Method Article

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

DOI:

10.3791/51961

⸱

November 30th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diapauza fotoperiodyczna jest ważną adaptacją, która pozwala jednostkom uciec od trudnych warunków sezonowych poprzez szereg zmian fizjologicznych, w szczególności zatrzymanie rozwoju i zmniejszony metabolizm. Globalne profilowanie ekspresji genów za pomocą RNA-Seq może dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów transkrypcyjnych diapauzy fotoperiodycznej. Azjatycki komar tygrysi, Aedes albopictus, jest znakomitym organizmem do badania podstaw transkrypcyjnych diapauzy ze względu na łatwość hodowli, łatwą do wywołania diapauzę i dostępne zasoby genomowe. Niniejszy manuskrypt przedstawia ogólny eksperymentalny przebieg pracy w celu identyfikacji różnic transkrypcyjnych wywołanych diapauzą u A. albopictus. Udokumentowane są techniki hodowlane, warunki niezbędne do wywołania rozwoju diapauzy i bez diapauzy, metody szacowania procentowej diapauzy w populacji oraz ekstrakcja RNA i ocena integralności komarów. Przepływ pracy polegający na przetwarzaniu danych RNA-Seq z sekwenatorów Illumina kończy się listą genów o zróżnicowanej ekspresji. Reprezentatywne wyniki pokazują, że protokół ten może być wykorzystany do skutecznej identyfikacji genów regulowanych w różny sposób na poziomie transkrypcji u A. albopictus ze względu na różnice fotoperiodyczne. Przy niewielkich korektach ten przepływ pracy można łatwo dostosować do badania podstaw transkrypcji diapauzy lub innych ważnych cech historii życia u innych komarów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybki postęp w technologiach sekwencjonowania nowej generacji (NGS) dostarcza ekscytujących możliwości zbadania molekularnych podstaw szerokiego zakresu genetycznie złożonych adaptacji ekologicznych w szerokiej gamie organizmów niemodelowych1–3. Podejście to jest niezwykle skuteczne, ponieważ stanowi podstawę do badań genomiki populacyjnej i funkcjonalnej organizmów o szczególnie interesującej i/lub dobrze opisanej historii ekologicznej lub ewolucyjnej, a także organizmów o znaczeniu praktycznym, takich jak szkodniki rolnicze i wektory chorób. W związku z tym technologie NGS prowadzą do szybkich postępów w dziedzinie ekologii i mają potencjał, aby rozwiązać takie problemy, jak zrozumienie mechanistycznych podstaw reakcji biologicznych na gwałtowne współczesne zmiany klimatu4, rozprzestrzenianie się gatunków inwazyjnych5 oraz interakcje gospodarz-patogen6,7.

Niezwykły potencjał technologii NGS do rozwiązywania podstawowych i stosowanych problemów w ekologii i biologii ewolucyjnej wynika częściowo z faktu, że te podejścia mogą być zastosowane do każdego organizmu przy umiarkowanych kosztach, które są wykonalne dla większości laboratoriów badawczych. Co więcej, podejścia te dostarczają informacji o całym genomie bez konieczności korzystania z apriorycznych zasobów genetycznych, takich jak chip do mikromacierzy lub kompletna sekwencja genomu. Niemniej jednak, aby zmaksymalizować produktywność eksperymentów NGS, należy dokładnie rozważyć projekt eksperymentu, w tym takie kwestie, jak czas rozwoju i specyficzność tkankowa pobierania próbek RNA. Co więcej, umiejętności techniczne wymagane do analizy ogromnych ilości danych generowanych przez te eksperymenty, często do kilkuset milionów odczytów sekwencji DNA, stanowiły szczególne wyzwanie i ograniczyły powszechne wdrażanie podejść NGS.

