Ta metoda została opracowana w celu dostarczenia stałego roztworu leku przez tętnicę szyjną, aby ocenić farmakokinetykę nowych leków w modelach mysich.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wlewy z tętnic szyjnych do analizy farmakokinetycznej i farmakodynamicznej taksanów u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proponując użycie leku, kombinacji leków lub dostarczania leków do nowego systemu, należy ocenić farmakokinetykę leku w modelu badawczym. Ponieważ wykorzystanie modeli mysich jest często istotnym krokiem w przedklinicznym odkrywaniu i opracowywaniu leków1-8, konieczne jest zaprojektowanie systemu do wprowadzania leków myszom w jednolity, powtarzalny sposób. Idealnie byłoby, gdyby system umożliwiał pobieranie próbek krwi w regularnych odstępach czasu w określonym czasie. Możliwość pomiaru stężeń leków za pomocą spektrometrii mas pozwoliła badaczom śledzić zmiany poziomów leków w osoczu w czasie u poszczególnych myszy1, 9, 10. W tym badaniu paklitaksel wprowadzono do myszy transgenicznych jako ciągły wlew tętniczy przez trzy godziny, podczas gdy próbki krwi były jednocześnie pobierane przez krwawienia zaoczodołowe w określonych punktach czasowych. Wlewy z tętnicy szyjnej są potencjalną alternatywą dla wlewów z żyły szyjnej, gdy czynniki takie jak guzy sutka lub inne przeszkody sprawiają, że wlewy szyjne są niepraktyczne. Dzięki tej technice stężenia paklitakselu w osoczu i tkankach osiągnęły podobny poziom w porównaniu z infuzją szyjną. W tym samouczku pokażemy, jak skutecznie cewnikować tętnicę szyjną, przygotowując zoptymalizowany cewnik dla indywidualnego modelu myszy, a następnie pokażemy, jak wprowadzić i zabezpieczyć cewnik do tętnicy szyjnej myszy, przewlec koniec cewnika przez tylną część szyi myszy i podłączyć mysz do pompy, aby zapewnić kontrolowane tempo napływu leku. Wielokrotne krwawienia zadoczodołowe o małej objętości pozwalają na analizę stężeń leków w osoczu w czasie.
Wprowadzenie
Infuzja leku przez tętnicę szyjną może być przeprowadzona niezawodnie i powtarzalnie dzięki optymalizacji sprzętu i techniki. Procedura nie jest skomplikowana, choć wymaga precyzyjnej kontroli i dbałości o szczegóły. Do wyizolowania tętnicy szyjnej i wprowadzenia cewnika potrzebna jest doskonała ostrożność i zręczność, które na ogół można nabyć poprzez praktykę. Zabieg wykonywany przez doświadczonego technika nie powinien trwać dłużej niż jedna godzina. Po udanej operacji mysz powinna wyglądać normalnie i zdrowo (chociaż mysz może reagować na wlew leku), a lek(i) może być podawany w kontrolowanej, jednolitej, ciągłej dawce. Próbki krwi muszą być pobrane z miejsca innego niż tętnica szyjna; Krwawienia zaoczodołowe okazały się łatwe do zebrania i zadowalające do analizy stężeń leków.
Cewniki o optymalnym rozmiarze i kształcie są nieocenionym atutem w przeprowadzaniu udanej infuzji11. Stwierdziliśmy, że cewniki dostępne na rynku są często zbyt duże i/lub zbyt elastyczne, aby umożliwić wygodny dostęp do tętnicy szyjnej myszy. Okazało się, że jest to lepsze rozwiązanie niż tworzenie cewników z polietylenu używanego do łączenia myszy ze strzykawką infuzyjną. Dzięki temu wszystkie rurki, łączniki i igły miały jednakowe wymiary, co uprościło montaż infuzji. Dzięki tej technice nie jest konieczne wpychanie końcówki cewnika do tętnicy poza punkt, w którym jest ona nadal widoczna, a przepływ krwi do tętnicy szyjnej nie jest przywracany, dopóki cewnik nie zostanie wstępnie zabezpieczony. Zmniejsza to ryzyko przebicia tętnicy lub wypchnięcia cewnika przez wysokie ciśnienie przepływu krwi. Konstrukcja cewnika nie zawiera "guzka", który utrzymywałby go na miejscu, dlatego priorytetem jest dobre zabezpieczenie cewnika za pomocą szwów i taśmy chirurgicznej.
