Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

Podsumowanie

Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.

Streszczenie

Naskórek i naskórek C. elegans tworzą prostą, ale wyrafinowaną warstwę skóry, która może naprawić miejscowe uszkodzenia wynikające z zranienia. Badania nad reakcjami i gojeniem się ran w tym modelu rzuciły światło na naszą wiedzę na temat reakcji cytoszkieletu i genomu na uszkodzenie tkanek. Dwie najczęściej stosowane metody ranienia skóry dorosłych C. elegans to nakłucia igłami do mikroiniekcji oraz miejscowe naświetlanie laserowe. Ranienie igłą miejscowo narusza naskórek, naskórek i związaną z nim macierz zewnątrzkomórkową, a także może uszkodzić tkanki wewnętrzne. Naświetlanie laserowe powoduje bardziej miejscowe uszkodzenia. Ranienie wywołuje szereg łatwych do zbadania reakcji, w tym podwyższone naskórkowe Ca²⁺ (sekundy-minuty), tworzenie i zamykanie pierścienia zawierającego aktynę w miejscu rany (1-2 godziny), zwiększoną transkrypcję genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych (2-24 godziny) i tworzenie się blizn. Zasadniczo wszystkie dorosłe zwierzęta typu dzikiego przeżywają zranienia, podczas gdy mutanty wadliwe w gojeniu ran lub innych reakcjach wykazują zmniejszoną przeżywalność. Przedstawiono szczegółowe protokoły nakłuwania igłami i laserem oraz testy do oceny ilościowej i wizualizacji reakcji ran i procesów gojenia (dynamika Ca, dynamika aktyny, indukcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych i przeżycie).

Wprowadzenie

Mechanizmy gojenia się ran skóry są podstawowym interesem biologicznym i mają znaczenie dla zdrowia ludzkiego. Gojenie się ran u kręgowców i ssaków składa się ze złożonej serii skoordynowanych reakcji wielu tkanek i sygnalizacji¹. Wiele prostych organizmów modelowych genetycznie jest również zdolnych do leczenia ran skóry². W związku z tym interesująca jest analiza genetycznie wykonalnych modeli gojenia się ran skóry. My i inni zaczęliśmy używać Caenorhabditis elegans jako nowego modelu gojenia się ran skóry^3,4. Celem tego protokołu jest umożliwienie szerszemu gronu badaczy wykorzystania C. elegans jako narzędzia do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów gojenia się ran naskórka.

Skóra C. elegans składa się z naskórka (znanego również jako tkanka podskórna) i naskórka zewnątrzkomórkowego⁵. Dorosły naskórek składa się z niewielkiej liczby syncytii wielojądrowych, z których największą jest syncytium znana jako hyp7. Naskórek to prosty nabłonek, który wydziela naskórek na swojej wierzchołkowej powierzchni. Skóra może aktywnie bronić się przed patogenami penetrującymi skórę i naprawiać małe rany⁴. Naprawa ran na skórze C. elegans jest solidna, ponieważ prawie wszystkie zwierzęta typu dzikiego przeżywają małe rany kłute spowodowane igłami lub miejscowe uszkodzenia skóry spowodowane promieniowaniem laserowym. Zranienie skóry C. elegans wyzwala szereg reakcji, w tym wrodzoną odpowiedź immunologiczną naskórka, zamykanie ran i tworzenie się blizn⁴. Dorosły naskórek jest postmitotyczny, a gojenie się ran obejmuje lokalne reakcje komórkowe, a nie proliferację naskórka lub migrację komórek. Wykazaliśmy, że zranienie skóry powoduje duży i trwały wzrost naskórkowego Ca^{2 +}, co wymaga kanału TRPM błony GTL-2 i wewnętrznych magazynów Ca^{2 + 3}. Naskórkowy sygnał Ca²⁺ jest niezbędny do tworzenia i zamykania pierścieni F-aktyny w miejscu rany. Zranienie indukuje również wrodzone odpowiedzi immunologiczne, które aktywują transkrypcję AMP, takich jak nlp-29. Indukowana zranieniem transkrypcja AMP jest zależna od kaskady kinazy MAP TIR-1 / PMK-1 p38 działającej autonomicznie w naskórku⁴. Defekty w szlaku sygnałowym Ca^{2 +} lub we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej prowadzą do niższego przeżycia po zranieniu. Stosunkowo prosta struktura naskórka C. elegans, jego podatność genetyczna i zalety w obrazowaniu in vivo sprawiają, że jest to doskonały system do badania wielu aspektów gojenia się ran.