Ostatnie badania RNA-Seq na temat podstaw transkrypcji diapauzy u inwazyjnego i ważnego z medycznego punktu widzenia komara Aedes albopictus dostarczają użytecznego przykładu niektórych eksperymentalnych protokołów, które mogą być wykorzystane do skutecznego zastosowania technologii NGS do badania molekularnych podstaw złożonej adaptacji ekologicznej w organizmie niemodelowym8–10. A. albopictus jest wysoce inwazyjnym gatunkiem, który pochodzi z Azji, ale ostatnio zaatakował Amerykę Północną, Amerykę Południową, Europę i Afrykę11,12. Podobnie jak wiele owadów strefy umiarkowanej, umiarkowane populacje A. albopictus przeżywają zimę, wchodząc w stan spoczynku zwany diapauzą fotoperiodyczną. U A. albopictus narażenie poczwarek i dorosłych samic na krótkie (jesienne) długości dnia prowadzi do produkcji jaj diapauzy, w których rozwój embriologiczny jest zakończony, ale larwa pharate wewnątrz kosmówki jaja wchodzi w zatrzymanie rozwoju, co sprawia, że jajo jest oporne na bodziec wylęgowy15–17. Jaja diapauzy są bardziej odporne na wysuszenie5,18 i zawierają więcej lipidów ogółem19 niż jaja bez diapauzy. Diapauza fotoperiodyczna u A. albopictus jest zatem kontrolowaną przez matkę, adaptacyjną plastycznością fenotypową, która jest niezbędna do przetrwania w trudnych warunkach zimy w środowisku umiarkowanym. Pomimo dobrze poznanego ekologicznego znaczenia diapauzy fotoperiodycznej u szerokiego zakresu owadów20,21, molekularne podstawy tej kluczowej adaptacji nie są dobrze scharakteryzowane u żadnego owada22. U organizmów takich jak A. albopictus, które przechodzą diapauzę embrionalną w stadium larwalnym pharate, szczególnie istotnym wyzwaniem pozostaje zrozumienie, w jaki sposób sygnał fotoperiodyczny odbierany przez matkę jest przekazywany potomstwu i utrzymuje się w trakcie rozwoju embrionalnego, powodując zatrzymanie w stadium larwalnym pharate.

Ten protokół opisuje hodowlę komarów, projektowanie eksperymentalne i analizy bioinformatyczne dla eksperymentów NGS (sekwencjonowanie transkryptomu) przeprowadzanych w celu wyjaśnienia składników transkrypcyjnych diapauzy fotoperiodycznej u A. albopictus. Protokół ten może być wykorzystany do dodatkowych badań diapauzy u A. albopictus, może być dostosowany do badania diapauzy u innych blisko spokrewnionych gatunków, takich jak inne komary aedine, które przechodzą diapauzę jaj23, a także jest bardziej ogólnie odpowiedni do stosowania podejść NGS do badania podstaw transkrypcyjnych dowolnej złożonej adaptacji u dowolnego owada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla larw dwóch grup A. albopictus do osiągnięcia wieku dorosłego