Infuzje mogą być lepsze niż zwykłe wstrzyknięcia dożylne bolus, jako lepsze naśladownictwo klinicznego podawania leków, takich jak taksany3, 12, 13. Opisana tutaj technika została pierwotnie opracowana, aby umożliwić infuzję do modeli mysich, w których dostęp do żyły szyjnej lub udowej był wykluczony przez wzrost guza sutka i / lub nadmierne unaczynienie obszaru przyczepu. Ta metoda może być często odpowiednia nawet u myszy wolnych od nowotworu: chociaż izolowanie i cewnikowanie tętnicy szyjnej jest nieco bardziej inwazyjne, stwierdziliśmy, że jest lepsze niż szyjka, ponieważ skłonność ściany szyjnej do rozerwania skutkowała większą liczbą nieudanych insercji i nieudanych prób ukończenia 3-godzinnego kursu czasu.
Chociaż wyniki pokazane tutaj pochodzą od myszy C57BL/6J (wyhodowanych w domu), użyliśmy tej techniki, aby skutecznie wprowadzić paklitaksel do kilku szczepów myszy, w tym FVB i szczepów mieszanych, aby śledzić farmakokinetykę w modelach myszy transgenicznie manipulowanych w celu obniżenia funkcji transportera komórkowego. Pobrane próbki krwi i tkanek wykazały oczekiwane poziomy paklitakselu, w zakresie stężeń obserwowanych po wlewach dożylnych1. Można oczekiwać, że ta technika będzie działać równie dobrze w innych modelach myszy, jak i z innymi roztworami infuzyjnymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Fox Chase Cancer Center oraz przez Laboratorium Zwierząt Facility, i uznany za zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt.
1. Przygotowanie wstępne
- Przygotowanie cewnika: Przygotuj cewnik z krótkiego odcinka rurki polietylenowej, zmodyfikowanego tak, aby tworzył cienki, stępiony koniec (ryc. 3A). Wykonaj wiele cewników z wyprzedzeniem i oszczędzaj w nieskończoność.
- Zapal palnik Bunsena i dostosuj, aby uzyskać niski, stały płomień. Trzymaj rurkę blisko płomienia, aby zmiękczyć polietylen. Gdy rurka zacznie się topić, powoli rozsuń dwa końce, aby utworzyć cieńszą część rurki o średnicy zewnętrznej około 0.25 mm.
- Wytnij skośny koniec około 0,75 cm wzdłuż cienkiego odcinka. Zapewnia to wystarczającą ilość rurki do zamocowania w tętnicy, bez tworzenia zbyt długiego cewnika.
UWAGA: Długa cienka końcówka cewnika ma skłonność do zatykania. Zbyt długi koniec może również pomieścić wystarczającą ilość płynu, aby znacznie zmienić objętość płynu cewnika. - Stęp skośny koniec, przechodząc szybko przez płomień - po odpowiednim podgrzaniu koniec staje się lekko zaokrąglony i powiększony. Końcówka lekko zaczepia się do tyłu, co pomaga zakotwiczyć rurkę podczas wkładania do tętnicy.
- Przetnij rurkę 6,0 cm od punktu, w którym zaczyna się cienkie. To sprawia, że cewnik jest bardzo łatwy w obsłudze, który jest wystarczająco długi, aby przewlec się przez niego, aby wyjść z szyjki i wygodnie trzymać i pracować, ale wystarczająco krótki, aby mysz nie gryzła nadmiaru rurki lub nie wymagała zbyt dużej dodatkowej objętości infuzji w celu usunięcia początkowej soli fizjologicznej.