Tutaj prezentujemy protokoły dla dwóch popularnych metod ranienia: ranienia igłą i ranienia laserowego. Zwijanie igł nie wymaga specjalistycznego sprzętu (poza ściągaczem igieł), a przy doświadczeniu można je wykonać na setkach robaków dziennie. Ranienie igłą wykonuje się na zwierzętach rosnących na płytkach agarowych. W przeciwieństwie do tego, ranienie laserowe jest wykonywane na znieczulonych zwierzętach zamontowanych na podkładkach agarowych pod szkiełkiem nakrywkowym i nadaje się do obrazowania na żywo odpowiedzi komórek na uszkodzenie.

Protokół

Poniższe protokoły opisują szczegółową procedurę leczenia ran skórnych C. elegans oraz oceny reakcji na rany.

1. Ranienie igły^3,4

1. Hoduj zdrowe, niewygłodzone robaki na standardowych płytkach NGM (pożywka do wzrostu nicieni) z bakteriami E. coli OP50 jako pokarmem, utrzymywane w inkubatorze o temperaturze 20 °C.
   UWAGA: Metody dotyczące płytek agarowych NGM i rutynowej uprawy C. elegans można znaleźć na www.wormbook.org⁶.
2. Zebrać 25 robaków etapowych L4 na świeżo wysianą płytkę na 1 dzień przed zranieniem i wyhodować w temperaturze 20 °C O/N.
3. Przed zranieniem wyciągnąć igły z naczyń włosowatych za pomocą ściągacza do igieł. Igły używane do ranienia są identyczne z tymi używanymi do mikroiniekcji C. elegans.
4. Upewnij się, że wszystkie robaki są w fazie młodego dorosłego. Umieść talerz robaków na lodzie na około 30 minut. Chłodzenie powoduje, że zwierzęta są ospałe, co ułatwia zranienie igłą.
   UWAGA: W ciągu 5 minut od usunięcia z lodu robaki zaczną się normalnie poruszać. Możliwe jest, ale trudne, aby zranić poruszające się robaki. Z doświadczeniem 5 minut to wystarczająco dużo czasu, aby zranić 25 robaków. Unieruchomić za pomocą leków, takich jak lewamizol (stosowany w ranieniu laserowym, patrz poniżej), chociaż zwierzęta będą potrzebowały więcej czasu, aby dojść do siebie.
5. Wyjmij płytkę agarową z lodu do preparacyjnego mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą kilofa do robaków przenieś 25 robaków na środek płytki agarowej.
6. Umieść igłę w końcówce pipety o pojemności 100 μl, aby łatwiej trzymać igłę. Nakłuć igłą przednią lub tylną część ciała robaka, unikając gonady. Ogólnie rzecz biorąc, spróbuj zranić się między tylną gardłem a przednią gonadą lub między tylną gonadą a odbytnicą. Używaj igieł wiele razy, aż pękną.
   UWAGA: Upewnij się, że rany są krótkimi, delikatnymi nakłuciami, które nakłuwają naskórek i skórę, wnikając ~5-10 μm w głąb zwierzęcia. Igła powinna wejść w zwierzę mniej więcej pod kątem prostym do skóry. Rany nie powinny powodować widocznych uszkodzeń narządów wewnętrznych ani natychmiastowego pęknięcia ciała. Obserwuj niewielką ilość cytoplazmy sączącą się przez kilka sekund po ranie; Jeśli jednak zawartość komórkowa wycieknie przez dłuższy czas, zwierzęta nie przeżyją. Aby uzyskać optymalne obrazowanie, owiń boczne syncytium naskórka (hyp7) lub szew boczny.
   UWAGA: Ta procedura obejmuje użycie szklanej igły.
7. Pozwolić robakom na regenerację w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić hodowlę w temperaturze 20 °C. Ocenić powodzenie zranienia igłą za pomocą kilku testów opisanych poniżej. Ponad 95% zwierząt typu dzikiego przeżywa 24 godziny po zranieniu igłą w stadium młodego dorosłego osobnika. Wpływ zranień u larw lub osób starszych nie został jeszcze dokładnie przeanalizowany.