  1. Ustaw dwie szafki fotoperiodyczne z programowalnym oświetleniem o temperaturze 21 °C, aby uzyskać optymalną ekspresję diapauzy16 i około 80% wilgotności względnej.
    1. Zaprogramuj jedną szafkę na cykl 16L:8D światło:ciemność (fotoperiod LD niewywołujący diapauzy). Ustaw drugą szafkę na cykl 8L:16D światło:ciemność (wywołujący diapauzę)13.
    2. Zaprogramuj "światła" włączone w tym samym czasie w obu szafkach, aby zsynchronizować czas okołodobowy między fotoperiodami.
  2. Oblicz ilość jaj potrzebną do przeprowadzenia eksperymentu. Celuj w 300-500 jaj na klatkę. Do wytworzenia RNA potrzebne są co najmniej trzy klatki diapauzy z replikami i trzy klatki bez diapauzy. Daje to w sumie ok. 1 800-3 000 jaj na eksperyment.
    1. Z jaj wykluwać się zanurzając bibułki jajowe w ok. 500 ml dejonizowanegoH2O.
    2. Dodać ok. 1 ml gnojowicy składającej się z mielonej karmy dla psów i krewetek solankowych, jak opisano wcześniej24. Przykryj pojemnik siatką i trzymaj siatkę na miejscu za pomocą gumki.
    3. Umieścić w komorze fotoperiodycznej LD na ok. 24 godziny.
  3. Przenieść wyklute larwy na szalki Petriego o wymiarach 10 x 10 x 2 cm wypełnione ok. 90 ml dejonizowanegoH2O.
    1. Utrzymuj ok. 30 larw na naczynie. Przenoszenie larw do czystych naczyń co 48–72 godziny, na przykład w każdy poniedziałek, środę i piątek (Pn-W-F)24.
    2. Podawaj ok. 1 ml gnojowicy spożywczej składającej się z mielonej karmy dla psów i krewetek solankowych w wodzie dejonizowanej co M-W-F, jak opisano wcześniej24.
  4. Ustaw trzy do czterech klatek dla dorosłych dla każdego zabiegu fotoperiodycznego, gdzie każda klatka zawiera biologiczną replikę.
    1. Z przeciwnych stron wiader o pojemności 9,5 l wytnij jeden otwór o wymiarach 10 na 14 cm, a drugi otwór o średnicy 15 cm. Przykryj pierwszy siatką. Wytnij pończochę ortopedyczną o długości około jednej stopy i przyklej jeden koniec wokół wewnętrznej strony drugiego otworu.
    2. Odetnij dolną część pończochy i zawiąż węzeł - otwieraj tylko wtedy, gdy potrzebny jest dostęp do wnętrza klatki. W przypadku pokrywy klatki wytnij całe wnętrze, pozostawiając tylko obręcz, i zastąp wewnętrzny plastik siatką24.
    3. Zanotuj fotoperiod, liczbę repliki, datę rozpoczęcia klatki i inne informacje istotne dla eksperymentu za pomocą trwałego markera z boku klatki.
  5. Wyłóż dno klatek dla dorosłych mokrą bibułą filtracyjną. Zwilż bibułę filtracyjną wystarczającą ilością dejonizowanegoH2O, aby zwiększyć miejscową wilgotność w klatce, ale unikaj stojącej wody, która może stymulować składanie jaj na bibule filtracyjnej24. Codziennie sprawdzaj bibułę filtracyjną pod kątem wyschnięcia, w razie potrzeby ponownie zwilż.
  6. Aby wyprodukować wystarczającą ilość jaj do biblioteki RNA, należy umieścić co najmniej 100 samic na klatkę o pojemności 9,5 l, przy czym w klatce nie może znajdować się więcej niż 500 komarów.
  7. Zebrać poczwarki M-W-F i umieścić w małym kubku z czystymH2Oo gęstości nie większej niż 50 poczwarek na 25 mlH2O. Przenieść miseczkę poczwarki do klatki dla dorosłych. Umieść klatki w odpowiedniej komorze fotoperiodycznej — poczwarki A. albopictus są światłoczułe15.
  8. Codziennie upewnij się, żeH2Ow kubkach jest czysty i klarowny, i usuń martwe poczwarki, ponieważ nagromadzenie martwych poczwarek może spowodować masową śmiertelność. Usuń miseczki H2O po pojawieniu się wszystkich poczwarek.
  9. Umieść organiczne rodzynki na górnej siatce klatki, aby zapewnić cukier wschodzącym dorosłym osobnikom. Monitoruj rodzynki i zmieniaj je co 3-5 dni, aby zapobiec gromadzeniu się pleśni.

2. Utrzymanie dorosłych osobników w celu umożliwienia krycia i produkcji jaj

  1. Utrzymuj klatki w wysokiej wilgotności (ok. 80%), wykładając dno klatki wilgotną bibułą filtracyjną i zapewniając dostęp do niespleśniałych rodzynek, jak opisano powyżej (sekcje 1.5 i 1.9).

