Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naskórek i naskórek C. elegans tworzą prostą, ale wyrafinowaną warstwę skóry, która może naprawić miejscowe uszkodzenia wynikające z zranienia. Badania nad reakcjami i gojeniem się ran w tym modelu rzuciły światło na naszą wiedzę na temat reakcji cytoszkieletu i genomu na uszkodzenie tkanek. Dwie najczęściej stosowane metody ranienia skóry dorosłych C. elegans to nakłucia igłami do mikroiniekcji oraz miejscowe naświetlanie laserowe. Ranienie igłą miejscowo narusza naskórek, naskórek i związaną z nim macierz zewnątrzkomórkową, a także może uszkodzić tkanki wewnętrzne. Naświetlanie laserowe powoduje bardziej miejscowe uszkodzenia. Ranienie wywołuje szereg łatwych do zbadania reakcji, w tym podwyższone naskórkowe Ca2+ (sekundy-minuty), tworzenie i zamykanie pierścienia zawierającego aktynę w miejscu rany (1-2 godziny), zwiększoną transkrypcję genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych (2-24 godziny) i tworzenie się blizn. Zasadniczo wszystkie dorosłe zwierzęta typu dzikiego przeżywają zranienia, podczas gdy mutanty wadliwe w gojeniu ran lub innych reakcjach wykazują zmniejszoną przeżywalność. Przedstawiono szczegółowe protokoły nakłuwania igłami i laserem oraz testy do oceny ilościowej i wizualizacji reakcji ran i procesów gojenia (dynamika Ca, dynamika aktyny, indukcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych i przeżycie).
Wprowadzenie
Mechanizmy gojenia się ran skóry są podstawowym interesem biologicznym i mają znaczenie dla zdrowia ludzkiego. Gojenie się ran u kręgowców i ssaków składa się ze złożonej serii skoordynowanych reakcji wielu tkanek i sygnalizacji1. Wiele prostych organizmów modelowych genetycznie jest również zdolnych do leczenia ran skóry2. W związku z tym interesująca jest analiza genetycznie wykonalnych modeli gojenia się ran skóry. My i inni zaczęliśmy używać Caenorhabditis elegans jako nowego modelu gojenia się ran skóry3,4. Celem tego protokołu jest umożliwienie szerszemu gronu badaczy wykorzystania C. elegans jako narzędzia do b....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższe protokoły opisują szczegółową procedurę leczenia ran skórnych C. elegans oraz oceny reakcji na rany.
1. Ranienie igły3,4
- Hoduj zdrowe, niewygłodzone robaki na standardowych płytkach NGM (pożywka do wzrostu nicieni) z bakteriami E. coli OP50 jako pokarmem, utrzymywane w inkubatorze o temperaturze 20 °C.
UWAGA: Metody dotyczące płytek agarowych NGM i rutynowej uprawy C. elegans można znaleźć na www.wormbook.org6. - Zebrać 25 robaków etapowych L4 na świeżo wysianą płytkę na 1 dzień przed zranieniem i wyhodować w temperaturze 20 °C O/N.
- Przed zranieni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zranienie laserem lub igłą wywołuje szybki i trwały wzrost poziomu Ca w naskórku, co można zwizualizować za pomocą czujników Ca, takich jak GCaMPs (Rycina 1). Wzrost poziomu Ca następuje w ciągu kilku sekund i utrzymuje się przez dziesiątki minut. Zranienie igłą w sposób powtarzalny prowadzi do tworzenia się pierścieni F-aktyny w miejscach zranienia (Rycina 2); pojawiają się one w ciągu kilku minut i stopniowo zamykają się w ciągu 1-2 hr po zranieniu. Pierścienie aktynowe tworzą się.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawione tutaj metody nawijania igłami i laserem zapewniają uzupełniające podejścia do oceny zdolności nabłonka naskórka do naprawy uszkodzeń. Ranienie laserowe jest stosunkowo miejscowe i (w zależności od konfiguracji lasera) może być ograniczone do naskórka, podczas gdy zranienie igłą narusza naskórek, naskórek i prawdopodobnie wewnętrzne błony podstawne. Ranienie igłą może bardziej przypominać rany zadane przez patogeny lub uszkodzenia mechaniczne w środowisku naturalnym. Z reguły nawijanie igłą wymaga więcej pra.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie są świadomi istnienia sprzecznych interesów.
Podziękowania
Metody ranienia igłami u C. elegans zostały po raz pierwszy opracowane przez Nathalie Pujol i Jonathana Ewbanka; dziękujemy Nathalie Pujol za komentarze do manuskryptu. Prace w naszym laboratorium nad naprawą ran naskórkowych C. elegans są wspierane przez grant NIH dla A.D.C. (R01 GM054657).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastikowa płytka Petriego | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Lewamisola | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Kapilara ze szkła borokrzemianowego | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Ściągacz igieł | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Ślimak (drut platynowy) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 roztwór | Domowe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Użyj 500 ml na 50 robaków |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| Maszyna do PCR | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-dołkowe probówki do PCR | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | Metamorf | urządzeń molekularnych |
Bibliografia
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
