Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

24.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51943

⸱

13 listopada 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic, Cardiac, and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule wideo opisujemy syntezę in vitro zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach.

Streszczenie

Egzogenne dostarczanie kodującego syntetycznego informacyjnego RNA (mRNA) do indukcji syntezy białek w pożądanych komórkach ma ogromny potencjał w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, podstawowej biologii komórki, leczenia chorób i przeprogramowania komórek. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół generowania zmodyfikowanego mRNA o obniżonym potencjale aktywacji immunologicznej i zwiększonej stabilności, kontroli jakości wytwarzanego mRNA, transfekcji komórek z mRNA i weryfikacji indukowanej ekspresji białka za pomocą cytometrii przepływowej. Do 3 dni po pojedynczej transfekcji mRNA eGFP, transfekowane komórki HEK293 wytwarzają eGFP. W tym artykule wideo jako przykład opisano syntezę mRNA eGFP. Procedura ta może być jednak stosowana do produkcji innego pożądanego mRNA. Za pomocą syntetycznego zmodyfikowanego mRNA można skłonić komórki do przejściowej ekspresji pożądanych białek, których normalnie by nie wyraziły.

Wprowadzenie

W komórkach transkrypcja informacyjnego RNA (mRNA) i następująca po niej translacja mRNA na pożądane białka zapewniają prawidłowe funkcjonowanie komórek. Dziedziczne lub nabyte zaburzenia genetyczne mogą prowadzić do niewystarczającej i dysfunkcyjnej syntezy białek oraz powodować poważne choroby. Tak więc nowym podejściem terapeutycznym do indukowania produkcji brakujących lub wadliwych białek jest egzogenne dostarczanie syntetycznego zmodyfikowanego mRNA do komórek, które koduje pożądane białko. W ten sposób komórki są pobudzane do syntezy funkcjonalnych białek, których normalnie nie mogą wyprodukować lub naturalnie nie potrzebują. Stosując to podejście, zaburzenia genetyczne można skorygować poprzez wprowadzenie mRNA, które koduje wadliwe lub brakujące białko 1. Terapia mRNA może być również stosowana do szczepień w celu syntezy antygenów białkowych, które ulegają ekspresji przez komórki nowotworowe lub patogeny. W ten sposób można aktywować układ odpornościowy gospodarza, aby skutecznie eliminować komórki nowotworowe lub zapobiegać infekcjom 2,3. Co więcej, w ostatnich latach mRNA było z powodzeniem wykorzystywane do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W tym celu fibroblasty transfekowano mRNA, aby indukować ekspresję czynników przeprogramowujących 4-6 i przekształcać je w iPSC o ogromnym potencjale w medycynie regeneracyjnej.

Poprzednio, użycie konwencjonalnego mRNA wiązało się z niską stabilnością i silną immunogennością. W związku z tym kliniczne zastosowania konwencjonalnych mRNA były ograniczone. Jednak zastąpienie cytydyny i urydyny przez 5-metylocytydynę i pseudourydynę w cząsteczce mRNA przez Kariko i współpracowników sprawiło, że cząsteczki mRNA stały się stabilne w płynach biologicznych i radykalnie zmniejszyły aktywację immunologiczną 7-10, co obecnie umożliwia kliniczne zastosowanie zmodyfikowanych mRNA.

Korzystając z syntetycznie wytworzonych zmodyfikowanych mRNA, pożądane transkrypty genów mogą być tymczasowo dostarczone in vivo 11 lub in vitro w celu wywołania ekspresji białka. Wprowadzone mRNA jest poddawane translacji w warunkach fizjologicznych przez komórkową maszynerię translacyjną. Ze względu na brak integracji z genomem komórki gospodarza w porównaniu z wektorami wirusowej terapii genowej, ryzyko onkogenezy jest zapobieżone 12,13. Dzięki temu terapia z wykorzystaniem zmodyfikowanego syntetycznego mRNA uzyska w przyszłości lepszą akceptację kliniczną.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół produkcji zmodyfikowanego mRNA (Rysunek 1), transfekcji komórek z mRNA i oceny ekspresji białek w transfekowanych komórkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Augmentacja plazmidów zawierających wymagane sekwencje kodujące DNA (CDS)