3. Karmienie krwią

  1. Przygotuj się do karmienia krwią samic między dwoma a sześcioma dniami po eklozji, aby upewnić się, że samice były narażone na co najmniej osiem jednoznacznych krótkich dni przed rozpoczęciem składania jaj w przypadku prawie 100% diapauzyjaj.
  2. Przygotuj system podawania membranowego Hemotek. Podłącz jednostki podające do zasilania. Dostosuj temperaturę każdej jednostki do 37 °C za pomocą regulacyjnej. Użyj elektronicznego termometru i sondy, aby zmierzyć temperaturę jednostki podającej podczas kalibracji.
  3. Przygotuj zbiornik na posiłek. Rozciągnij kwadrat kolagenowej membrany zasilającej nad otworem zbiornika na posiłek i zabezpiecz go O-ringiem. Ostrożnie pociągnij rogi, aby usunąć zmarszczki; Przytnij nadmiar membrany nożyczkami.
    UWAGA: Membrana kolagenowa może nie działać dobrze dla wszystkich gatunków komarów i może być konieczne wypróbowanie kilku typów, aby znaleźć optymalną membranę w przypadku pracy z gatunkiem innym niż A. albopictus. Parafilm dobrze współpracuje z Culex pipiens.
    1. Jeśli krew jest przechowywana w stanie zamrożonym, przed użyciem rozmrażaj ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Trzymaj zbiornik tak, aby membrana była skierowana w dół, niepodparta, a porty napełniania były skierowane do góry. Za pomocą pipety lub strzykawki należy napełnić zbiornik około 3 ml krwi pełnej pochodzącej od kurcząt, która zawiera cytrynian sodu jako antykoagulant. Uszczelnij porty napełniania plastikowymi zatyczkami.
  4. Przymocuj przygotowany zbiornik do podajnika, przykręcając go do kołka na płycie wymiany ciepła na spodzie podajnika. Odwróć karmnik i umieść go na klatce, membraną do dołu, aby komary mogły przedostać się przez siatkę klatki. Trzymaj karmnik na klatce przez około 45 minut, aby zmaksymalizować karmienie.

4. Stymuluj składanie jaj

  1. Cztery do pięciu dni po posiłku z krwi wyposaż każdą klatkę w ciemny kubek o pojemności 50 ml wyłożony niebielonym papierem do kiełkowania nasion (papier jajeczny) lub teksturowanym, niebielonym ręcznikiem papierowym i napełnij do połowy wodą dejonizowaną9. Jeśli w klatce znajduje się więcej niż 250 komarów, użyj dwóch filiżanek.
    UWAGA: W przypadku małych klatek lub fiolek z pojedynczymi samicami, "napar z siana" w pojemnikach do składania jaj może zwiększyć składanie jaj ze względu na zapach flory bakteryjnej25.

5. Zbieraj i przechowuj jajka

  1. Rozpocznij zbieranie jaj w ciągu 4-5 dni od karmienia krwią, ponieważ produkcja jaj zwykle osiąga szczyt około pięciu dni po karmieniu krwią, a następnie ustępuje w ciągu następnego tygodnia.
  2. Zmieniaj częstotliwość pobierania jaj w zależności od potrzeb eksperymentu. Do celów ogólnych zbieraj papiery jajeczne według harmonogramu M-W-F. Usuń bibułki jajeczne z każdej klatki i zastąp je świeżym papierem. Umieść ostatnio usunięte papiery na szalkach Petriego i przechowuj w szafce fotoperiodycznej SD, aby uniknąć zakłócających efektów przechowywania jaj.
  3. Pozostaw bibułki jajowe mokre przez 2 dni po złożeniu jaj, aby umożliwić tworzenie się naskórka surowiczego, co zwiększa odporność jaj na wysychanie26.
  4. Około 48 godzin po zbiorach, suszenie jaj na świeżym powietrzu. Wysuszyć papier tak, aby był wiotki i lekko wilgotny w dotyku, ale nie na tyle mokry, aby papier był ciemny odH2Olub stymulował wylęganie się jaj.
    UWAGA: Papier o wymiarach 6,5 x 4 cale może schnąć po około 3,5 godziny. Uważaj, aby nie przesuszyć bibułek jajowych, ponieważ spowoduje to wysuszenie jaj27.
  5. Zarezerwuj dodatkowe komórki jajowe zarówno z fotoperiodów LD, jak i SD, aby ocenić częstość występowania diapauzy i zinterpretować efekt fotoperiodyczny (patrz Pomiar diapauzy, sekcja 6).
  6. W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać bibułki jajowe w temperaturze 21 °C i wilgotności około 80% na szalkach Petriego. Szalki Petriego należy przechowywać w pojemniku Tupperware z kolbą z wodą, aby utrzymać lokalną wilgotność, ponieważ rozwój zarodka trwa od czterech do pięciu dni w temperaturze 21 °C.