2. Ranienie laserowe³

Użyj femtosekundowego naświetlania laserem (800 nm), aby wykonać bardziej precyzyjne nawijanie.

1. Przygotuj podkładki agarowe na szklanym szkiełku z roztopionym 2% agarem⁷. Upewnij się, że elektrody są podobne do padów agarowych używanych do obrazowania na żywo C. elegans.
2. Przenieś 10 młodych dorosłych robaków na podkładkę agarozową za pomocą wykałaczki do robaków i dodaj 2 μl kropli 12 mM roztworu lewamizolu. Przykryj zwierzęta i płyn szkiełkiem nakrywkowym. Odczekaj 1-2 minuty, aż robaki sparaliżują.
3. Umieść szkiełko podstawowe na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Przesuń scenę, aby znaleźć robaki i skup się na bocznym przednim lub tylnym naskórku syncytialnym za pomocą obiektywu 100X (NA 1,4-1,46).
4. Ustaw moc lasera femtosekundowego na 140 mW (mierzoną przed obiektywem). Używaj lasera femtosekundowego z częstotliwością powtarzania 80 MHz.
   UWAGA: Dwa impulsy po 200 ms każdy (oddalone od siebie o 20 ms) wystarczą, aby zranić się w dłonie.
5. Skoncentruj się na wierzchołkowej powierzchni komórki naskórka i zranij naskórek. Obserwuj miejscowe przerwanie cytoplazmy (bulgotanie) lub miejscowe blaknięcie dowolnego użytego markera fluorescencyjnego.
   UWAGA: Podczas korzystania z lasera femtosekundowego należy przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa lasera. Skany liniowe lub punktowe przy użyciu laserów femtosekundowych, takich jak te w dwóch mikroskopach fotonowych, powinny zapewnić wystarczającą moc do zranienia laserowego.
   UWAGA: Chociaż nie mamy bezpośredniego doświadczenia w stosowaniu innych laserów, w zasadzie zranienie powinno być możliwe przy użyciu konwencjonalnych laserów UV (stosowanych w ablacjach komórek C. elegans). Opcjonalnie użyj modułu Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) na wirującym dysku konfokalnym w celu nawinięcia naskórka (N. Pujol, komunikacja osobista).