  1. Wstępnie podgrzać pożywkę SOC, która jest dołączona do zestawu do transformacji, do temperatury pokojowej, a płytki agarowe LB zawierające 100 μg/ml ampicyliny do temperatury 37 °C. Wyrównać temperaturę łaźni wodnej do 42 °C.
  2. Rozmrozić jedną fiolkę chemicznie składowej E. coli na lodzie.
  3. Dodać 1-5 μl plazmidu (10 pg do 100 ng) zawierającego CDS do fiolki z chemicznie składową E. coli i delikatnie wymieszać. Nie mieszać komórek przez pipetowanie. Po dodaniu plazmidów wymieszaj, delikatnie stukając w probówkę.
  4. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
  5. Szok termiczny E. coli przez 30 sekund w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej bez wstrząsania.
  6. Umieścić fiolkę na lodzie na 2 minuty.
  7. Dodać 250 μl wstępnie podgrzanej pożywki SOC do E. coli i wstrząsać bakteriami poziomo z prędkością 300 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze bakteryjnym.
  8. Rozprowadzić 100 μl i 150 μl z mieszanki transformacyjnej na wstępnie ogrzanych płytkach agarowych LB, odwrócić płytki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  9. Po tym, jak kolonie staną się widoczne, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z każdej płytki do 15 ml probówki hodowlanej zawierającej 5 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 300 obr./min, aż kultura znajdzie się w fazie późnej logarytmicznej lub stacjonarnej.
  10. W celu długotrwałego przechowywania przekształconej E. coli należy odpipetować 75 μl 100% glicerolu do kriowialu. Dodać 225 μl kultury bakteryjnej (zamrożony bulion będzie zawierał 25% glicerolu), dobrze wymieszać i przechowywać kriowial w temperaturze -80 °C.
  11. Wyizolować plazmidy zawierające wymagane CDS za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta.
  12. Określić stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru.
  13. Przygotować porcje o objętości 20 μl i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.

2. Amplifikacja wstawek plazmidowych i dodawanie ogona poli T przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)

  1. UWAGA: Aby uzyskać matrycę DNA do transkrypcji in vitro (IVT), interesujący CDS, w tym przypadku eGFP, jest amplifikowany za pomocą PCR. Jednocześnie do wkładu dodaje się poli T-tail ze 120 tymidynami (T) za pomocą odwrotnego startera z przedłużeniem T120. W ten sposób wygenerowane mRNA uzyskują ogon poli A o określonej długości po IVT.
  2. Przygotować mieszaninę PCR zgodnie z tabelą 1.
  3. Dokładnie wymieszaj mieszankę reakcyjną. UWAGA: Produkt PCR może być stosowany w 4-5 reakcjach IVT. Aby zwiększyć ilość matrycy DNA do IVT, można zwiększyć całkowitą objętość mieszaniny PCR. Można użyć kilku probówek PCR, z których każda zawiera 100 μl mieszaniny PCR, aby uzyskać wystarczającą wydajność produktu PCR.
  4. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom PCR przy użyciu protokołu cyklicznego PCR (Tabela 2).
  5. Oczyść reakcję PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta i wymyj DNA za pomocą 20 μl wody wolnej od nukleaz
    6. .
  6. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. UWAGA: Wykryte stężenie DNA wynosi około 300 μg/ml. Zatem oczekiwana łączna ilość powinna wynosić ~6 μg. Ilość DNA dla innych białek może się różnić w zależności od długości CDS, ilości plazmidu użytego do PCR, temperatury wyżarzania starterów i liczby cykli.
  7. Zamrażać DNA w temperaturze -20 °C przez długi czas lub używać go bezpośrednio do IVT.