6. Zmierz częstość występowania diapauzy

  1. Należy użyć dodatkowych zarezerwowanych zarodków (patrz Stymulacja składania jaj, sekcja 4), które mają 7–20 dni, aby określić ilościowo odpowiedź na diapauzę.
  2. Zapisz liczbę jaj obecnych na każdym papierze jajkowym.
  3. Stymulować jaja do wylęgu poprzez całkowite zanurzenie pojedynczych bibułek jajowych w 90 ml szalki Petriego z około 80 ml dejonizowanegoH2O. Dodać około 0,25 ml gnojowicy spożywczej.
  4. Po 24 godzinach należy podliczyć liczbę wyklutych larw w pierwszym stadium rozwojowym. Umieść szalkę Petriego na czarnej powierzchni, aby uwidocznić larwy i umieść źródło światła po jednej stronie szalki. Larwy oddalają się od źródła światła, co pozwala na wyraźne zliczenie poszczególnych larw. Podczas liczenia należy usunąć pojedyncze larwy za pomocą pipety, aby zapobiec ponownemu liczeniu pojedynczych larw.
  5. Umieść bibułki jajeczne na nowej szalce Petriego i ponownie wysusz. Ponownie wykluć jaja po ~1 tygodniu i ponownie zliczyć jaja wyklute przy użyciu powyższej metody.
  6. Umieścić bibułki jajowe z pozostałymi niewyklutymi jajami na nowych 90 ml szalkach Petriego z około 80 ml roztworu wybielającego28. Upewnij się, że bibułki jajeczne są całkowicie zanurzone w roztworze wybielającym i pozostaw na noc pod wyciągiem, aby uniknąć zapachu wybielacza.
    UWAGA: Roztwór wybielający można przechowywać przez ~ 1 tydzień w temperaturze 4 °C, ale w przeciwnym razie powinien być świeży.
  7. Zbadaj jaja za pomocą mikroskopu świetlnego, ponieważ bielenie oczyści kosmówkę i umożliwi wizualizację zarodków, niewyklutych jaj. Jeśli jajo jest zarodkowe, jajo będzie miało białawy kolor, a oczy pojawią się jako dwie małe czarne kropki naprzeciwko siebie po stronie grzbietowej. Policz liczbę niewyklutych, zarodkowych jaj13.
  8. Częstość występowania diapauzy należy określić za pomocą następującego wzoru: % diapauzy = liczba zarodków jajowych niewyklutych / (liczba jaj wyklutych + liczba jaj zarodkowych niewyklutych) x 100 13.

7. Ekstrakcja RNA z jaj/larw faratu

UWAGA: Użyj Trizolu w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Szczotkuj jaja komarów zawierające rozwijające się zarodki lub larwy pharate w różnych punktach czasowych rozwoju, od bibułek jajowych do szklanych młynków, za pomocą szczotki z wielbłądziego włosia. Zmiel jaja w Trizol (1 ml na 50–100 mg tkanki) aż do całkowitego sproszkowania. Użyj co najmniej 400 jaj na bibliotekę, aby uzyskać wystarczającą ilość RNA.
    1. Alternatywnie, jaja można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C w probówkach do mikrowirówek przez okres do miesiąca przed zmieleniem w Trizol.
  2. Przeprowadzić ekstrakcję RNA w Trizol, a następnie wytrącić izopropanol zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Potraktuj ławkę roztworem do odkażania RNazy lub innymi środkami, aby usunąć wszelkie pozostałości nukleaz, aby uniknąć degradacji RNA.
    1. Potraktuj wyekstrahowany RNA za pomocą DNazy. Zgodnie z instrukcjami producenta, próbki RNA inkubować z DNazą przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Użyć 1 μl DNazy na maksymalnie 10 μg RNA w reakcji 50 μl. Zwiększ ilość DNazy, jeśli w jednej reakcji jest więcej niż 10 μg RNA.
    2. Dezaktywować DNazę, dodając 5 μl zawieszonego odczynnika inaktywującego DNazę. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, mieszając trzykrotnie w okresie inkubacji (delikatne wirowanie).
    3. Wirować przy 10 000 x g przez 1,5 min. Przenieść supernatant zawierający próbki RNA poddane działaniu substancji do świeżych probówek w celu wykonania kolejnych etapów.
  4. Ocenić jakość całkowitych próbek RNA za pomocą fluorometrii. Wyślij próbki do specjalistycznej placówki z odpowiednim przyrządem do tego zadania. Placówka przeprowadzi wbudowaną w chip elektroforezę żelową w celu określenia rozmiarów gatunków RNA w próbce, uwidocznionych za pomocą barwnika fluorescencyjnego wkroplonego do chipa. Wyniki zostaną zwrócone w postaci elektroferogramu.
    1. Określ integralność całkowitych próbek RNA na podstawie obecności lub braku produktów degradacji, o czym świadczy obecność pików między pikami rybosomalnego RNA 18S i 5S na otrzymanym elektroferogramie (Figura 1B).

