Ten film pokazuje, jak nabyć hemodynamikę układu i wątroby u myszy. Całe monitorowanie obejmuje rejestrację parametrów życiowych, ogólnoustrojowego ciśnienia krwi, centralnego ciśnienia żylnego, szybkości przepływu w tętnicy wątrobowej wspólnej i ciśnienia w żyle wrotnej, a także szybkości przepływu wrotnego u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie parametrów hemodynamicznych układu układowego i wątroby u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie modeli mysich w badaniach eksperymentalnych ma ogromne znaczenie dla badania fizjologii wątroby i zaburzeń patofizjologicznych. Jednak ze względu na mały rozmiar myszy rzadko opisywano szczegóły techniczne procedury monitorowania śródoperacyjnego odpowiedniej dla myszy. Wcześniej informowaliśmy o procedurze monitorowania w celu uzyskania parametrów hemodynamicznych dla szczurów. Teraz dostosowaliśmy procedurę, aby uzyskać parametry hemodynamiczne ogólnoustrojowe i wątrobowe u myszy, gatunku dziesięciokrotnie mniejszego niż szczury. Film ten demonstruje oprzyrządowanie zwierząt, a także proces pozyskiwania danych potrzebnych do oceny hemodynamiki układowej i wątrobowej u myszy. Parametry życiowe, w tym temperatura ciała, częstość oddechów i tętno, były rejestrowane przez cały czas trwania zabiegu. Ogólnoustrojowe parametry hemodynamiczne obejmują ciśnienie w tętnicy szyjnej (CAP) i centralne ciśnienie żylne (CVP). Parametry perfuzji wątrobowej obejmują ciśnienie w żyle wrotnej (PVP), szybkość przepływu wrotnego, a także szybkość przepływu w tętnicy wątrobowej wspólnej (tabela 1). Oprzyrządowanie i akwizycja danych w celu zarejestrowania normalnych wartości została zakończona w ciągu 1,5 godziny. Podczas tej procedury parametry hemodynamiczne ogólnoustrojowe i wątrobowe pozostawały w prawidłowych zakresach.
Ta procedura jest trudna, ale wykonalna. Zastosowaliśmy już tę procedurę do oceny hemodynamiki wątroby u normalnych myszy, a także podczas 70% częściowej hepatektomii i w eksperymentach z zaciskaniem płata wątroby. Średnie PVP po resekcji (n= 20) wynosiło 11,41±2,94cmH2O, czyli było istotnie wyższe (P<0,05) niż przed resekcją (6,87±2,39cmH2O). Wyniki eksperymentu z zaciskaniem płata wątroby wykazały, że ta procedura monitorowania jest czuła i odpowiednia do wykrywania niewielkich zmian ciśnienia wrotnego i natężenia przepływu wrotnego. Podsumowując, procedura ta jest niezawodna w rękach doświadczonego mikrochirurga, ale powinna być ograniczona do eksperymentów, w których myszy są absolutnie potrzebne.
Wprowadzenie
Ogólnym celem tego filmu było zademonstrowanie procedury monitorowania w czasie rzeczywistym w celu uzyskania parametrów hemodynamicznych układu i wątroby. Uzasadnieniem dla opracowania tej procedury jest jej ogromna wartość dla interwencji eksperymentalnych u myszy, które wymagają uzyskania parametrów hemodynamicznych ogólnoustrojowych i wątrobowych. Procedura może być stosowana u zwierząt nieleczonych oraz w trakcie lub po danej eksperymentalnej interwencji chirurgicznej wątroby i dróg żółciowych, takiej jak częściowa hepatektomia, podwiązanie żyły wrotnej i przeszczepienie wątroby.
Pozyskiwanie danych hemodynamicznych wątroby u gryzoni wymaga proponowanej procedury inwazyjnej. Perfuzji wątroby nie można uzyskać nieinwazyjnie. Istnieją jednak alternatywy dla uzyskania ogólnoustrojowego ciśnienia krwi. Techniki monitorowania, takie jak technika mankietu ogonowego8, zostały wykorzystane do pomiaru ciśnienia krwi zarówno u szczurów, jak i myszy. Technika mankietu ogonowego może być stosowana u zwierząt przytomnych. Podczas pomiaru ciśnienia krwi zwierzę należy umieścić i ustawić w określonej niewygodnej pozycji. W instrukcji urządzenia do mankietu na ogon producent podaje, że myszy mogą stać się nerwowe i zestresowane, co może zmniejszyć krążenie w ogonie. W takich okolicznościach obwodowe ciśnienie krwi nabyte w ogonie może być znacznie niższe niż centralne ciśnienie krwi.