- Przygotować strzykawkę zawierającą około 0,2 ml roztworu heparyny, zwieńczoną igłą. Włóż igłę do szerokiego końca cewnika (Rysunek 3B). Napełnij cewnik heparyną, uważając, aby w rurce nie było pęcherzyków. Odłóż strzykawkę z heparyną i cewnik na bok w sterylnym miejscu. Wysterylizuj cewniki przez napromienianie promieniami gamma, umieszczając cewnik (cewniki) na szalce Petriego i wystawiając na działanie promieniowania gamma 20 Gy. Jeśli nie masz dostępu do źródła promieniowania gamma, skontaktuj się z zakładem zoologicznym, aby zbadać inne metody sterylizacji, takie jak sterylizacja gazowa lub chemiczna. Nie sterylizuj w autoklawie, ponieważ polietylenu nie można sterylizować termicznie.
- Tworzenie ołowiu soli fizjologicznej (rysunek 3B).
- Przygotować drugą strzykawkę zawierającą około 0,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, uważając, aby linia była wolna od pęcherzyków powietrza.
- Wyciąć drugi kawałek rurki o długości około 15 cm i wsunąć na igłę strzykawki. Podłącz port złącza do wolnego końca rurki.
- Sprawdź, czy przepływ soli fizjologicznej jest niezakłócony, płynnie przepuszczając niewielką objętość soli fizjologicznej przez przewód. Użyj tego przewodu z solą fizjologiczną po wprowadzeniu cewnika, aby sprawdzić przepływ przez cewnik i przepłukać linię krwi. Odłóż strzykawkę z solą fizjologiczną na bok w sterylnym miejscu.
- Przed zabiegiem należy wysterylizować sprzęt w autoklawie lub alternatywnie przez sterylizację gazową lub sterylizację kulkami szklanymi.
- Przygotuj sterylne pole operacyjne.
- Przetrzyj powierzchnie stołowe i mikroskopowe środkiem dezynfekującym, takim jak 70% etanol lub dwutlenek chloru. Ławka przykrywająca i podstawa mikroskopu z czystym, jednorazowym wkładem chłonnym.
- Przygotuj tablicę chirurgiczną, przykrywając ją dwiema warstwami czystego, chłonnego papieru, bezpiecznie przymocowanego taśmą klejącą.
- Rozłóż wszystkie materiały chirurgiczne (zgodnie z katalogiem na liście materiałów) tak, aby były łatwo dostępne.
- Odetnij trzy odcinki sterylnego szwu, każdy o długości 8 cm każdy, i odłóż na bok z innymi materiałami. Umieść port w miejscu, w którym będzie łatwo dostępny (Rysunek 3B).
2. Chirurgia
- Przygotowanie zwierzęcia
- Znieczulij mysz poprzez wystawienie na działanie 2-3% izofluranu w komorze anestezjologicznej podłączonej do precyzyjnego waporyzatora. Wyjmij mysz z komory i zgol włosy z szyi myszy / górnej części tułowia i poniżej prawego ucha (miejsce wyjścia cewnika). Podawać weterynaryjną maść okulistyczną z wazeliną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. Upewnij się, że zwierzę nie obudzi się podczas przygotowań chirurgicznych, pozostawiając myszy wystarczająco dużo czasu w komorze inhalacyjnej przed przygotowaniem (co najmniej dwie minuty) lub podając myszowi izofluran za pomocą stożka nosowego podczas przygotowania. Wróć mysz do komory anestezjologicznej.
- Gdy mysz jest wystarczająco obojętna, przenieś się do sterylnego obszaru chirurgicznego, umieść stożek znieczulający na nos i usta myszy i przekieruj przepływ izofluranu do stożka nosowego. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc łapę kleszczami; Gdy mysz nie wykaże żadnej reakcji, przejdź do następnego kroku.
- Ustaw mysz na plecach, z głową skierowaną w stronę badacza. Przymocuj uszy, przednie i tylne łapy do deski chirurgicznej za pomocą taśmy klejącej lub innego urządzenia krępującego, aby utrzymać mysz stabilnie. Oczyść miejsce nacięcia jodonem powidonu i 70% etanolem.
- Izolacja tętnicy szyjnej
- Wykonaj podłużne cięcie o długości 1 cm nieco na prawo od linii środkowej szyi. Użyj kleszczy, aby oddzielić tłuszcz i mięśnie, aby odsłonić tchawicę (ryc. 4A). Zlokalizuj tętnicę szyjną biegnącą równolegle do tchawicy (ryc. 4B).