3. Etap kontroli: Jakość produktu PCR

  1. Sprawdź jakość produktu PCR za pomocą elektroforezy żelu DNA.
  2. Wymieszaj żądaną ilość agarozy z 1x TBE w kolbie. Aby uzyskać 1% żel agarozowy, dodaj 0,5 g agarozy do 50 ml 1x TBE.
  3. Kuchenka mikrofalowa, aż agaroza się rozpuści. Nie pozwól mu się zagotować. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie w roztworze.
  4. Dodaj 5 μl barwnika z kwasem nukleinowym do 50 ml żelu agarozowego.
  5. Wlej żel do pudełka z żelem agarozowym, ustaw grzebień i odczekaj około 1 godziny, aż żel stężeje.
  6. Wyjmij grzebień i umieść pojemnik z żelem w tacce na żel.
  7. Wymieszać 2 μl (200 ng) 80-10 000 pz DNA-Ladder i 200 ng produktu PCR każdy z 2 μl 6x buforem ładującym w całkowitej objętości 12 μl.
  8. Ostrożnie załaduj próbki DNA do studzienek żelu agarozowego.
  9. Używając 1x TBE jako bufora bieżącego, uruchom żel agarozowy pod napięciem 100 V przez 1 godzinę.
  10. Wizualizuj prążki DNA w systemie obrazowania (ryc. 2).

4. Transkrypcja in vitro (IVT)

  1. UWAGA: Po PCR wstawki plazmidowe są amplifikowane i dodawany jest poli T-tail. Podczas IVT informacja genetyczna jest transkrybowana z DNA na RNA. Wygenerowany transkrypt mRNA jest wykorzystywany do produkcji białek w komórkach.
  2. Oczyść obszar roboczy i pipety roztworem do odkażania RNazy. Używaj czystych i sterylnych końcówek do pipet z podwójnym filtrem do PCR i często zmieniaj rękawice, aby zminimalizować zanieczyszczenie mieszanin reakcyjnych RNazami.
  3. Przygotować mieszaninę analogową NTP/nasadki zgodnie z opisem w Tabeli 3.
  4. Dokładnie wymieszaj mieszaninę analogową NTP/nasadki przez wirowanie i krótko odwiruj.
  5. Zebrać mieszaninę reakcyjną IVT zgodnie z opisem w tabeli 4.
  6. Mieszaninę reakcyjną IVT dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie krótko odwiruj probówkę PCR, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w termomikserze.
    UWAGA: Optymalny czas inkubacji zależy od długości insertów i wydajności transkrypcji danego szablonu. W przypadku krótkich wkładek (<500 nt) korzystny może być dłuższy czas inkubacji. Można przeprowadzić eksperyment z biegiem w czasie, aby określić optymalny czas inkubacji dla maksymalnego plonu. Dlatego należy ustawić reakcje IVT, na przykład na 1, 2, 3, 4, 6 godzin i inkubację nocną i określić ilość mRNA. Kinetykę transkrypcji in vitro w celu wytworzenia mRNA eGFP przedstawiono na rycinie 3.
  8. W celu usunięcia matrycowego DNA dodać 1 μl DNazy (2 U/μl) do mieszaniny reakcyjnej IVT, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Mieszaninę reakcyjną należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dwukrotnie wypłucz zmodyfikowane mRNA z błony kolumny spinowej za pomocą 40 μl wody wolnej od nukleaz. UWAGA: Wykryte stężenie RNA wynosi około 1 500 μg/ml. Zatem oczekiwana łączna ilość powinna wynosić ~120 μg. Ilość syntetyzowanego mRNA dla innych białek może się różnić w zależności od długości CDS i ilości produktu PCR użytego do IVT.