8. Sekwencjonowanie RNA

  1. Wyślij całkowite próbki RNA o wystarczająco wysokiej jakości (Rysunek 1A) i ilości (zwykle >3 μg na bibliotekę) do komercyjnego centrum sekwencjonowania w celu budowy wzbogaconych bibliotek mRNA o sparowanych końcach i sekwencjonowania mRNA, zgodnie ze standardowymi protokołami.
  2. Jeśli do sekwencjonowania pojedynczego eksperymentu jest używany więcej niż jeden tor, podziel poszczególne biblioteki na dwa tory do sekwencjonowania, aby uwzględnić różnice techniczne między torami podczas sekwencjonowania.

9. lllumina Czytaj czyszczenie

UWAGA: Rysunek 2 podsumowuje część tego protokołu dotyczącą bioinformatyki. Pełna lista wszystkich programów i zasobów używanych w sekcji bioinformatycznej niniejszego protokołu znajduje się w Tabeli 1. Ponadto plik uzupełniający 1 zawiera przykłady wiersza poleceń dla każdego z następujących kroków protokołu bioinformatycznego.

  1. Użyj ssaha229 (Tabela 1), aby zidentyfikować dopasowania 95% tożsamości lub wyższej do bazy danych NCBI UniVec Core (Tabela 1), sekwencji rRNA A. albopictus (GenBank #L22060.1) i adapterów sekwencjonowania (szczegółowe przykłady wiersza poleceń podane w pliku uzupełniającym 1). Usuń odczytane pary z dopasowaniami za pomocą Perla lub podobnego narzędzia skryptowego, na przykład poprzez dostosowanie dostarczonego skryptu Perla (Plik uzupełniający 2).
  2. Wyczyść pozostałe odczyty za pomocą pakietu SolexaQA30 (Tabela 1; Plik uzupełniający 1): przycinanie regionów z wynikiem phred odpowiadającym wartości mniejszej niż 20 przy użyciu domyślnych ustawień DynamicTrim.pl.
    1. Usuń odczyty krótsze niż 25 bp z LengthSort.pl jednocześnie odczytami do przodu i do tyłu. Oceń jakość oczyszczonych plików fastq za pomocą FastQC (Tabela 1) — w szczególności sprawdź, czy jakość sekwencji podstawowej i wyniki jakości dla sekwencji są wyższe niż 20.

10. Normalizacja cyfrowa

  1. Wykonaj jedną rundę normalizacji cyfrowej na oczyszczonych odczytach za pomocą narzędzia khmer31 (Tabela 1; Plik uzupełniający 1), w szczególności normalize-by-median.py (przy użyciu rozmiaru k-mer 20, odcięcia pokrycia 20 i x = 1e10).
  2. Alternatywnie, jeśli dostępna jest maszyna z dużą ilością pamięci RAM (setki GB), użyj skryptu normalize_by_kmer_coverage.pl Trinity (Tabela 1).

11. Zespół transkryptomu De Novo

  1. Uzyskaj dostęp do komputera lub klastra komputerowego z maksymalnie 256 GB pamięci RAM i 24 procesorami, w zależności od wielkości zestawu.
  2. Użyj Trinity32 (Tabela 1; Plik uzupełniający 1), aby złożyć cyfrowo znormalizowany zestaw odczytu w kontigi. Aby zmniejszyć użycie pamięci, użyj polecenia --min_kmer_cov 2.