- Ostrożnie użyj kleszczy, aby oddzielić powięź leżącą nad tętnicą (ryc. 4C). Lekko odciągnij nerw błędny od tętnicy szyjnej i włóż kleszcze w przestrzeń między nimi. Delikatnie otwórz kleszcze, aby utworzyć szczelinę w powięzi i ostrożnie odciągnij nerw od tętnicy, od rozwidlenia tętnicy w pobliżu krtani (przedni koniec), w górę (tylny) tak daleko, jak to możliwe (co najmniej 3 mm) (ryc. 4D).
- Usuń pozostałą powięź, aż tętnica zostanie dobrze odizolowana (ryc. 4E). Od czasu do czasu dodawaj kroplę soli fizjologicznej do obszaru operacyjnego, aby tkanka była wilgotna, a tym samym mniej krucha i mniej podatna na przypadkowe rozdarcia.
- Założenie szwów i przygotowanie tętnicy do wprowadzenia cewnika (ryc. 4, 5).
- Użyj kleszczy, aby narysować jedwabną nić do szwów pod tętnicą. Zawiąż bezpieczny węzeł, aby zamknąć tętnicę jak najdalej w kierunku przedniej (ryc. 4F).
- Narysuj drugą nić pod tętnicą. Zawiąż zwijany węzeł, aby tymczasowo zamknąć tętnicę jak najdalej w kierunku tylnej części (ryc. 4F).
- Narysuj trzecią nić pod tętnicą. Zawiąż bardzo luźny węzeł między pierwszymi dwoma szwami, który będzie służył do szybkiego zabezpieczenia cewnika po założeniu (ryc. 4G).
- Trzymaj końce wszystkich szwów z dala od drogi, zwilżając je odrobiną 70% etanolu.
- Wprowadzenie cewnika
- Za pomocą szwu chwyć dolny węzeł, aby lekko naciągnąć tętnicę. Przecina tętnicę powyżej, ale bardzo blisko szwu przedniego (ryc. 4H). Uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko, ale sprawdź szczelinę, aby upewnić się, że otwór jest drożny.
- Wyjąć cewnik wypełniony heparyną z igły strzykawki, starając się uniknąć tworzenia dużych kieszeni powietrza na obu końcach. Manipuluj cewnikiem, aby ustawić skos pod wygodnym kątem, zwykle w dół i lekko w prawo (dla osób praworęcznych).
- Trzymając się szwu, aby tętnica pozostała lekko napięta, delikatnie włóż cewnik do szczeliny (ryc. 4I). Użyj kleszczy, aby przytrzymać szew przedni i pociągnij tętnicę w dół nad cewnikiem (nadmierne naciskanie cewnikiem może spowodować przebicie tętnicy przez skośny koniec). Ostrożnie zwolnij cewnik i szew przedni.
- Zabezpieczenie cewnika i zainicjowanie przepływu krwi (ryc. 4J, 5B).
- Zabezpiecz cewnik, zaciskając węzeł środkowego szwu, w pobliżu wejścia cewnika do tętnicy. Zrób ciasny potrójny węzeł, ale pamiętaj, aby nie ciągnąć tak mocno, aby utrudnić przepływ przez cewnik. Dodatkowo zabezpiecz cewnik, wiążąc go szwem przednim, poniżej wejścia do tętnicy.
- Przymocuj przewód soli fizjologicznej do cewnika za pomocą wtyczki złącza, ponownie starając się uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do linii.
- Chwyć końce tylnego szwu i delikatnie pociągnij, aby uwolnić węzeł. Manewruj szwem w dół tętnicy, nad końcem cewnika (nie usuwaj nici). Krew powinna płynąć do cewnika; Jeśli nie ma przepływu krwi, delikatnie poruszaj cewnikiem, aby spróbować usunąć zwężenie.
- Gdy przepływ wydaje się niezakłócony, użyj ostatniej nici (od tylnego szwu), aby zawiązać dodatkowy węzeł, nieco powyżej środkowego szwu.
- Tymczasowe uszczelnienie cewnika. Przepłucz cewnik krwią, a następnie użyj hemostatu, aby zacisnąć koniec cewnika blisko wtyczki złącza. Wyjmij złącze i zastąp je zatyczką portu, aby uszczelnić koniec cewnika i wyjmij hemostat.
