Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Podsumowanie

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Streszczenie

Diapauza fotoperiodyczna jest ważną adaptacją, która pozwala jednostkom uciec od trudnych warunków sezonowych poprzez szereg zmian fizjologicznych, w szczególności zatrzymanie rozwoju i zmniejszony metabolizm. Globalne profilowanie ekspresji genów za pomocą RNA-Seq może dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów transkrypcyjnych diapauzy fotoperiodycznej. Azjatycki komar tygrysi, Aedes albopictus, jest znakomitym organizmem do badania podstaw transkrypcyjnych diapauzy ze względu na łatwość hodowli, łatwą do wywołania diapauzę i dostępne zasoby genomowe. Niniejszy manuskrypt przedstawia ogólny eksperymentalny przebieg pracy w celu identyfikacji różnic transkrypcyjnych wywołanych diapauzą u A. albopictus. Udokumentowane są techniki hodowlane, warunki niezbędne do wywołania rozwoju diapauzy i bez diapauzy, metody szacowania procentowej diapauzy w populacji oraz ekstrakcja RNA i ocena integralności komarów. Przepływ pracy polegający na przetwarzaniu danych RNA-Seq z sekwenatorów Illumina kończy się listą genów o zróżnicowanej ekspresji. Reprezentatywne wyniki pokazują, że protokół ten może być wykorzystany do skutecznej identyfikacji genów regulowanych w różny sposób na poziomie transkrypcji u A. albopictus ze względu na różnice fotoperiodyczne. Przy niewielkich korektach ten przepływ pracy można łatwo dostosować do badania podstaw transkrypcji diapauzy lub innych ważnych cech historii życia u innych komarów.

Wprowadzenie

Szybki postęp w technologiach sekwencjonowania nowej generacji (NGS) dostarcza ekscytujących możliwości zbadania molekularnych podstaw szerokiego zakresu genetycznie złożonych adaptacji ekologicznych w szerokiej gamie organizmów niemodelowych^1–3. Podejście to jest niezwykle skuteczne, ponieważ stanowi podstawę do badań genomiki populacyjnej i funkcjonalnej organizmów o szczególnie interesującej i/lub dobrze opisanej historii ekologicznej lub ewolucyjnej, a także organizmów o znaczeniu praktycznym, takich jak szkodniki rolnicze i wektory chorób. W związku z tym technologie NGS prowadzą do szybkich postępów w dziedzinie ekologii i mają p....

Protokół

1. Hodowla larw dwóch grup A. albopictus do osiągnięcia wieku dorosłego

1. Ustaw dwie szafki fotoperiodyczne z programowalnym oświetleniem o temperaturze 21 °C, aby uzyskać optymalną ekspresję diapauzy¹⁶ i około 80% wilgotności względnej.
   1. Zaprogramuj jedną szafkę na cykl 16L:8D światło:ciemność (fotoperiod LD niewywołujący diapauzy). Ustaw drugą szafkę na cykl 8L:16D światło:ciemność (wywołujący diapauzę)¹³.
   2. Zaprogramuj "światła" włączone w tym samym czasie w obu szafkach, aby zsynchronizować czas okołodobowy między fotoperiodami.
2. Oblicz ilość jaj potrzebną do przeprowadzenia ekspe....

Wyniki

Fluorometria dwóch reprezentatywnych próbek RNA wykazała dwa prążki o wielkości około 2,000 nt (Ryc. 1A, B). Owadzi rybosomalny RNA 28S składa się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych połączonych wiązaniami wodorowymi, które są łatwo zrywane przez krótkotrwałe podgrzewanie lub odczynniki rozrywające wiązania wodorowe³⁵. Powstałe dwa komponenty mają wielkość zbliżoną do rybosomalnego RNA 18S. Druga próbka RNA wykazała wysoki stopień degradacji (Ryc. 1B).

Dyskusja

Protokół ten przedstawia metody odkrywania genów o zróżnicowanej ekspresji w wyniku fotoperiodycznie indukowanej diapauzy u A. albopictus. Protokół jest znaczący, ponieważ w unikalny sposób łączy hodowlę komarów i techniki bioinformatyczne, aby wszystkie eksperymentalne aspekty programu fizjologii molekularnej były dostępne dla początkujących użytkowników - w szczególności dla tych, którzy koncentrują się na fotoperiodycznej reakcji diapauzy. Istniejące metody, zgodnie z naszą wiedzą, nie dostarczają tak wielu s.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator - Model 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Pomieszczenie z kontrolowanym środowiskiem	Thermax Scientific	N/A	Pomieszczenie z kontrolowanym środowiskiem zbudowane zgodnie z niestandardowymi specyfikacjami przez Thermax Scientific Products. Większa alternatywa dla inkubatora. http://thermmax.com/
Cool Żarówka fluorescencyjna	Philips	392183	4 W
szalka Petriego 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Bibuła filtracyjna 20,5 cm	Fisher	09-803-6J
9,5 L Wiadro	Plastikan	Bway Produkty	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Użytkowe Moskitiera z tkaniny Biała	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Pończochy ortopedyczne	Albahealth	23650-040	nr produktu 081420
Organiczne rodzynki	Newman's Own	UPC: 884284040255
Miseczki do składania jaj (brązowe)	Fisher Scientific	03-007-52	Produkt to w rzeczywistości bursztynowa butelka o pojemności 125 ml, którą widzieliśmy na wierzchu.
Ręczniki papierowe z recyklingu	Siódma generacja	30BPT120
Modular Mates Kwadratowy zestaw Tupperware Tupperware			http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Młynek do szkła	Corning Incorporated	7727-2	Te młynki do tkanek Tenbroeck rozbijają jaja i uwalniają RNA do odczynnika TRI.
Odczynnik TRI	Sigma Aldrich	T9424	Zastosuj 1 ml odczynnika TRI na 50-100 mg tkanki. Uwaga — Ten odczynnik jest toksyczny.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	Ten zestaw generuje większą wydajność niż tradycyjne leczenie DNazą, po którym następuje oczyszczanie fenolu/chloroformu, i jest prostszy w użyciu.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Nakładać obficie na powierzchnie stołu i wszelkie urządzenia, które mogą mieć kontakt z próbkami RNA. Roztwór jest lekko zasadowy/, może powodować podrażnienia i jest szkodliwy po połknięciu.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Umieść do 12 próbek RNA na jednym chipie.
Podajnik membranowy Hemotek	Hemotek	5W1	Ten system zapewnia 5 stacji karmienia, które mogą być używane jednocześnie. Zawiera zasilacz PS5 i przewód zasilający; 5 podajników FUI + zbiorniki na mączkę i oringi; Zatyczki plastikowe, membrana zasilająca kolagen Hemotek; Narzędzie do ustawiania temperatury; i narzędzie do wyjmowania wtyczek. Adres korespondencyjny firmy to: Hemotek Sp. z o.o.; Wydział 5 Sąd Związkowy; Droga Alana Ramsbottoma; Wielki Harwood; Lancashire, Wielka Brytania; BB6 7FD; Tel.: +44 1254 889 307.
Cyfrowy termometr i sonda	Hemotek	Termometr MT3KFU	MicroT3 i sonda KFU. Służy do ustawiania temperatury każdej jednostki podającej FUI.
Kurczak Krew pełna, niesterylna z cytrynianem sodu	Pel-Freez Biologicals	33130-1	500 ml krwi zamrożono i przechowywano w 20 ml porcjach w temperaturze -80 ° C przez okres do 1 roku. Rozmrażaj krew w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.