12. Ocena montażu

  1. Uruchom assemblathon_stats.pl z projektu Assemblathon233 w danych wyjściowych kontigu Trinity. Ten skrypt wykonuje podstawowe obliczenia istotne dla oceny jakości zespołu, takie jak liczba rusztowań, N50, skład zespołu i inne (Tabela 1; Plik uzupełniający 1).

13. Adnotacja złożonego transkryptomu

  1. Wykonać Blastx (Tabela 1) zespołu w stosunku do zestawu białek odniesienia; dla komarów Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens i Aedes aegypti są odpowiednimi odniesieniami. W szczególności sformatuj białko referencyjne fasta file dla blast, a następnie blastx (Supplemental File 1).

14. Mapa jest odczytywana do zespołu za pomocą RSEM34 (tabela 1)

  1. Utwórz plik "mapa transkryptu do genu", w którym pierwsza kolumna zawiera identyfikatory genów referencyjnych, a druga kolumna identyfikatory contig. W edytorze arkuszy kalkulacyjnych zamień pierwszą i drugą kolumnę z danych wyjściowych Blastx i zapisz te kolumny w pliku .txt. Użyj programu LineBreak, aby przekonwertować znaki końca wiersza w wynikowym pliku .txt na format uniksowy.
  2. Utwórz referencyjny zestaw danych z pliku fasta transkryptomu przy użyciu skryptu rsem-prepare-reference dostarczonego w pakiecie RSEM (plik uzupełniający 1).
  3. Wartości wyrażeń należy obliczać oddzielnie dla każdej biblioteki za pomocą polecenia rsem-calculate-expression znajdującego się w pakiecie RSEM (plik uzupełniający 1). Jako odczyty użyj sparowanych plików fastq wynikających z kroku czyszczenia odczytu (krok 9.2).
    1. Jeśli RNA z replikaty biologicznej zostało podzielone na dwie linie w celu sekwencjonowania, uwzględnij oba pliki fastq w obliczeniach wyrażenia, aby wygenerować pojedynczy plik.
  4. Przekonwertuj wyniki wyrażeń z każdej biblioteki na macierz łatwo przetworzoną przez inne programy za pomocą dostarczonego skryptu rsem-generate-data-matrix, dostarczonego w pakiecie RSEM (plik uzupełniający 1).

