Method Article

Konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych

DOI:

10.3791/51949

⸱

November 9th, 2014

 ,  ,  , 
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej badanym aspektem biokompatybilności kompozytów dentystycznych jest ich cytotoksyczność, obrazowanie poklatkowe 3D CLSM w połączeniu z kwantyfikacją sygnału fluorescencyjnego pozwala na czułą ocenę losu komórki w czasie. Wykorzystanie tej metody może być skutecznym narzędziem do oceny cytokompatybilności kompozytów dentystycznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie przyjmuje się, że interakcja materiału komórkowego in vitro jest użytecznym kryterium w ocenie biokompatybilności materiału dentystycznego. Celem pracy było wykorzystanie poklatkowego obrazowania konfokalnego 3D CLSM do oceny biokompatybilności in vitro kompozytów dentystycznych. Metoda ta zapewnia dokładne i czułe wskazanie dawki żywotnych komórek w kontakcie z kompozytowymi ekstraktami dentystycznymi. Jako przykład podano ELS o bardzo niskim skurczu, kompozyt dentystyczny stosowany do bezpośredniej odbudowy. Ocenę in vitro przeprowadzono na hodowanych pierwotnych ludzkich komórkach fibroblastów dziąseł przy użyciu barwienia żywych/martwych. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego biologicznego odwróconego systemu FV10i i przeanalizowano za pomocą oprogramowania FV10-ASW 3.1. Analiza obrazu wykazała bardzo niewielką cytotoksyczność w obecności badanego kompozytu po upływie 5 godzin. Wykazano nieznaczny spadek żywotności komórek w kontakcie z badanymi ekstraktami kompozytowymi w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Wyniki podkreśliły zastosowanie obrazowania poklatkowego 3D CLSM jako czułej metody jakościowej i ilościowej oceny zachowania biokompatybilności kompozytów dentystycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych standardów cytowanych w zaleceniach ISO określających biokompatybilność jest brak toksyczności materiału dla komórek. Kompozyty dentystyczne na bazie żywicy mogą uwalniać składniki z matrycy żywicznej, co początkowo może być spowodowane częściową polimeryzacją i/lub później procesami degradacji w czasie1-4. Te uwolnione składniki wchodzą w kontakt z tkankami jamy ustnej i mogą mieć różne wady, takie jak reakcje pokrzywkowe i błony śluzowej5, rozwój reakcji alergicznych i nadwrażliwości u pacjentów6, modyfikacje morfologii fibroblastów dziąseł i redukcja białka kolagenu typu I7, immunosupresja lub immunostymulacja proliferacji oczyszczonych limfocytów T i komórek śledziony pod wpływem mitogenów8 oraz uszkodzenia DNA w pierwotnych ludzkich fibroblastach dziąseł, co podkreśla ich potencjał genotoksyczny9. Na toksyczność kompozytu dentystycznego może wpływać wiele parametrów, takich jak odcień kompozytu, utwardzanie światłem, skład chemiczny monomeru żywicy, wypełniacz i stopień konwersji10-13. Ponieważ potencjał toksyczny materiałów in vitro może przewidywać sytuacje in vivo i może być porównywany z sytuacjami klinicznymi poprzez badanie niektórych istotnych punktów końcowych. Cytotoksyczność kompozytów dentystycznych i ich składników została szeroko oceniona przy użyciu systemów hodowli komórkowych14-16.

Te systemy in vitro zostały opracowane do oceny biokompatybilności kompozytów dentystycznych pod względem: wzrostu komórek i apoptozy komórek przy użyciu monocytów THP-1, takich jak komórki17, cytotoksyczności w ludzkich fibroblastach dziąseł18, potencjału zapalnego w keratynocytach HaCaT, takich jak komórki2, funkcjonalności komórek MDPC-23 podobnych do odontoblastów19, zmniejszenie całkowitego poziomu RNA i znaczny wzrost indukcji apoptozy na ludzkich keratynocytach dziąseł20 oraz uszkodzeń DNA na komórkach fibroblastów dziąseł i miazgi21.