3. Wizualizacja reakcji naskórka Ca²⁺ na zranienia

1. Stosować transgeniczne szczepy C. elegans, które eksprymują czujniki Ca^{2 +} (takie jak te z serii GCaMP) w naskórku, pod kontrolą dorosłego swoistego dla naskórka promotora col-19 (Figura 1A; transgeny są wymienione w Tabeli 1). Użyj transgenu wyrażającego białko czerwonej fluorescencji, takie jak tdTomato, jako wewnętrznej kontroli poziomu ekspresji transgenu.
   UWAGA: Użyliśmy tdTomato jako wewnętrznej kontroli ekspresji transgenu, ponieważ fluorescencja naskórka tdTomato jest stosunkowo stabilna i nie zakłóca obrazowania GCaMP.
2. Zarówno zranienie igłą, jak i laserem powoduje uniesienie Ca²⁺ w naskórku. Ponieważ jednak nawijanie igłą nie może być łatwo wykonane na konfokalu z wirującym dyskiem, nawijanie laserowe jest preferowane do analizy ilościowej odpowiedzi Ca²⁺ (ryc. 1).
3. Pozyskiwanie obrazów poklatkowych w trybie akwizycji wielowymiarowej (czas interwału 2 sekundy przy ekspozycji lasera wzbudzenia 114 ms) za pomocą wirującego dysku konfokalnego z obiektywem 100X (NA 1.4-1.46) i odpowiednimi zestawami filtrów (filtry GFP będą działać dla GCaMP3).
   UWAGA: Rób zdjęcia poklatkowe co 30 sekund przez około 2 godziny, aby zbadać reakcję Ca²⁺ na zranienia w dłuższym czasie.
4. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, zmierz średnią fluorescencję GCaMP w dziesięciu równoważnych regionach zainteresowania (ROI), z których pięć jest wyśrodkowanych na cytozolu komórek naskórka, a pięć w tle.
5. Uzyskaj wyjściową fluorescencję (F₀), uśredniając fluorescencję w 5 ROI w naskórku, a następnie odejmując średnią 5 ROI w tle przed urazem. Wyrazić zmianę fluorescencji ΔF jako stosunek zmian w stosunku do linii podstawowej [(F_{t-F 0})/F₀].

4. Wizualizacja dynamiki F-aktyny po zranieniu

1. UWAGA: W odpowiedzi na zranienie igłą należy obserwować pierścień aktynowy w miejscu rany, który stopniowo zamyka się wokół rany. Ten odcinek protokołu bada zamknięcie rany, mierząc średnicę pierścienia aktynowego.
2. Generuj transgeniczne robaki, które wyrażają marker F-aktyny, taki jak domena wiążąca aktynę moesyny Drosophila połączona z GFP, wyrażana pod kontrolą specyficznego dla naskórka promotora, takiego jak col-19 (Figura 2A) (transgen juIs352).
   UWAGA: Uzyskaliśmy podobne wyniki przy użyciu innych markerów domeny wiążącej aktynę, takich jak Lifeact lub F-tractin (wyniki niepublikowane).
3. Wykonaj nawijanie igłą transgenicznych robaków Pcol-19-GFP-moesin. Po zranieniu igłą należy obserwować pierścień GFP-mezyny wokół miejsca rany przez ~5 min. Pierścień aktynowy staje się mniejszy i ostatecznie zamyka się 2-3 godziny po zranieniu u zwierząt typu dzikiego (ryc. 2A).
4. Przygotuj 2% wacik agarowy na szkiełku podstawowym i przenieś 10 robaków na podkładkę w 2 μl 12 mM roztworu lewamizolu. Zobrazuj pierścienie GFP-mezyny 1 godzinę po zranieniu za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej.
   UWAGA: Użyj mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać stosy z (13 x 0,5 μm) pierścieni aktynowych 1 godzinę po zranieniu.
5. Zmierz średnicę pierścienia aktynowego po zranieniu. Aby określić ilościowo naskórkową GFP-mezynę, najpierw wykonaj projekcję maksymalnej intensywności stosu z, a następnie narysuj 4 skany liniowe (pod kątem 45° względem siebie) nad pierścieniem GFP-mezyny. Średnica pierścienia jest zdefiniowana jako średnia odległość między pikami czterech skanów liniowych (rysunek 2B). W przypadku pierścieni, które zostały już zamknięte, średnica jest definiowana jako 0 μm.
   UWAGA: Pierścienie F-aktyny są wygodnie mierzone 1 godzinę po zranieniu, ponieważ jest to mniej więcej połowa procesu zamykania rany w typie dzikim. Pierścienie F-aktyny można również mierzyć w wielu punktach czasowych, aby określić przebieg zamykania się rany w czasie. Filmy poklatkowe z zamykania ran można uzyskać za pomocą robaków unieruchomionych lewamizolem i mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