5. Leczenie oczyszczonego mRNA fosfatazą antarktyczną

  1. UWAGA: Wygenerowane mRNA jest traktowane fosfatazą w celu usunięcia trifosforanów 5', które mogą być rozpoznane przez RIG-I i prowadzą do aktywacji immunologicznej. Ponadto leczenie fosfatazą zapobiega recyrkularyzacji w reakcji samoligacji.
  2. Dodać 9 μl 10x buforu reakcyjnego fosfatazy antarktycznej do 79 μl oczyszczonego roztworu mRNA. Następnie dodać 2 μl fosfatazy antarktycznej (5 U/μl) i delikatnie wymieszać próbkę. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Mieszaninę reakcyjną należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dwukrotnie eluować zmodyfikowane mRNA z błony kolumny spinowej za pomocą 50 μl wody wolnej od nukleaz.
  4. Zmierz stężenie zmodyfikowanego mRNA za pomocą spektrofotometru. Sprawdzić, czy stosunek absorbancji przy 260 nm/280 nm (A260/A280) wynosi ≥ 1,8, a stosunek A260/A230 wynosi 2,0, co wskazuje na czystość.
    UWAGA: Oczekiwana łączna wydajność powinna wynosić około 90 μg, co jest wystarczające dla około 36 transfekcji mRNA.
  5. Dostosuj stężenie mRNA do 100 ng/μl, dodając wodę wolną od nukleaz.
  6. Zmodyfikowane mRNA należy podzielić na jednorazowe podwielokrotności wymagane do transfekcji i przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Prawidłowo przygotowane i przechowywane mRNA jest stabilne przez wiele lat. Podczas pracy zawsze trzymaj zmodyfikowane mRNA na lodzie.

6. Etap kontroli: Jakość syntetyzowanego zmodyfikowanego mRNA

  1. Sprawdź jakość zmodyfikowanego mRNA za pomocą elektroforezy żelowej RNA.
  2. Wymieszaj żądaną ilość agarozy z 1x TBE w kolbie. Aby uzyskać 1% żel agarozowy, dodaj 0,5 g agarozy do 50 ml 1x TBE.
  3. Kuchenka mikrofalowa, aż agaroza się rozpuści. Nie pozwól mu się zagotować. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie w roztworze.
  4. Dodaj 5 μl barwnika z kwasem nukleinowym do 50 ml żelu agarozowego.
  5. Wlej żel do pudełka z żelem agarozowym, ustaw grzebień i odczekaj około 1 godziny, aż żel zastygnie.
  6. Wyjmij grzebień i umieść pojemnik z żelem w tacce na żel.
  7. Wymieszać 3 μl (3 μg) drabinki RNA o wielkości 0,5-10 kb i 200 ng zsyntetyzowanego zmodyfikowanego mRNA, każdy z 7 μl buforu ładującego w całkowitej objętości 10 μl. Skład bufora załadowczego opisano w tabeli 5.
  8. Denaturować drabinkę i próbki mRNA w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  9. Ostrożnie załaduj drabinkę i próbki mRNA na 1% żel agarozowy.
  10. Wykonaj elektroforezę przy napięciu 100 V przez 1 godzinę przy użyciu 1x TBE jako bufora bieżącego.
  11. Zwizualizuj drabinkę i prążki mRNA na transiluminatorze UV i sfotografuj za pomocą systemu dokumentacji żelu (ryc. 4).

7. Przygotowanie komórek do transfekcji

  1. Płytka 2 x105 komórek (komórki HEK293) na dołek płytki 12-dołkowej.
  2. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym. UWAGA: W dniu transfekcji komórki powinny osiągnąć 80-90% zbieżności.

8. Wykonywanie transfekcji mRNA komórek

  1. Rozmrozić zmodyfikowane mRNA.
  2. Wygeneruj lipopleksy do transfekcji.
  3. Dodać 25 μl (2,5 μg) zmodyfikowanego mRNA i 2 μl odczynnika do transfekcji lipidów kationowych do 473 μl Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I zredukowałem pożywkę surowicy, aby wytworzyć mieszaninę transfekcji do transfekcji jednego dołka 12-dołkowej płytki. Zwiększ objętości w zależności od liczby studzienek, które mają być transfekowane. Jako kontrolę ujemną przygotuj mieszaninę transfekcji bez mRNA.
  4. Składniki należy delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby wytworzyć lipopleksy do transfekcji.
    UWAGA: Mieszanina transfekcyjna nie zawiera antybiotyków. Dlatego należy zadbać o zapewnienie sterylności podczas obchodzenia się z komórkami.
  5. Przemyć komórki 500 μl DPBS/studzienkę.
  6. Dodać 500 μl mieszaniny transfekcyjnej do jednego dołka płytki 12-dołkowej.
  7. Inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Odessać mieszaninę transfekcji i dodać do komórek 1 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych.
  9. Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze komórkowym.
  10. Wykonaj analizy mikroskopowe fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 5). UWAGA: Aby zbadać ekspresję innych białek w komórkach, które są wytwarzane przez transfekcję z innym mRNA niż eGFP kodujące mRNA, komórki można hodować na szkiełkach nakrywkowych. Następnie można wykonać transfekcję, a komórki można wybarwić odpowiednimi przeciwciałami i przeanalizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