- Zmiana położenia cewnika do wyjścia z tyłu szyi.
- Trzymając kleszcze w każdej ręce, użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać cewnik tuż pod szwem przednim, a drugą wciśnij zagięcie w cewnik, aby łatwo zgiął się na bok. Powtórz, aby utworzyć drugie załamanie. Pozwala to na pociągnięcie wolnego końca cewnika w kierunku tyłu głowy myszy, bez zmuszania końcówki cewnika do obracania się na boki względem ściany tętnicy.
- Obróć mysz na (lewy) bok, trzymając stożek nosa umieszczony nad ustami i nosem, a następnie oczyść obszar nacięcia 70% etanolem i jodowidonem. Wykonaj małe nacięcie (około 4 mm) poniżej i za prawym uchem.
- Użyj kleszczy, aby przytrzymać otwarty płat skóry, jednocześnie pracując pustą sondą pod skórą, aby utworzyć kanał przez policzek do jamy na szyi. Wskazane jest, aby umieścić sondę wokół gruczołu ślinowego, zamiast próbować wchodzić między gruczoł a skórę. Użyj kleszczy, aby ostrożnie zwolnić miejsce na wyjście sondy.
- Przekręć zatyczkę portu/cewnik przez sondę, aby wyjść w szyjce. Nie ciągnij zbyt mocno; Upewnij się, że cewnik nie miażdży ani nie zwęża naczyń krwionośnych lub narządów.
- Zamknięcie i odzyskiwanie. Miejscowo podać środek przeciwbólowy (np. bupiwakainę) do nacięcia barku i przykryć ranę wodoodporną, chirurgiczną taśmą klejącą. Nałóż drugi kawałek taśmy klejącej, aby dodatkowo zabezpieczyć cewnik.
- Podaj miejscowy środek przeciwbólowy na nacięcie klatki piersiowej i zamknij ranę jedwabiem lub zszywkami.
- Wyjmij mysz ze znieczulenia i pozwól zwierzęciu dojść do siebie w czystej, ogrzanej przestrzeni (umieść klatkę na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą) na co najmniej 30 minut.
3. Napar
- Przygotować podwielokrotności 5 mg/ml roztworu paklitakselu / metanolu.
- Odmierzyć 50 mg paklitakselu do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml sterylnego metanolu. Rurka z nakrętką. Obracać ręcznie lub na obracającym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej, aż proszek się rozpuści.
- Podzielić 500 μl roztworu na 20 małych probówek do zamrażania i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Rozmrozić pojedynczą porcję w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, bezpośrednio przed infuzją.
- Przygotować pompę infuzyjną (Rysunek 6).
- Wytnij długą rurkę polietylenową o długości około 40 cm. Przymocuj igłę do jednego końca, a port złącza do drugiego.
- Nabrać lek do strzykawki o znanej średnicy wewnętrznej (większość programowalnych pomp wymaga średnicy cylindra strzykawki, aby obliczyć prędkość ramienia pompy). Przymocować igłę do strzykawki i wprowadzić lek przez igłę i rurkę.
- Umieścić strzykawkę w pompie zgodnie ze wskazówkami producenta. Zalać pompę tak, aby lek płynnie wypływał z korka złącza i był gotowy do infuzji.
- Podłącz mysz do pompy.
- Trzymaj mysz nieruchomo i użyj hemostatu do zaciśnięcia cewnika w pobliżu wtyczki portu. Wyjmij wtyczkę i zastąp ją złączem dołączonym do strzykawki i rurki.
UWAGA: Krew może zacząć przepływać z powrotem przez rurki. - Szybko podać szybką pompę, aby oczyścić objętość cewnika (obliczoną empirycznie na podstawie obserwacji objętości 6 cm rurki), a następnie natychmiast przejść do żądanej szybkości infuzji.
- Trzymaj mysz nieruchomo i użyj hemostatu do zaciśnięcia cewnika w pobliżu wtyczki portu. Wyjmij wtyczkę i zastąp ją złączem dołączonym do strzykawki i rurki.