Pełna procedura monitorowania została przeprowadzona za pomocą zintegrowanego wielokanałowego monitora wykorzystującego szereg czujników do akwizycji danych. Ciśnienie krwi uzyskano poprzez wprowadzenie cewnika do odpowiedniego naczynia po starannym wypreparowaniu mikrochirurgicznym i naświetleniu pod mikroskopem. Natężenie przepływu mierzono poprzez umieszczenie sondy przepływu transsonicznego wokół każdego zbiornika.
Już opisaliśmy podobną procedurę śródoperacyjnego monitorowania dla szczurów, co zaowocowało obszerną serią fizjologicznych danych hemodynamicznych porównywalnych z pojedynczymi danymi zgłoszonymi z innych grup7. Dlatego uznaliśmy, że ta procedura stanowi dobrą podstawę do przystosowania go do myszy, gatunku 10-krotnie mniejszego od szczura. Kluczową różnicą w stosunku do procedury na szczurach jest użycie cewników Millar do pozyskiwania danych dotyczących ciśnienia krwi zamiast systemu cewników opartych na płynie. Dane o przepływie uzyskano również za pomocą sond przepływu transsonicznego, tyle że znacznie mniejszych niż w przypadku odpowiednich statków dla szczurów.
Ze względu na mały rozmiar zwierzęcia, oprzyrządowanie myszy jest technicznie trudne, ale wykonalne. Po zakończeniu oprzyrządowania akwizycja danych i analiza podstawowych danych dotyczących żywotności jest prosta, ponieważ można użyć wstępnie zdefiniowanego pliku ustawień. Plik ustawień musi być zdefiniowany raz na początku serii eksperymentów i może być przechowywany i używany we wszystkich kolejnych eksperymentach.
Do tej pory stosowaliśmy tę procedurę do oceny efektów hemodynamicznych wątroby w ostrych eksperymentach. Mierzyliśmy CAP i PVP przed i bezpośrednio po 70% częściowej hepatektomii (PH) oraz w eksperymentach z zaciskaniem/odzaciskaniem. Zacisnęliśmy więzadło wątrobowo-dwunastnicze prawego płata stanowiącego 20% masy wątroby, a następnie nastąpiło krótkie (5 minut) zaciśnięcie środkowego i lewego płata bocznego reprezentującego łącznie 90% masy wątroby. Odzaciskanie rozpoczęło się od zwolnienia zacisku z prawego płata, a następnie uwolnienia środkowego i lewego płata bocznego. Maksymalny czas zaciskania wynosił poniżej 10 min.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pomieszczenia i wszystkie przeprowadzone procedury były zgodne z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt.
1. Kalibracja czujników (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi kalibracji czujników)
1.1) Kalibracja cewnika Millar. Zanurz końcówkę cewnika w sterylnej wodzie lub soli fizjologicznej na 30 minut przed wyważeniem (wyzerowaniem) i kalibracją.
- Podłącz czujnik Millar do kanału millar1 mostka amplifier i włóż końcówkę czujnika Millar do słupa wody.
- Ustaw wartość słupa wody na 0 cmH2O. W oknie programu do analizy danych wybierz bridge amplify i wyzeruj go. Można ustawić wartość bazową 0 cmH2O.
- Ustaw wartość słupa wody na 20 cmH2O. Uruchom postęp okna oprogramowania do analizy danych i zatrzymaj się. Wybierz "jednostki" w oknie wzmocnienia mostka, ustaw odpowiednio linię bazową 0 i 20 cmH2O. Ustaw "jednostkę" na cmH2O.
- Skalibruj millar2 do pomiaru CAP w ten sam sposób (ustaw dwie linie bazowe 90 i 110 cmH2O).
1.2) Kalibracja sondy przepływu krwi
- Umieść sondę w wodzie dejonizowanej. Połącz sondę z systemem sondy przepływu transsonicznego.