Sugerowane są różne metodologie badania biokompatybilności kompozytów dentystycznych. Testy kolorymetryczne, które obejmują określone barwniki i pomiary adsorpcji światła, pozostają najczęściej stosowane, ze względu na ich względną prostotę i niski koszt22-26. Analiza mikroskopowa za pomocą kontrastu światła często pochłania więcej czasu i wiąże się z wyższymi kosztami. Jednak te techniki mikroskopowe mają kilka ważnych zalet. Obserwacja struktury komórki dostarcza rozszerzonych informacji o doświadczanych skutkach toksycznych, dostarczając w ten sposób bardziej istotnych i wrażliwych danych. W szczególności wprowadzenie mikroskopii konfokalnej27 pozwoliło na obserwację struktur biologicznych z lepszą rozdzielczością osiową w porównaniu z tradycyjnymi mikroskopami fluorescencyjnymi do obrazowania szerokokątnego. W związku z tym obrazowanie konfokalne stało się potężnym narzędziem śledczym w różnych dziedzinach badań medycznych i naukowych. W przeciwieństwie do technik mikroskopii elektronicznej, skaningowa mikroskopia konfokalna oferuje możliwość wizualizacji odrębnych składników komórek poprzez włączenie określonych markerów fluorescencyjnych. Większość z tych specyficznych znaczników jest stabilna w środowisku wodnym, rozsądnie mierzalna, niedroga i nietoksyczna28, co pozwala na ich zastosowanie zarówno w klinicznych, jak i laboratoryjnych badaniach naukowych. Co więcej, suszenie i utrwalanie próbki wymagane do konwencjonalnej analizy mikroskopii elektronicznej nie jest konieczne do poklatkowego obrazowania konfokalnego, dlatego możliwe jest również pobieranie próbek w zależności od czasu. W porównaniu z obrazowaniem dwuwymiarowym, zasada obrazowania konfokalnego umożliwia wizualizację próbki pod powierzchnią i trójwymiarową rekonstrukcję struktury na podstawie różnych uzyskanych obrazów głębi; co skutkuje bardziej precyzyjnymi i bardziej strukturalnymi szczegółami29, 30. Niniejsze badanie wideo jest przykładem zastosowania trójwymiarowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej w trybie poklatkowym (3D-CLSM) w połączeniu z markerowaniem fluorescencyjnym żywym/martwym i kwantyfikacją sygnału jako innowacyjnej metody. Technika przedstawiona w tym artykule ma tę zaletę, że umożliwia czułą ocenę i obrazowanie poklatkowe żywych komórek bez zmiany ocenianej struktury komórki. Przed analizą konfokalną nie są wymagane żadne czynności przygotowawcze. Wcześniej to samo barwienie stosowano do oceny żywotności hodowanych rdzeni kości gąbczastej31, ale bez konfokalnego upływu czasu. Podobnie, tę samą poklatkową procedurę konfokalną zastosowano do oceny zabijania w czasie erytromycyny u bakterii osadu czynnego zgodnie z ich typem Grama32 przy użyciu specyficznego barwienia bakterii żywych/martwych. Metody te zostały niedawno zaadaptowane i wykorzystane do porównania toksyczności kompozytów dentystycznych na bazie monomerów metakrylanu11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół składa się z trzech głównych kroków: pierwszy krok obejmuje przygotowanie ekstraktu kompozytowego w pożywce hodowlanej; drugi dotyczy hodowli komórek pierwotnych ludzkich fibroblastów dziąsłowych (HGF), kontaktu komórek z ekstraktami kompozytowymi i barwienia komórek; trzeci krok składa się z obrazowania konfokalnego i analizy sygnału fluorescencyjnego. W przypadku pobierania tkanek dziąseł protokół został zatwierdzony zgodnie z francuskim ustawodawstwem, świadomą zgodą i lokalną komisją etyczną.

1. Przygotowanie ekstraktów kompozytowych

Użyj zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco jako medium elucyjnego. Upewnij się, że stosunek powierzchni próbek do objętości pożywki ekstrakcyjnej jest na najniższym poziomie wymagań normy ISO 10993/12. Procedura ta została niedawno opisana11 i pokrótce opisana poniżej:

  1. Uformuj kuliste próbki nieutwardzonego kompozytu dentystycznego za pomocą specjalnego uchwytu. Rozmiar uchwytu wynosi 2 mm promienia, co jest zgodne z ogólnie zalecaną głębokością utwardzania w doustnym leczeniu klinicznym.
  2. Przygotować studzienki na płytki, z których każda zawiera 1 ml pożywki hodowlanej (DMEM), z 5% mieszaniną penicyliny/streptomycyny i 1% amfoterycyny, ale bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  3. Utwardzać próbki w studzience zawierającej podłoże DMEM za pomocą lampy LED o intensywności 1,070 mW cm-2 (λ = 465-475 nm) przez 40 sekund. Upewnij się, że odległość między końcówką utwardzającą a próbkami mieści się w zakresie 0,5 mm. Użyj tego trybu utwardzania, aby zasymulować tymczasowy kontakt między zębem a nieutwardzonym kompozytem dentystycznym. W sytuacji klinicznej do kontaktu dochodzi w momencie umieszczenia kompozytu odtwórczego w jamie ustnej.
  4. Próbki inkubować (próbki złożone w pożywce DMEM) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w powietrzu. Inkubować pożywkę DMEM (bez próbek złożonych) dla komórek kontrolnych w tych samych warunkach.

2. Hodowla komórkowa HGF, testowanie ekstraktów kompozytowych i barwienie komórek

  1. Wzrost i utrzymanie kultur komórkowych
    Wyizoluj ludzkie fibroblasty dziąseł z biopsji zdrowej tkanki dziąsła pobranej od pacjentów podczas rutynowych ekstrakcji ortodontycznych.
    1. Hodować ludzkie fibroblasty dziąseł w DMEM w obecności 10% FBS, 5% penicyliny/streptomycyny i 1% amfoterycyny B. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w powietrzu.
    2. Zmieniano pożywkę co 3 dni, a komórki pasażowe co 5 dni. Po osiągnięciu konfluencji zbierz komórki przez trypsynizację.
    3. Odwirować komórki o sile 90 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w pożywce hodowlanej. Policz komórkę za pomocą ręcznego automatycznego licznika komórek z berłem.
    4. Zawiesina komórek nasiennych o gęstości komórek 2,5 x 104 komórki/ml w systemie szkiełek komorowych. Pozostawić komórki do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5%.
  2. Dodawanie ekstraktów złożonych do komórek w hodowli
    1. Zastąp pożywkę z dwóch dołków szkiełka komorowego 1 ml badanych ekstraktów kompozytowych (po 24 godzinach inkubacji).
    2. Utrzymuj dwie pozostałe studzienki (komórki kontrolne) w tych samych warunkach.
    3. Inkubować szkiełko komorowe zawierające cztery studzienki w temperaturze 37 °C w inkubatorze, w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w powietrzu.
  3. Barwienie fluorescencyjne
    Użyj barwienia cytotoksyczności Żywe/Martwe dla komórek eukariotycznych zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: zestaw zapewnia szybki dwukolorowy test fluorescencyjny w celu określenia żywotności komórek w populacji na podstawie integralności błony plazmatycznej i aktywności esterazy. Barwienie odróżnia żywe komórki od uszkodzonych poprzez jednoczesne znakowanie za pomocą zielonofluorescencyjnej Calceiny-AM w celu wskazania wewnątrzkomórkowej aktywności esterazy i homodimeru Ethidium-1 w kolorze czerwonej fluorescencji (EthD-1) w celu wskazania utraty integralności błony.
    1. Przygotować roztwór roboczy z dwóch odczynników barwiących zawierających 2 μM kalceiny AM i 4 μM EthD-1 (końcowe stężenie uznane za odpowiednie do barwienia fibroblastów). Dodaj barwnik do hodowanych komórek przylegających w obecności lub bez wybranych ekstraktów kompozytowych.
    2. Obserwuj bezpośrednio i szybko wybarwione populacje komórek przez co najmniej 15 minut po barwieniu i poprzez obrazowanie poklatkowe. Nie wirować i nie utrwalać poplamionych komórek.

3. Konfokalne obrazowanie poklatkowe i analiza sygnału

Używany system jest wyposażony w cztery lasery diodowe i wielokrotnie barwiony obraz dla maksymalnie czterech barwników fluorescencyjnych dla każdej próbki. System może wykonać obraz mapowania (powiększenie 10x), który daje przegląd próbki testowej, po której można się poruszać, aby obserwować obszar zainteresowania (powiększenie 600x).