- Kontynuuj infuzję paklitakselu przez trzy godziny.
- Od czasu do czasu monitoruj przewody, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków na skrzyżowaniach, ponieważ często jest to oznaką zablokowania przepływu do myszy. Obserwuj mysz pod kątem spodziewanych lub nieoczekiwanych reakcji na infuzję (letarg lub nadpobudliwość, objawy dyskomfortu).
- W zależności od długości i charakteru naparu mysz może nie jeść ani nie pić, ale należy zapewnić dostęp do jedzenia i wody zgodnie z ustaloną polityką instytucji. Należy pamiętać o możliwości odwodnienia myszy poprzez pobieranie dużych ilości krwi.
- Kontynuuj utrzymywanie klatki w cieple za pomocą poduszki grzewczej lub lampy, chyba że mysz wydaje się chcieć trzymać się z dala od ciepła. Jeśli zwierzę nie zostanie poddane eutanazji w ciągu kilku godzin po operacji, należy wdrożyć plan leczenia pooperacyjnego zwierzęcia, w tym sterylne warunki przetrzymywania i leczenie bólu pooperacyjnego.
- Uważnie obserwuj mysz, szczególnie w ciągu pierwszych kilku minut, aby upewnić się, że nie wyciąga rurki z powodu nadpobudliwości lub podrażnienia rurki (co może być oznaką złego włożenia). Jeśli mysz nie jest nadmiernie aktywna, ciągłe monitorowanie może nie być konieczne, ale rutynowo sprawdzaj mysz, aby upewnić się, że zwierzę nie zaplącze się w rurkę. System uprzęży i uwięzi są dostępne na rynku, ale ich zastosowanie wykracza poza zakres tego protokołu.
- Pobieranie próbek.
- Pobieraj próbki krwi w regularnych odstępach czasu przez krwawienia podżuchwowe lub zaoczodołowe (jeśli twój protokół nie wykorzystuje modeli guza sutka, rozważ pobranie krwi przez cewnik szyjny wprowadzony w tym samym czasie co cewnik do tętnicy szyjnej). Uważaj, aby nie ciągnąć za linię infuzyjną. W przypadku krwawienia zadoczodołowego należy lekko znieczulić mysz wziewnym środkiem znieczulającym (np. metoksyfluranem), aby nie trzeba było chwytać za kark, aby zabezpieczyć mysz.
- Odwiruj krew w wirówce do hemokrytu, aby oddzielić komórki krwi od osocza. Użyj pilnika lub pisaka z diamentową końcówką, aby naciąć rurkę na powierzchni separacji faz. Rozbij probówkę i zbierz tylko osocze do małej, nadającej się do zamrażania probówki. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
UWAGA: Jeśli wirówka do hemokrytu nie jest dostępna, przenieś próbkę krwi do probówki mikrowirówki i wiruj w mikrowirówce z dużą prędkością, aby oddzielić komórki krwi od osocza. Zebrać osocze do drugiej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C. - Eutanazja myszy przez uduszenie CO2. Pobrać tkankę (około 20 – 50 mg) z interesujących nas narządów i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
4. Przykładowa analiza
UWAGA: Wszystkie próbki do tego protokołu zostały przeanalizowane przez zewnętrzne laboratorium za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS), która obliczyła stężenia paklitakselu w następujący sposób:
- Wyodrębnić paklitaksel z próbek. Homogenizować próbkę tkanki w 0,1% kwasie octowym, 50% metanolu przed ekstrakcją. Ekstrahować paklitaksel metodą ekstrakcji ciecz/ciecz, przy użyciu eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE) wzmocnionego wewnętrznym wzorcem analogowym (docetakselem). Usunąć MTBE i wysuszyć próbki. Zawiesić w 50% roztworze acetonitrylu i 0,1% kwasu octowego.
- Przygotuj wzorce kalibracyjne. Dodać znane stężenie paklitakselu do odpowiedniej matrycy C57BL/6, aby uzyskać ostateczny zakres wzorców (od 1 do 20 000 ng/ml dla próbek osocza, od 0,1 do 5 000 ng/ml dla próbek tkanek). Wyodrębnij wzorce w dwóch egzemplarzach, stosując tę samą metodę, co w przypadku powyższych próbek badawczych. Zmierzyć pik paklitakselu w próbkach za pomocą HPLC/MS/MS z wykorzystaniem jonizacji elektronrozpylacyjnej.