9. Analizy cytometryczne przepływu ekspresji eGFP w komórkach

  1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i umyć każdą studzienkę 1 ml DPBS (bez wapnia i magnezu). Dodać 500 μl trypsyny/EDTA do dołka, aby oderwać komórki od powierzchni płytek do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 500 μl TNS na studzienkę, aby dezaktywować trypsynę.
  2. Odwirować oderwane komórki przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć sklarowany osad, pozostawiając tylko osad. Zawiesić osad komórkowy w roztworze do utrwalania komórek o stężeniu 150 μl i przenieść zawiesinę komórek do probówki do cytometrii przepływowej.
  3. Przeanalizuj procent komórek wykazujących ekspresję eGFP i intensywność fluorescencji za pomocą średniej geometrycznej (średnia geometryczna intensywności fluorescencji) (ryc. 6).

10. Pomiar ekspresji białka w czasie

  1. Wykonaj transfekcję mRNA komórek w 3 dołkach 12-dołkowej płytki, jak opisano w kroku 8. Dodatkowo inkubować 3 dołki komórek HEK293 z mieszaniną transfekcji bez dodatku mRNA.
  2. Zmierz ekspresję eGFP 1, 2 i 3 dni po transfekcji, aby ocenić czas trwania ekspresji białka (ryc. 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując plazmid pcDNA 3.3 zawierający CDS eGFP, opracowano syntezę zmodyfikowanego mRNA eGFP (Rycina 1). Po amplifikacji insertu metodą PCR i dodaniu ogona poly T, wykryto wyraźny prążek o długości około 1 100 bp (Rycina 2). Wydłużenie czasu IVT zwiększyło wydajność mRNA (Rycina 3). Po IVT wykryto wyraźny prążek mRNA o długości około 1 100 bp, co odpowiada długości produkowanego mRNA eGFP (Rycina 4).