  1. Obrazowanie poklatkowe
    1. Umieścić próbki (szkiełko komorowe zawierające barwione próbki) w ciemnym pomieszczeniu zintegrowanego inkubatora konfokalnego (37 °C, 5% CO2 i wilgotna atmosfera).
    2. Wybierz odpowiednie lasery. Użyj dwóch źródeł laserowych o długości fali 473 nm (15 mW) i 559 nm (18 mW) do wzbudzenia kalceiny i EthD-1.
    3. Użyj trybu dwóch sekwencji, aby uzyskać obrazy za pomocą sekwencji liniowych bez przesłuchów w obrazowaniu za pomocą dwóch użytych barwników fluorescencyjnych.
    4. Użyj detektora z nowo opracowanym widmem, aby automatycznie ustawić warunki zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym w jednostce skanującej.
    5. Zoptymalizuj maksymalne szerokości pasma wykrytej fluorescencji dla każdego kanału. Rejestruj wszystkie przejęcia sekwencyjnie, aby uniknąć potencjalnych przesłuchów.
    6. Wybierz najbardziej odpowiednie warunki obrazowania w oparciu o wybór barwnika fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania do akwizycji.
    7. Uzyskaj obraz mapy, który jest automatycznie tworzony od środka w spiralny wzór, a obszar zainteresowania można łatwo wybrać do dokładniejszego zbadania.
    8. Wybierz tryb obserwacji. W razie potrzeby wybierz do pięciu typów trybów obserwacji, w tym poklatkowy, Z-stack i wieloobszarowy. Użyj kombinacji trybów Z-stack i time-lapse w niniejszym badaniu i szybko zakończ przechwytywanie obrazu,
    9. Zmień i zmień barwnik fluorescencyjny. Alternatywnie, nałóż na siebie obrazy fluorescencyjne i kontrastujące ze światłem. Obserwuj obraz na żywo za pomocą wybranego punktu po lewej stronie dolnego ekranu mapy.
    10. Określ obszar obrazowania za pomocą funkcji kadrowania i powiększania. Opcjonalnie przełączaj się między wyświetlaczami dla każdego rodzaju barwnika fluorescencyjnego.
      UWAGA: Mikroskop używany w tym protokole ma taką samą funkcjonalność jak konwencjonalny mikroskop konfokalny o wysokiej wydajności, ale w kompaktowej obudowie. Mikroskop jest wyposażony w odwrócone obiektywy zanurzone w wodzie, które są optymalnie przystosowane do stabilnego obrazowania poklatkowego żywych komórek za pomocą uproszczonego wbudowanego inkubatora.
  2. Analiza i kwantyfikacja sygnałów
    1. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo sygnał fluorescencji. Uzyskaj pięć obrazów map z obiektywem 10X zarówno dla badanej próbki, jak i kontroli komórki.
    2. Uzyskano obrazy regularne o rozdzielczości od 1 024 × 1 024 pikseli do 0,231 μm × 0,231 μm. Przechowuj obrazy w formacie Olympus Image Format (OIF) w celu analizy sygnału. Ten format umożliwia przechowywanie różnych ustawień parametrów i obrazów razem. Korzystaj z różnych narzędzi analitycznych (pomiar profilu natężenia, stosunek intensywności między dwoma używanymi kanałami).
    3. Obrazy projekcji maksymalnej można przechowywać w plikach TIFF o wielkości 12 bitów/piksel.
    4. Wykonywanie analiz statystycznych za pomocą oprogramowania R commander. Analizuj różnice za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z testem powtórzeń. Podaj wyniki jako średnie odchylenie standardowe (±SD) i istotność statystyczną na poziomie p<0,05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazał przegląd żywych/martwych barwionych komórek na uzyskanych obrazach mapowania (obiektyw 10X) zarówno dla komórek kontrolnych, jak i wystawionych na działanie badanych ekstraktów kompozytowych (ELS bardzo niski skurcz). Trójwymiarową strukturę komórek można było uwidocznić w powiększeniu 600X. Wizualizację komórek pobranych w komorze kontrolnej oraz komórek pobranych w komorze w obecności badanych ekstraktów kompozytowych przedstawiono na rysunku 2. Projekcja maksymalna (obiektyw 60X) pokazuje losy wybranych populacji komórek na początku okresu poklatkowego (po 15 minutach) i na końcu okresu poklatkowego (po 5 godzinach). W tym okresie uzyskano pięćdziesiąt siedem stosów obrazów (xyzt mod scan, 39 obrazów na stos, głębokość woksela 1,00 μm). W naświetlonych komórkach uzyskano niewielki spadek sygnału zielonej fluorescencji i bardzo niewielką zmienność czerwonej fluorescencji. Nie zaobserwowano istotnej zmienności dla komórek kontrolnych. Ekstrakty kompozytowe eksponowane komórki przyjęły podobną morfologię wrzeciona jak komórki kontrolne; W tych warunkach doświadczalnych morfologia nie uległa zmianie (pomimo spadku sygnału zielonego i wzrostu sygnału czerwonego w obecności badanego kompozytu). Analizę obrazu przeprowadzono na pięciu wybranych różnych stosach obrazów odpowiadających różnym populacjom komórek z uzyskanych obrazów dla badanego kompozytu w porównaniu z komórkami kontroli ujemnej zarówno dla sygnału zielonego, jak i czerwonego. Profil intensywności barwionych komórek zilustrowano na rysunku 3; Ewolucja zielonego i czerwonego sygnału komórek mających kontakt z badanym kompozytem była porównywalna do ewolucji komórek kontrolnych. Intensywność emisji fluorescencji kalceiny i EthD-1 mierzono na komórkach kontrolnych i na komórkach złożonych z ekspozycji. Pomiar wykonywano w odstępach godzinnych przez okres do pięciu godzin. Współczynnik fluorescencji zielonej/czerwonej (na podstawie zintegrowanych intensywności sygnałów koloru zielonego 495-515 nm i czerwonego 620-650 nm) obliczono w okresie poklatkowym. Współczynniki żywotności dla komórek kontrolnych i narażonych na działanie ekstraktów ELS o bardzo niskim skurczu przedstawiono w Table 1. W obecności badanego kompozytu stwierdzono, że odsetek żywych komórek nieznacznie zmniejszył się ze 100% do 93,9% po 1 godzinie kontaktu. Istotną różnicę zaobserwowano pomiędzy badanym kompozytem a kontrolą ujemną (komórki bez ekstraktów kompozytowych) po 5 godzinach wskazanego okresu poklatkowego.

