surowej frakcji synaptosomalnej

1. Poddać lizie surowy osad synaptosomalny (P2') w probówce polipropylenowej, zawieszając go ponownie w 1 ml ddH₂O. Dodać kolejne 3 ml ddH₂O, przenieść do homogenizatora tkanek szklano-teflonowych i homogenizować ręcznie za pomocą 3 pociągnięć. UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok tak szybko, jak to możliwe i szybko przejść do kroku 6.2.
2. Przenieść próbki z homogenizatora z powrotem do tej samej probówki polipropylenowej o pojemności 13 ml i szybko dostosować próbkę z powrotem do 4 mM HEPES z 16 μl 1 M roztworu HEPES, odwrócić w celu wymieszania.
3. Obracać próbki w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby zapewnić całkowitą lizę.

7. Wzbogacenie frakcji błony synaptosomalnej (P3)

1. Wirować przy 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć surowy supernatant frakcji pęcherzykowej (S3) i umieścić go w probówce o pojemności 5 ml do przechowywania w temperaturze -80 °C w celu późniejszej oceny ilościowej białka i analizy Western blot. Zawiesić frakcję błony synaptosomalnej (P3) w 1 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES.

8. Przygotowanie nieciągłego gradientu sacharozy

1. Odmierzyć dokładnie 3,5 ml 1,2 M roztworu sacharozy z buforem HEPES i dokładnie po 3,0 ml roztworu sacharozy o spulchnieniu 1,0 M i 0,8 M HEPES do oddzielnych probówek z zatrzaskiem o pojemności 6 ml. UWAGA: Ma to na celu wstępne zmierzenie objętości, które są używane do tworzenia gradientu sacharozy. Dokładny pomiar objętości jest ważny, aby zapewnić, że powstałe gradienty zostaną zrównoważone do ultrawirowania.
2. Za pomocą szklanej pipety i bańki Pasteura przenieść 1,2 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES do 12 ml probówki ultrawirówki z poliallomera. Ostrożnie nałożyć 1,0 M roztwór sacharozy buforowany przez HEPES na 1,2 M roztworu sacharozy buforowanej przez HEPES. Na koniec ułóż 0,8 M roztwór sacharozy buforowany przez HEPES na 1,0 M roztworze sacharozy buforowanym przez HEPES. Do każdego roztworu sacharozy należy używać świeżej pipety Pasteura i uważać, aby nie zaburzyć gradientu sacharozy. Drgania z wiru stołowego lub mikrowirówki zakłócą integralność gradientu.
3. Za pomocą pipety Pasteura nałożyć zawieszoną frakcję błony synaptosomalnej (P3) na przygotowany nieciągły gradient sacharozy. Upewnij się, że nachylenia są zrównoważone, ważąc je wewnątrz łyżki wahliwego wirnika kubełkowego. Jeśli wiadra nie są wyważone, użyj pipety P200, aby ostrożnie dodać 0,32 M sacharozy buforowanej przez HEPES na szczyt gradientu i zrównoważyć wiadra wirnika.

9. Frakcjonowanie błony plazmatycznej synaps (SPM)

1. Ultrawirować w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 150 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć gradienty sacharozy z wiader ultrawirówek. Za pomocą igły 18 G i strzykawki o pojemności 1 ml nakłuć probówkę na dnie interfazy roztworu sacharozy buforowanego przez 1,0 M / 1,2 M HEPES i usunąć warstwę błony synaptycznej plazmatyki (SPM).
2. Zwrócić uwagę na objętość zajmowaną przez każdą próbkę SPM w strzykawce o pojemności 1 ml. Zebraną warstwę SPM umieścić w grubościennych probówkach ultrawirówek o grubości 3,5 ml, dodać dokładnie 2,5 objętości 4 mM HEPES, aby dostosować stężenie sacharozy z 1,2 M do 0,32 M. Po dostosowaniu każdej próbki do 0,32 M sacharozy, zrównoważyć probówki 0,32 M roztworem sacharozy buforowanym przez HEPES.
3. Ultrawirować w wirniku o stałym kącie nachylenia 200 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad błony plazmatycznej synaptycznej (SPM) w 300 μl 50 mM roztworu HEPES / 2 mM EDTA. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia w Western Blot.