- W oknie oprogramowania do analizy danych wybierz opcję Input amplify (Wzmocnienie wejściowe), aby wyzerować sondę przepływu. Dostosuj jednostki.
- Naciśnij przycisk, aby "przetestować kanał", aby odebrać sygnał: jeśli sygnał ma 3-4 kreski, oznacza to, że sygnał jest dobry. W przypadku uzyskania dobrego sygnału, procedura może być kontynuowana.
- Naciśnij przycisk, aby "kanał zerowy" i przeskalować kanał, aby sprawdzić, czy wartość została skalibrowana, czy nie.
- Naciśnij przycisk, aby "zmierzyć kanał" w celu późniejszego pomiaru.
2. Przygotuj mysz do zabiegu chirurgicznego
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczul ją 2% izofluranem i 0,3 ml/min tlenu. Operację można wykonać, jeśli u myszy nie ma odruchu wycofywania się z palca u stóp.
- Ogol futro w obszarach chirurgicznych, w tym na lewej szyi i brzuchu.
- Umieść mysz na stole operacyjnym i przymocuj ją za pomocą taśm. Stosuj maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w okresie operacji.
- Umieść poduszkę z gazy pod szyją, aby uzyskać optymalną ekspozycję pola operacyjnego szyi.
- Zdezynfekuj pole operacyjne i umieść wysterylizowane gazy, aby przykryć mysz, pozostawiając otwarte pole operacyjne.
3. Pomiar parametrów życiowych
- Włóż igły EKG podskórnie do łapek myszy.
- Umieść czujnik oddechowy pod tylną częścią myszy.
- Umieść sondę temperatury w odbytnicy myszy.
- Rejestruj temperaturę, EKG i częstość oddechów myszy w oprogramowaniu do analizy danych.
4. Operacja szyi w celu ogólnoustrojowego monitorowania układu krążenia
4.1) Rozwarstwienie naczynia
- Zidentyfikuj środkową linię szyi, środkowy punkt obojczyka, kąt żuchwy.
- Wykonaj 2 cm podłużne nacięcie od kąta żuchwy do środkowego punktu obojczyka, który znajduje się 0,5 cm po lewej stronie linii środkowej.
- Wypreparuj gruczoł podżuchwowy, odwróć go i przykryj gazą nasączoną solą fizjologiczną.
- Zidentyfikuj żyłę szyjną, wypreparuj ją i umieść trzy jedwabne szwy 6-0 pod żyłą w celu późniejszego podwiązania i utrwalenia.
- Zidentyfikuj mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, oddziel go od górnego brzucha omohyoida i tylnego brzucha mięśnia dwubrzuścowego i pociągnij go za pomocą retraktora, aby ułatwić odsłonięcie tętnicy szyjnej.
- Wypreparuj tętnicę szyjną i umieść trzy jedwabne szwy 6-0 pod tętnicą w celu późniejszego podwiązania i unieruchomienia.
4.2) Pomiar przepływu krwi w tętnicy szyjnej
- Umieść sondę transsoniczną wokół tętnicy szyjnej, utrzymuj ją stabilnie i zoptymalizuj kontakt za pomocą żelu ultradźwiękowego lub soli fizjologicznej.
- Rejestruj prędkość przepływu krwi w tętnicy szyjnej zgodnie z informacją wyświetlaną na małym ekranie urządzenia transsonicznego za pomocą oprogramowania do analizy danych
- Wyjmij sondę po zakończeniu pomiaru
4.3) Pomiar ciśnienia w tętnicy szyjnej (CAP)
- Podwiązać dystalny koniec tętnicy szyjnej i zacisnąć jej bliższy koniec.
- Umieść 2 szwy mocujące wokół tętnicy szyjnej. Użyj 10-0 prolenu do szwu podtrzymującego.
- Wykonaj małe nacięcie na przedniej ścianie naczynia.
- Włóż cewnik millar i przymocuj go za pomocą wstępnie założonych szwów.
- Rejestruj CAP w oprogramowaniu do analizy danych.
4.4) Pomiar przepływu krwi w żyle szyjnej
- Podnieś żyłę szyjną i umieść sondę przepływu transsonicznego, aby zmierzyć natężenie przepływu.
- Rejestruj natężenie przepływu w oprogramowaniu do analizy danych.