figure-results-1
Rycina 1: Przegląd obrazu mapowania pokazał wybarwione komórki w obiektywie 10X, (A) komórki kontrolne i (B) komórki w obecności ekstraktów kompozytowych (ELS bardzo niski skurcz) na początku okresu upływu czasu (t = 15 min). Zielone obszary to żywe komórki, a czerwone to uszkodzone komórki. W warunkach tego eksperymentu nie zaobserwowano zmienności (zarówno dla fluorescencji zielonej, jak i czerwonej) dla komórek narażonych na działanie kompozytów w porównaniu z komórkami kontroli ujemnej.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazy CLSM przy obiektywie 60X populacji komórek z (A) komory kontrolnej i (B) komory ekstrakcyjnej kompozytu na początku i na końcu okresu naświetlania poklatkowego (odpowiednio: 15 minut i II: 5 godzin). Zielone obszary to żywe komórki, a czerwone to uszkodzone komórki. Panel obrazów wykazał nieznaczną zmianę natężenia sygnału (nieznaczny spadek sygnału zielonego i bardzo nieznaczny wzrost sygnału czerwonego). Nie zaobserwowano zmian morfologii komórek w obecności ekstraktów złożonych; Komórki EXPOSE zachowały swoją wrzecionowatą i fibroblastyczną morfologię jako komórki kontrolne.

figure-results-3
Rycina 3: Profil liniowy komórek obserwowany w mikroskopii poklatkowej. (A) Komórki kontrolne, (B) Kompozyt ekstrahuje naświetlone komórki, (I) po 15 minutach i (II) po 5 godzinach. Brak widocznych zmian w ewolucji sygnału zielonego w obecności badanego kompozytu niezależnie od kontaktu czasowego. Jednak nieznaczny wzrost sygnału czerwonego zaobserwowano w obecności kompozytu po 5 godzinach kontaktu.

szt. szt. szt. szt. szt.
Czas kontaktu (godzina)Żywotność komórek (%)
1cyfra arabska345
Komórki kontrolne100100100100100
ELS bardzo niski skurcz®93,9 ±791,3±5*89,5±3*87,6±2*87,7±3*