5. Indukcja testu naskórkowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych

UWAGA: Ranienie również wywołuje wrodzone reakcje immunologiczne u skóry C. elegans. W naskórku indukowana jest transkrypcja genów kodujących peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP). AMP nlp-29 (białko podobne do neuropeptydu) jest silnie indukowane przez zranienie⁴. Aby określić, w jaki sposób naskórek kontroluje ekspresję AMP po zranieniu, użyj transgenicznych reporterów lub PCR w czasie rzeczywistym do wykrycia indywidualnych poziomów transkryptów AMP.

1. Transgeniczny test reporterowy dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zranienia⁴.
2. Przeprowadzić nakłuwanie igłą (jak w protokole 1) na dorosłych zwierzętach wykazujących ekspresję transgenicznego reportera frIs7, który zawiera Pnlp-29-GFP i Pcol-12-DsRed jako kontrolę wewnętrzną. Obserwuj niezranione dorosłe zwierzęta jako ciemnoczerwone lub pomarańczowe w filtrze długoprzepustowym GFP.
   UWAGA: Ranienie robaków typu dzikiego wywoła ekspresję Pnlp-29-GFP, ale nie wpłynie na Pcol-12-dsRed, co spowoduje, że robaki będą wyglądać na pomarańczowe, żółte lub zielone przy oświetleniu długoprzepustowym GFP. Utrata funkcji genów w szlaku p38 MAPK, takich jak pmk-1 lub nsy-1, zablokuje indukcję nlp-29-GFP po zranieniu⁴. Pnlp-29-GFP ulega ekspresji na wysokich poziomach w stadiach larwalnych
3. Wykonaj testy indukcji AMP u młodych dorosłych zwierząt. Upewnij się, że niezranione zwierzęta kontrolne mają niski poziom GFP.
   UWAGA: Ekspresja Pnlp-29-GFP jest również indukowana przez stres osmotyczny⁸ i może być wrażliwa na inne stresy środowiskowe.
4. 6 godzin po zranieniu oceń liczbę robaków, które mają indukcję Pnlp-29-GFP (ryc. 3)⁹ za pomocą fluorescencyjnej lunety z filtrem długoprzepustowym GFP.
   UWAGA: Po 1 godzinie od zranienia Pnlp-29-GFP jest widocznie indukowany, osiągając szczyt około 6 godzin po zranieniu, a następnie pozostając podwyższonym do 24 godzin po zranieniu. Kwantyfikacja ekspresji za pomocą oceny wizualnej^4,9. Alternatywnie, określ ilościowo poziomy ekspresji za pomocą sortownika robaków aktywowanego fluorescencją⁴. W przypadku sortownika robaków należy zranić co najmniej 50 zwierząt.
5. Test PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego określania poziomów transkryptów poszczególnych genów AMP. Oznacz poziomy transkryptów dla kilku genów: nlp-29, nlp-30, cnc-1 i cnc-5.
6. Wykonać nakłuwanie igłą na robakach typu dzikiego lub zmutowanych (patrz protokół 1)
7. Zbierz 50 rannych robaków i 50 niezranionych robaków w żądanym czasie (np. 3, 6, 24 godzin) po zranieniu.
8. Ekstrahuj RNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Wykonaj odwrotną transkrypcję, aby uzyskać całkowite 20 μl cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do odwrotnej transkryptazy.
10. W przypadku RT-PCR należy użyć 0,2 μl cDNA (1/40) z każdej próbki w połączeniu z zielonym supermiksem z fluoresceiną i starterami 0,2 μM. Aby porównać jakość RNA, użyj ama-1 lub snb-1 RT-PCR jako odniesienia; porównać względny poziom ekspresji AMP przez normalizację do kontroli wewnętrznej (ama-1 lub snb-1) lub porównać indukcję fałdowania po zranieniu (indukcja AMP u zranionych robaków/niezranionych robaków) przez normalizację do kontroli wewnętrznej.
    UWAGA: cnc-1 i cnc-5 to peptydy przeciwdrobnoustrojowe z rodziny caenacin, których transkrypcja jest aktywowana przez zranienie¹⁰. Zazwyczaj zranienie igłą wywołuje ekspresję (~500-krotność dla cnc-1) w ciągu 4 godzin¹⁰. Elementarze użyte w opublikowanych pracach wymieniono w tabeli 2.