Funkcjonalność wygen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Terapia mRNA ma ogromny potencjał w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, leczenia chorób i szczepień. W tym filmie pokazujemy produkcję stabilizowanego, zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach. Za pomocą tego protokołu można wygenerować inne pożądane mRNA. Synteza zmodyfikowanego mRNA in vitro umożliwia transfekcję komórek z pożądanymi mRNA w celu indukowania ekspresji docelowych białek. W ten sposób pożądane białko ulega przejściowej ekspresji w warunkach fizjologicznych, aż do całkowitego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ten projekt został sfinansowany przez Europejski Fundusz Społeczny w Badenii-Wirtembergii, Niemcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla komórkowa
DMEM, PAA o wysokiej zawartości glukozyE15-009
FBSLife Technologies10500
Penicylina/Streptomycyna PAAP11-010100x
L-glutamina PAAM11-004200 mM
DPBS bez wapnia i magnezu PAAE15-002
0,04% trypsyna / 0,03% EDTA PromocellC-41020
TNSPromocellC-41120Roztwór neutralizujący trypsynę, 0,05% inhibitor trypsyny w 0,1% komórkach BSA
HEK-293ATCCCRL-1573
Consumables
Płytki do hodowli tkankowych, 12-dołkowe Corning3512
Kolba do hodowli komórkowych (75 cm2) Corning430641
sterylne probówki do mikrowirówek 1,5 ml wolne od DNaz i RNaz Eppendorf0030 121.589Safe-Lock, Biopur
15 ml probówki stożkowe greiner bio-one188271
czyste i sterylne końcówki do pipet epT.I.P.S. z podwójnym filtrem Eppendorf10 & mikro; l: 022491202; 100 &mikro; l: 022491237; 1 000 i mikro; l: 022491253
Cryovialgreiner bio-one122279-128Cryo.s 
14 ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem do hodowli bakterii BD Falcon352059
Amplifikacja i oczyszczanie plazmidu
pcDNA 3.3_eGFP Plazmid Addgene26822
One Shot Top10 chemicznie składnik Escherichia coli InvitrogenC4040-10
Sterylna woda (Ampuwa)Fresenius Kabi1636071
LB medium (Luria/Miller) Carl RothX968.1Rozpuść 25 g L-1 w sterylnej wodzie.
Agar LB (Luria/Miller) Carl RothX969.1Rozpuścić 40 g L-1 w sterylnej wodzie.
Ampicylina Gotowy roztwórSigma AldrichA5354100 mg/ml 
GlycerolSigma AldrichG2025
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27104
mRNA
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen
QIAquick PCR Zestaw Qiagen28106
MEGAscript T7 Life TechnologiesAM1334
5-metylocytydyno-5&ostra;-trifosforan TrilinkN10145-metylo-CTP
Pseudourydyno-5&ostra;-trifosforan TrilinkN1019Pseudo-UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G Struktura kapu RNA analogowa New England BiolabsS1411L
Inhibitor RNazy RiboLockThermo ScientificEO038140 U/&mikro; l 
TURBO DNaseLife TechnologiesAM13342 U/&mikro; l (z zestawu MEGAscript T7)
Fosfataza antarktyczna Zestaw New England BiolabsMO289S
RNeasy mini Rozwiązanie Qiagen74104
RNaseZap Life TechnologiesAM9780
Transfekcja
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 Invitrogen11668-019Kationowy odczynnik do transfekcji lipidów
Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy Invitrogen11058-021Ulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej (FBS) 
Elektroforeza żelowa
AgaroseSigma-AldrichA9539
Żelowy barwnik żelowy z kwasem nukleinowymBiotium4100310 000x w wodzie 
peqGOLD Range Mix DNA-Drabinka Peqlab25-2210
Analizy cytometrii przepływowej
CellFIX (1x)BD Biosciences34018110x koncentrat 
Podkład do amplifikacji insertu i poli (T) tail PCR
Forward Primer (klasa HPLC) 10 µ MElla Biotech5´-TTGGACCCTCGTAC
AGAAGCTAATACG-3´
Podkład odwrotny (klasa HPLC) 10 i mikro; MElla Biotech5´- T120-CTTCCTACT
CAGGCTTTATTCAA
AGACCA-3´
Equipment
Cell inkubatorBinderCO2 (5%) i O2 (20%) 
Licznik komórek CASY Schä System
Sterylny stół warsztatowy BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Inkubator bakteryjny ScanDrop
Termocykler analityczny Jena
PCR Mikrowirówka Eppendorf
Eppendorf
Vortexpeqlab
ThermomixerEppendorf
Gel aparatura do elektroforezy Bio-Rad
Gel Bio-Rad
FACScan BD Biosciences
 firmy Nikon
 Zeiss
Zestaw do oczyszczania 202602 rfeSpektrofotometr do kąpieli wodnej Incutec System dokumentacji System Mikroskop fluorescencyjny Mikroskop z kontrastem fazowym

Bibliografia

  1. Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
  2. Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).
  3. Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
  4. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
  5. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
  6. Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
  7. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
  8. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
  9. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
  10. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
  11. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
  12. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
  13. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
  14. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza zmodyfikowanego mRNAtranskrypcja in vitrotransfekcja mRNAanaliza cytometrycznamikroskopia fluorescencyjnazwiększona ekspresja GFPkomórki HEK293amplifikacja plazmidutraktowanie fosfatazą antarktycznątransfekcja kompleksami lipidowymi
In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.