15. Analiza wyrażeń różnicowych

  1. Zainstaluj R i EdgeR (Tabela 1).
  2. Użyj read.delim, aby załadować wyniki RSEM z kroku 14.3 (Plik uzupełniający 1). W razie potrzeby zaokrąglij liczniki do najbliższej liczby całkowitej.
    UWAGA: Przewodnik EdgeR zaleca ograniczenie zestawu danych do genów o wystarczająco wysokiej ekspresji, aby wykryć istotność.
  3. Aby sformatować dane dla EdgeR, należy wygenerować obiekt DGEList z załadowanego pliku danych (Plik uzupełniający 1). Następnie znormalizuj dane przy użyciu normalizacji TMM (plik uzupełniający 1). Oszacuj typowe i tagowe rozproszenia danych (plik uzupełniający 1).
  4. Zidentyfikuj geny o zróżnicowanej ekspresji za pomocą skorygowanej wartości p Benjaminiego-Hochberga <0,05 (plik uzupełniający 1). Wykreśl rozkład logarytmu-krotności-zmiany w stosunku do obfitości (Plik uzupełniający 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorometria dwóch reprezentatywnych próbek RNA wykazała dwie prążki w odległości około 2,000 nt (Rysunek 1A, B). Rybosomalny RNA 28S owada składa się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych połączonych wiązaniami wodorowymi, które łatwo ulegają zakłóceniu przez krótkie ogrzewanie lub czynniki rozrywające wiązania wodorowe35. Powstałe dwa składniki mają w przybliżeniu taką samą wielkość jak rybosomalny RNA 18S. Druga próbka RNA wykazała wysoki poziom degradacji (ryc. 1B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia metody odkrywania genów o zróżnicowanej ekspresji w wyniku fotoperiodycznie indukowanej diapauzy u A. albopictus. Protokół jest znaczący, ponieważ w unikalny sposób łączy hodowlę komarów i techniki bioinformatyczne, aby wszystkie eksperymentalne aspekty programu fizjologii molekularnej były dostępne dla początkujących użytkowników - w szczególności dla tych, którzy koncentrują się na fotoperiodycznej reakcji diapauzy. Istniejące metody, zgodnie z naszą wiedzą, nie dostarczają tak wielu s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health 5R21AI081041-02 i Georgetown University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inkubator - Model 818Thermo-Scientific3751120 V
Pomieszczenie z kontrolowanym środowiskiemThermax ScientificN/APomieszczenie z kontrolowanym środowiskiem zbudowane zgodnie z niestandardowymi specyfikacjami przez Thermax Scientific Products. Większa alternatywa dla inkubatora. http://thermmax.com/
Cool Żarówka fluorescencyjnaPhilips3921834 W
szalka Petriego 100 mm x 20 mmFisher08-772-E
Bibuła filtracyjna 20,5 cmFisher09-803-6J
9,5 L WiadroPlastikanBway Produktyhttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Użytkowe Moskitiera z tkaniny BiałaJoann10173292http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Pończochy ortopedyczneAlbahealth23650-040nr produktu 081420
Organiczne rodzynkiNewman's OwnUPC: 884284040255
Miseczki do składania jaj (brązowe)Fisher Scientific03-007-52Produkt to w rzeczywistości bursztynowa butelka o pojemności 125 ml, którą widzieliśmy na wierzchu.
Ręczniki papierowe z recyklinguSiódma generacja30BPT120
Modular Mates Kwadratowy zestaw Tupperware Tupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Młynek do szkłaCorning Incorporated7727-2Te młynki do tkanek Tenbroeck rozbijają jaja i uwalniają RNA do odczynnika TRI.
Odczynnik TRISigma AldrichT9424Zastosuj 1 ml odczynnika TRI na 50-100 mg tkanki. Uwaga — Ten odczynnik jest toksyczny.
TURBO DNA-freeAmbion/Life TechnologiesAM1907Ten zestaw generuje większą wydajność niż tradycyjne leczenie DNazą, po którym następuje oczyszczanie fenolu/chloroformu, i jest prostszy w użyciu.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Nakładać obficie na powierzchnie stołu i wszelkie urządzenia, które mogą mieć kontakt z próbkami RNA. Roztwór jest lekko zasadowy/, może powodować podrażnienia i jest szkodliwy po połknięciu.
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AAUmieść do 12 próbek RNA na jednym chipie.
Podajnik membranowy HemotekHemotek 5W1Ten system zapewnia 5 stacji karmienia, które mogą być używane jednocześnie. Zawiera zasilacz PS5 i przewód zasilający; 5 podajników FUI + zbiorniki na mączkę i oringi; Zatyczki plastikowe, membrana zasilająca kolagen Hemotek; Narzędzie do ustawiania temperatury; i narzędzie do wyjmowania wtyczek. Adres korespondencyjny firmy to: Hemotek Sp. z o.o.; Wydział 5 Sąd Związkowy; Droga Alana Ramsbottoma; Wielki Harwood; Lancashire, Wielka Brytania; BB6 7FD; Tel.: +44 1254 889 307.
Cyfrowy termometr i sondaHemotek Termometr MT3KFUMicroT3 i sonda KFU. Służy do ustawiania temperatury każdej jednostki podającej FUI.
Kurczak Krew pełna, niesterylna z cytrynianem soduPel-Freez Biologicals33130-1500 ml krwi zamrożono i przechowywano w 20 ml porcjach w temperaturze -80 ° C przez okres do 1 roku. Rozmrażaj krew w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photoperiodic DiapauseRNA Seq AnalysisAedes AlbopictusDiapause InductionGene Expression ProfilingTranscriptome AssemblyDifferential Expression AnalysisRNA ExtractionIllumina SequencingBioinformatics Workflow

Related Articles