Tabela 1: Szybkość ewolucji żywych komórek HGF po 1, 2, 3, 4 i 5 godzinach kontaktu z ekstraktami kompozytowymi. Żywotność komórek oceniano przez barwienie przy użyciu zestawu do cytotoksyczności żywej/martwej. Dane pokazują średnie wartości ± SD z analizy pięciu stosów obrazów. Wartości znacznie różnią się od komórek kontrolnych przy p <0,05.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie materiału biokompatybilności jest najbardziej wymaganym parametrem, który należy ocenić przed użyciem medycznym. Normy międzynarodowe obejmują wyroby medyczne ISO 1099333, a w szczególności materiały dentystyczne ISO 740534. Brak toksycznego wpływu na otaczające komórki jest kluczową normą w ocenie biokompatybilności takich materiałów. Dlatego tak duże znaczenie w ocenie biokompatybilności materiału stomatologicznegoma badanie cytotoksyczności 35-37. ISO zasugerowało, że metody testowania mogą opierać się na aktywności metabolicznej lub integralności błony. Wybrane punkty końcowe powinny spełniać określone warunki klasyfikacji działań niepożądanych wywołanych przez badany materiał w celu zminimalizowania czasu i kosztów testów oceniających. Obecna metoda badania (konfokalne obrazowanie poklatkowe 3D) opiera się na integralności membrany. Ocena cytotoksyczności za pomocą tego punktu końcowego wydaje się być cennym markerem biokompatybilności komórek z badanymi materiałami, a także jest to punkt końcowy zatwierdzony przez ISO. Testy in vitro mają na celu określenie, w jaki sposób próbka materiału wpływa na określony typ komórki. Kolorymetryczny test MTT został pierwotnie opisany przez Mossmana (1983) jako użyteczna metoda pomiaru cytotoksyczności in vitro i proliferacji komórek. Test MTT opiera się na przemianie soli tetrazolowej w kryształy formazanu przez aktywne komórki, co determinuje aktywność mitochondriów. Można to przełożyć na wskaźnik rentowności38. Gupta i współpracownicy poinformowali, że test MTT jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru cytotoksyczności żywic kompozytowych. W tym samym celu zastosowano również dehydrogenazę bursztynową i fosfatazę alkaliczną39. Jednak komórki losu nie mogą być monitorowane, ponieważ test MTT wymaga zabicia komórek w każdym punkcie czasowym pomiaru. W celu dokładniejszego monitorowania zachowania barwionych komórek w obecnym badaniu, przeprowadzono bezpośrednią obserwację żywych komórek, dzięki poklatkowemu obrazowaniu CLSM połączonemu z barwieniem krótkim protokołem, automatyczną analizą obrazu i kwantyfikacją sygnału fluorescencyjnego.

Kompozyty dentystyczne mają bliski kontakt z tkankami jamy ustnej, zwłaszcza z komórkami dziąseł i miazgi miazgowej. Fibroblasty byłyby celem składników uwalnianych z tych kompozytów odtwórczych40-41. Co więcej, kilka badań wykazało, że unieśmiertelnione komórki i komórki pierwotne mogą mieć różne reakcje komórkowe w kontakcie z biomateriałami. Stwierdzono, że komórki pierwotne są bardziej odpowiednie do oceny wpływu biomateriałów42. Wyjaśnia to zastosowanie pierwotnych ludzkich komórek fibroblastów dziąseł jako modelu komórkowego do oceny cytotoksyczności badanego kompozytu dentystycznego w obecnym badaniu. Potencjał toksyczności substancji uwalnianych z kompozytu dentystycznego został szeroko przebadany43-44. W celu oceny potencjału cytotoksycznego materiałów można było przeprowadzić badania na dwóch modelowych komórkach kontaktowych. W systemie modelu bezpośredniego kontaktu materiał jest umieszczany bezpośrednio z komórkami docelowymi, podczas gdy w systemie kontaktu pośredniego komórki docelowe mają kontakt z elucjami z pożywek biologicznych. W zastosowaniach klinicznych i zabiegach odtwórczych kompozyty dentystyczne są umieszczane w pośrednim kontakcie z tkankami dziąseł. Z tego powodu obecny protokół eksperymentalny koncentrował się na systemie pośredniego kontaktu z ludzkimi fibroblastami dziąseł (komórkami w obecności badanych ekstraktów kompozytowych). Jak wcześniej informowali Dahl i współpracownicy, reakcje cytotoksyczne zostały sklasyfikowane jako ciężkie (<30%), umiarkowane (30-60%), lekkie (60-90%) lub niecytotoksyczne (>90%) w oparciu o aktywność w stosunku do wartości uzyskanych dla kontrolnych45. W związku z tym, zgodnie z tym rankingiem i w świetle uzyskanych wyników (tabela 1), kompozytowy ELS o bardzo niskim skurczu mógł być klasyfikowany jako bardzo nieznacznie cytotoksyczny i wykazywał porównywalne zachowanie do komórek kontrolnych przez cały okres upływu czasu. Stosując dokładnie tę samą metodę badawczą, wyniki tego badania można porównać z wynikami niedawno opublikowanego badania. Kompozyt ELS o bardzo niskim skurczu wykazał lepszą biokompatybilność w porównaniu z dwoma wcześniej testowanymi kompozytami stosowanymi do tego samego zastosowania klinicznego, czyli do odbudowy bezpośredniej11. Nadal potrzebne są dalsze badania, aby dokonać pełniejszego porównania.