10. Przygotowanie frakcji gęstości postsynaptycznej (PSD)

1. Próbki SPM rozmrozić na lodzie.
2. Przygotuj roztwór 0,54% Triton X-100 w roztworze 50 mM HEPES / 2 mM EDTA.
3. W probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml połączyć 2,7 ml roztworu Triton X-100/HEPES/EDTA i 300 μl frakcji SPM i obracać próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C
4. Przenieść próbki do grubościennych probówek ultrawirówkowych o pojemności 3,5 ml i odwirować próbki o masie 32 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
5. Zachować supernatant (frakcja rozpuszczalna Triton X-100 [TS]) i przechowywać w temperaturze -80 °C. UWAGA: Na tym etapie osad reprezentuje frakcję "PSD-1T". Drugie traktowanie detergentem wytworzy frakcję "PSD-2T". Jeśli pożądana jest frakcja PSD-1T, przejdź do kroku 10.6.
   1. Aby wytworzyć frakcję PSD-2T, należy ponownie zawiesić granulat w 3 ml 0,5% Triton X-100 w roztworze 50 mM HEPES / 2 mM EDTA. Obracać próbki przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odwirowywać próbki o temperaturze 32 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przejść do kroku 10.6.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad postsynaptyczny (PSD) w roztworze 50 mM HEPES / 2 mM EDTA. UWAGA: Objętość ponownego zawieszenia może zależeć od wielkości granulki; Zalecana objętość 50-75 μl. Ponieważ frakcja PSD jest frakcją nierozpuszczalną w detergentach, często konieczne jest dodanie 1-2 μl 0,5% SDS, aby umożliwić całkowite ponowne zawieszenie białka. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia w Western Blot.

Results

Przygotowanie gradientu gęstości sacharozy powinno skutkować wyraźnym rozdzieleniem trzech molowych roztworów sacharozy (0,8, 1,0 i 1,2 M sacharozy). Rysunek 3A przedstawia przykład gradientu przed dodaniem próbki białka. Jeśli gradient zostanie przygotowany zbyt wcześnie lub jeśli zostanie przygotowany na powierzchni stołu z wibracjami pochodzącymi z innych urządzeń, nachylenie zostanie naruszone i nie zostanie osiągnięta właściwa separacja. Jeżeli wyraźne rozdzielenie trzech roztworów nie jest widoczne...

Discussion

W procedurze jest kilka etapów, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku. W kroku 3 ważne jest, aby osiągnąć stały stopień homogenizacji dla każdej próbki. Podczas homogenizacji tkanek za pomocą homogenizatora napędzanego silnikiem używana jest stała prędkość nie tylko do obracania tłuczka, ale także do liczby uderzeń. Czas inkubacji podczas wstrząsu osmotycznego powinien być precyzyjny, ponieważ przedłużona homogenizacja lub inkubacja w roztworze hipotonicznym spowoduje lizę mitochondriów i zanieczyszczenie p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES, pH 7,4	BioShop	HEP003.100
HEPES	BioShop	HEP001.500
Sacharoza	BioShop	SUC507.1
EDTA	BioBasic	EB0185
PMSF	BioShop	PMS123.5
Aprotynina		BioShop APR600.1
Leupeptyna	BioShop	LEU001.1
Pepstatyna	BioShop	PEP605.5
Benzamidyna	BioShop	BEN601.25
Fluorek sodu	BioShop	SFL001.100
Pirofosforan sodu	BioShop	SPP310.100
Ortowanadan sodu	BioShop	SOV664.10
β-glicerofosforan	BioShop	GYP001.10
Triton X-100	BioShop	TRX506.500
18 G x 1 ½ ” igła	BD	305196
strzykawka 1 cc	Homogenizator szklany 309659
teflonowy Kontes Duall 23	VWR	KT885450-0023
Mieszadło podstawowe IKA Model RW 16	IKA Works	2572100
Wirnik o stałym kącie nachylenia Sorvall SM-24	ThermoScientific	29017
Wirówka Sorvall RC 6 Plus	ThermoScientific	46910
Cienkościenne rurki polialomerowe (13,2 ml)	Beckman Coulter	331372
SW 41 Ti	Silvers Beckman Coulter	331362
Ultrawirówka podłogowa Beckman L-80 Beckman	Beckman Coulter
(3,5 ml)	Rotor
TLA-100.3	Beckman Coulter	349481
Ultrawirówka stołowa Beckman TL-100	Beckman Coulter