6. Test przeżycia po zranieniu

1. UWAGA: Ranie aktywuje co najmniej dwa niezależne szlaki sygnałowe w naskórku: zależny od Ca²⁺ szlak gojenia ran i szlak wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Obie drogi są niezbędne do pełnego przeżycia jałowych ran. Aby sprawdzić, czy leczenie mutantem lub RNAi wpływa na gojenie się ran, zmierz przeżycie po 24-48 godzinach od zranienia. Opcjonalnie należy użyć konwencjonalnych testów długości życia, aby określić wpływ zranienia na długowieczność^4,9.
2. Wykonaj nakłuwanie igłą młodych dorosłych (L4 + 24 godziny) robaków (50 robaków, powtórz kilka razy) zgodnie z protokołem 1 powyżej. Utrzymuj równoważną liczbę niezranionych robaków jako kontrole.
3. Sprawdzaj przeżywalność co 24 godziny (co 24 godziny przenosić zranione robaki na nową płytkę agarową). Obserwuj ~50% przeżycia 24 godziny po zranieniu u mutantów, które są wadliwe w gojeniu się ran, takich jak gtl-2 lub tir-1, po znormalizowaniu do nierannych zwierząt kontrolnych. Śmierć definiuje się jako brak reakcji lokomotorycznej na dotyk robaka.

Wyniki

Zranienie laserem lub igłą wywołuje szybki i trwały wzrost poziomu Ca w naskórku, co można zwizualizować za pomocą czujników Ca, takich jak GCaMPs (Rycina 1). Wzrost poziomu Ca następuje w ciągu kilku sekund i utrzymuje się przez dziesiątki minut. Zranienie igłą w sposób powtarzalny prowadzi do tworzenia się pierścieni F-aktyny w miejscach zranienia (Rycina 2); pojawiają się one w ciągu kilku minut i stopniowo zamykają się w ciągu 1-2 hr po zranieniu. Pierścienie aktynowe tworzą się...

Dyskusja

Przedstawione tutaj metody nawijania igłami i laserem zapewniają uzupełniające podejścia do oceny zdolności nabłonka naskórka do naprawy uszkodzeń. Ranienie laserowe jest stosunkowo miejscowe i (w zależności od konfiguracji lasera) może być ograniczone do naskórka, podczas gdy zranienie igłą narusza naskórek, naskórek i prawdopodobnie wewnętrzne błony podstawne. Ranienie igłą może bardziej przypominać rany zadane przez patogeny lub uszkodzenia mechaniczne w środowisku naturalnym. Z reguły nawijanie igłą wymaga więcej pra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	Denville Scientific	CA3510-8
Plastikowa płytka Petriego	Tritech Research	T3308	60 mm
Lewamisola	Sigma	L9756	12 mM
Kapilara ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments	1B100F-4
Ściągacz igieł	Sutter Instrument	P-2000
Ślimak (drut platynowy)	Tritech Research	PT-9010
M9 roztwór	Domowe		3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie
Trizol	Invitrogen	15596026	Użyj 500 ml na 50 robaków
iQ SYBR Green	Bio-Rad	1708882
SuperScript III	Invitrogen	18080-051
Maszyna do PCR	Bio-Rad	C1000/CFX96
96-dołkowe probówki do PCR	Bio-Rad	MLL9601
Oprogramowanie do analizy obrazu	Metamorf		urządzeń molekularnych