4.5) Pomiar centralnego ciśnienia żylnego (CVP)
- Zacisnąć bliższy koniec żyły szyjnej i podwiązać dystalny koniec.
- Wytnij małe nacięcie za pomocą mikronożyczek na przedniej ścianie naczynia.
- Włóż cewnik wypełniony płynem i przymocuj go za pomocą wstępnie założonych linii szwów.
- Zapisz CVP w oprogramowaniu do analizy danych.
5. Operacja jamy brzusznej w celu nabycia hemodynamiki wątroby
5.1) Identyfikacja statku
- Wykonaj poprzeczne nacięcie na brzuchu.
- Przełóż jelita na lewą stronę i przykryj mokrą gazą.
- Zidentyfikuj żyłę główną dolną, żyłę wrotną, wspólną tętnicę wątrobową i właściwą tętnicę wątrobową.
- Wlewaj trochę ciepłej soli fizjologicznej do jamy brzusznej i na powierzchnię jelit co 5 minut podczas całej procedury monitorowania.
5.2) Pomiar przepływu krwi przy portalu
- Przeciąć żyłę wrotną.
- Umieść jedwab 6-0 pod żyłą portalową, aby ułatwić podnoszenie naczynia podczas umieszczania sondy przepływu.
- Umieść sondę przepływu transsonicznego wokół żyły wrotnej i zmierz jej szybkość przepływu krwi.
- Zapisz szybkość przepływu krwi w żyle wrotnej.
5.3) Pomiar przepływu w tętnicy wątrobowej
- Ostrożnie przeciąć wspólną tętnicę wątrobową.
- Umieść jeden jedwabny szew 6-0 wokół naczynia, aby ułatwić podnoszenie naczynia.
- Umieść sondę przepływu wokół tętnicy.
- Zmierz jego przepływ krwi i uzyskaj dane.
5.4) Pomiar ciśnienia w żyle wrotnej (PVP)
- Wybierz jedną odnogę żyły krezkowej z kilkoma bocznymi odgałęzieniami, która spływa prosto do żyły wrotnej.
- Podwiązać dystalny koniec wybranej żyły krezkowej. Upewnij się, że podwiązanie znajduje się blisko rurki jelitowej. Liguj jego małe gałęzie
- Umieść 2 szwy mocujące za pomocą 6-0 prolenu wokół żyły. Kluczowym punktem tej procedury jest unikanie dotykania tętnicy krezkowej podczas podwiązywania żyły.
- Zacisnąć proksymalny koniec żyły wrotnej.
- Umieść 2 szwy rozciągowe za pomocą 10-0 prolenu. Wystąpi pewne krwawienie, ponieważ szew podtrzymujący powinien przenikać przez ścianę naczyniową cienkiej żyły krezkowej.
- Wykonaj małe nacięcie na żyle za pomocą mikronożyczek ukośnie pod kątem 45 stopni.
- Włóż cewnik Millar przez żyłę krezkową do żyły wrotnej i zamocuj go
- Zapisz ciśnienie w żyle wrotnej. Pod koniec zabiegu poświęć myszy przez wykrwawienie w znieczuleniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Parametry życiowe myszy, takie jak częstość oddychania i częstość akcji serca, są ewidentnie znacznie wyższe niż u szczura. Średnie systemowe ciśnienie tętnicze oraz ciśnienie w żyle szyjnej są zbliżone do wartości u szczura, a nawet do danych u ludzi.
Dane hemodynamiczne wątroby są wyraźnie odmienne. Uzyskano prawidłowe wartości od 8 myszy. Przepływ krwi w żyłach wrotnych u prawidłowych myszy mieścił się w zakresie od 1,6 do 2,3 ml/min. Przepływ w wspólnej tętnicy wątrobowej wynosił od 0,10 d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Monitorowanie hemodynamiki wątroby jest ważnym narzędziem badawczym w hepatologii i chirurgii wątroby i dróg żółciowych. Pozyskanie danych hemodynamicznych wątroby pomaga scharakteryzować wpływ zabiegów wątrobowo-żółciowych na układ krążenia. Pozyskiwanie danych hemodynamicznych wątroby jest również potrzebne do zbadania wpływu leków na ciśnienie wrotne i przepływ wrotny, np. co jest potrzebne w badaniach oceniających leki wazoaktywne.