- Obliczyć stężenie na podstawie stosunku powierzchni paklitakselu do wzorca wewnętrznego. Użyj wzorców kalibracyjnych, aby utworzyć krzywą standardową i interpolowane próbki badań według dopasowania do krzywej. Znormalizować stężenie badanych próbek przez początkową masę próbki przed homogenizacją.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rozkład paklitakselu przebiega zgodnie z przewidywalnymi wzorcami podczas 3-godzinnego schematu dawkowania, obejmującego 15-minutowy szybki wlew, po którym następuje 165-minutowy wolny wlew.
Rysunek 1 przedstawia porównanie stężeń paklitakselu w osoczu po infuzji do żyły szyjnej oraz po infuzji do tętnicy szyjnej. Stężenia paklitakselu gwałtownie spadają w ciągu pierwszych 15 min po początkowej infuzji dużej objętości, a następnie stabilizują się w ciągu następnych 150 min. Dl...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wlew z tętnicy szyjnej jest istotną techniką w tym badaniu farmakokinetyki paklitakselu. Wlew z tętnicy szyjnej to metoda szybkiego rozprowadzania leku w całym układzie krążenia14. 3-godzinny wlew jest bliższym naśladowaniem klinicznego podawania leków, takich jak taksany, niż wstrzyknięć w bolusie. Operacja może być niezawodnie wykonana przez jedną osobę, czas operacji jest stosunkowo krótki, a wskaźniki sukcesu wynoszą >75%. Po pobraniu próbek należy je przeanalizować odpowiednimi metodami. Zastosowaliśmy sp...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Zakładowi Zwierząt Laboratoryjnych FCCC za ich wsparcie w tym projekcie. Dziękujemy firmie Wolfe Laboratories, Inc. za pomoc w analizie poziomu paklitakselu w osoczu i tkankach. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health K01CA120091 dla E.H.B., a CA06927 dla Fox Chase Cancer Center.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurki polietylenowe 0,024" OD X 0,011" Identyfikator | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Igły (rozmiar 30) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Wtyczka portu ze stali nierdzewnej (rozmiar 28) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Nieco większy niż średnica rury PE, aby dobrze przylegać i zachować szczelne uszczelnienie. |
| 2 wtyki złączy ze stali nierdzewnej (rozmiar 30) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Trzy strzykawki o pojemności 1 cm3 | Becton, Dickinson and Co. | ||
| Sterylny 0,9% roztwór soli | fizjologicznej Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Roztwór heparyny/glicerolu | Braintree Scientific, Inc. | Szew jedwabny HGS | |
| Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | ||
| Vanna Nożyczki (mikronożyczki) | World Precision Instruments | 14122 | Ten model ma zakrzywioną końcówkę, ale sprawdzają się również nożyczki z prostą końcówką. |
| Kleszcze hemostatyczne Hartman Mesquito | Światowe instrumenty precyzyjne | 501705 | |
| Waciki Betadine | Produkty Perdue L.P. | BSWS1S | |
| Bupiwakaina | Hospira | 0409-1160-01 | Można zastąpić lidokainą lub podobnym środkiem znieczulenia miejscowego. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Mikrohematokryty probówki kapilarne, heparynizowany | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Uszczelniacz do mikrokapilarek | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J myszy | Fox Chase Cancer Center, Laboratorium Animal Facility własnej hodowli | ||
| API 4000 Q-Trap masowy spetrometr | Applied Biosystems |
Bibliografia
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V. Clinical Pharmacokinetics of Paclitaxel. Clinical Pharmacokinetics. 27 (4), 256-269 (1994).
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Squibb & Sons, L.L.C. Drug Information for TAXOL (Paclitaxel) Injection. , Bristol-Myers Squibb Company. (2011).
- Abraxis BioScience L.L.C. Full Prescribing Information ABRAXANE for Injectable suspension (paclitaxel protein-bound particles for injectable suspension) (albumin-bound). , Celgene Corporation. (2013).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