Przy podejmowaniu decyzji, który test cytotoksyczności zatwierdzić do konkretnej oceny punktu końcowego, ważne jest, aby zrozumieć zalety i ograniczenia każdego testu. Głównym celem obrazowania konfokalnego jest uzyskanie trójwymiarowej architektury komórek i narządów. Technika jest w stanie odsłonić nie tylko powierzchnię okazu, ale także jego podpowierzchnię. Opisany w niniejszym dokumencie protokół podkreśla zastosowanie poklatkowego obrazowania konfokalnego 3D CLSM jako czułej metody oceny zachowania kompozytu dentystycznego w zakresie biokompatybilności in vitro. Jednakże, aby uniknąć ograniczeń napotkanych w tej pracy, można zastosować stacje robocze z powłoką antywibracyjną, aby umożliwić bardziej stabilne i dłuższe obrazowanie poklatkowe; Blat stołu może izolować zastosowany system konfokalny od szkodliwych skutków, jakie mogą powodować wibracje w laboratorium. Ponadto materiały przeznaczone do stosowania w jamie ustnej powinny być w idealnym przypadku nieszkodliwe dla tkanek dziąseł i nie powinny zawierać żadnych substancji, które mogłyby powodować toksyczność ogólnoustrojową. Zgodnie z zastosowaną metodyką i wynikami uzyskanymi z obecnego badania można stwierdzić, że badany kompozyt (ELS o bardzo niskim skurczu) nie jest cytotoksyczny w obecnych warunkach doświadczalnych. Z uwagi na to, że metoda CLSM może z dużą czułością określić początkową liczbę komórek zdolnych do życia, można przewidzieć inne możliwości oceny większej liczby punktów końcowych. W szczególności, ponieważ niedawno doniesiono, że monomery kompozytowe wpływają na komórki poprzez reaktywne formy tlenu (ROS)46-48, potrzebne są dalsze badania w celu oceny ewentualnych korelacji między sieciami sygnalizacji cytotoksyczności a produkcją ROS. Przyszły protokół może zostać zaprojektowany do jednoczesnej oceny produkcji ROS (barwienieH2O2i/lubO2-) oraz współczynnika cytotoksyczności (barwienie żywe/martwe) przy użyciu poklatkowego obrazowania CLSM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych, nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firmy Saremco Dental Switzerland i Olympus Microsystems France są wdzięczne za wsparcie finansowe. Firma Saremco Dental jest również znana z hojnego przekazywania kompozytów dentystycznych ELS o bardzo niskim skurczu. Autorzy pragną również wyrazić swoje uznanie dla dr Simona Banksa z Wydziału Chemii (University College London) za jego pomoc w powtórce języka angielskiego.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Olympus Fluoview FV10i Mikroskop konfokalnyOlympus
O2/CO2 InkubatorPnasonicMCO 5MZestaw do inkubacji żywych
/martwychkomórek Invitrogen MP 03224Bejca 
ELS bardzo niski skurcz  Saremco Kompozyt dentystyczny
DMEM mediumSigmaD 6046Pożywka
hodowlana TrypsinSigmaT1426komory komórek zbierających
   PAA14220040XKomora hodowlana
penicylina/streptomycyna PAAP11-010Posiew komórkowy
Amfoterycyna BPAAP11-001Hodowla komórkowa
Surowica bydlęca płodu PAAA11-101Licznik komórek do hodowli
komórkowychMerck Millipore00110230TP1Zliczanie komórek 
system prowadnic

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22(2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Time Lapse ImagingDental Composite BiocompatibilityHuman Gingival FibroblastsLive Dead Staining3D CLSM ImagingCytotoxicity AssessmentFluorescent Signal AnalysisCell Viability MeasurementComposite Extract PreparationMaximal Projection Images

Related Articles