Pomimo niewielkich rozmiarów, parametry życiowe, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF) finansowane przez "Wirtualną Sieć Wątroby". Chciałbym podziękować Frankowi Schubertowi i René Gumpertowi z centrum medialnego Szpitala Uniwersyteckiego w Jenie za ich pomoc w produkcji filmu i stworzenia animacji oraz Isabel Jank za nagranie dźwięku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PowerLab 16/30 | ADInstruments | PL3516 | |
| Quad Bridge Amp | ADInstruments | FE224 | Wzmacniacz mostkowy |
| Animal Bio Amp | ADInstruments | FE136 | |
| Elektrody igłowe do FE136 (3 szt.) | ADInstruments | MLA1213 | |
| modułu przepływomierza okołonaczyniowego | Transonic | TS420 | |
| Flowprobe MA0.5PSB/MA1PSB | Transonic | MA0.5PSB/MA1PSB | |
| SPR-1000 Cewnik ciśnieniowy dla myszy | Millar instruments | 841-0001 | |
| Cewnik wypełniony płynem | Terumo | SR+DU2619PX | 26G, 0,64 razy; Mikronożyczki 19mm |
| F· S· L | nr 14058-09 | ||
| mikro serrefine | F· S· L | No.18055-05 | |
| Aplikator mikrozacisków | F· S· L | nr 18057-14 | |
| Mikrokleszczyki proste | F· S· L | nr 00632-11 | |
| Zakrzywione mikrokleszczyki | F· S· L | nr 00649-11 | |
| uchwyt igły | F· S· L | nr 12061-01 | |
| 6-0 jedwab | ethicon | ||
| 6-0 prolene | ethicon | ||
| 7-0 prolene | ethicon | ||
| 10-0 prolene | ethicon | ||
| Urządzenie do odcinania ogona | Kent Scientific | www.kentscientific.com | |
| LabChart7 | ADInstruments | dane oprogramowanie analityczne |
Bibliografia
- Albuszies, G., et al. Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. Crit Care Med. 33 (10), 2332-2338 (2005).
- Bernhard, W., et al. Phosphatidylcholine molecular species in lung surfactant: composition in relation to respiratory rate and lung development. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25 (6), 725-731 (2001).
- Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. 18, 405-407 (1963).
- Costa, G., Aguiar, B. G., Coelho, P. M., Cunha-Melo, J. R. On the increase of portal pressure during the acute and chronic phases of murine schistosomiasis mansoni and its reversibility after treatment with oxamniquine. Acta Trop. 89 (1), 13-16 (2003).
- Cui, S., Shibamoto, T., Zhang, W., Takano, H., Kurata, Y. Venous resistance increases during rat anaphylactic shock. Shock. 29 (6), 733-739 (2008).
- Geerts, A. M., et al. Comparison of three research models of portal hypertension in mice: macroscopic, histological and portal pressure evaluation. Int. J. Exp. Pathol. 89 (4), 251-263 (2008).
- Huang, H., Deng, M., Jin, H., Dirsch, O., Dahmen, U. Intraoperative vital and haemodynamic monitoring using an integrated multiple-channel monitor in rats. Lab Anim. 44 (3), 254-263 (2010).
- Krege, J. H., Hodgin, J. B., Hagaman, J. R., Smithies, O. A noninvasive computerized tail-cuff system for measuring blood pressure in mice. Hypertension. 25 (5), 1111-1115 (1995).
- Kuga, N., et al. Rapid and local autoregulation of cerebrovascular blood flow: a deep-brain imaging study in the mouse. J. Physiol.. 587 (Pt 4), 745-752 (2009).
- Muraki, T., Strain Kato, R. difference in the effects of morphine on the rectal temperature and respiratory rate in male mice. Psychopharmacology (Berl). 89 (1), 60-64 (1986).
- Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol. 293 (1), H534-H540 (2007).
- Sakamoto, M., et al. Improvement of portal hypertension and hepatic blood flow in cirrhotic rats by oestrogen. Eur. J. Clin. Invest. 35 (3), 220-225 (2005).
- Reverter, E., et al. Impact of deep sedation on the accuracy of hepatic and portal venous pressure measurements in patients with cirrhosis. Liver Int. 34 (1), 16-25 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
