Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych komór galwanotaksji do badania kierunkowej migracji komórek prostaty

Summary

Prezentujemy metodę zastosowania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmiertelnionych komórek prostaty w specjalnie wykonanej komorze galwanotaksji. Za pomocą tej metody wykazujemy, że 2 linie nienowotworowych komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w terenie.

Abstract

Fizjologiczne pole elektryczne służy specyficznym funkcjom biologicznym, takim jak kierowanie migracją komórek w rozwoju zarodka, wzrost neuronów i gojenie się ran nabłonkowych. Zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego do hodowanych komórek in vitro indukuje kierunkową migrację komórek lub galwanotaksję. Demonstrowana tutaj metoda galwanotaksji 2-wymiarowej jest modyfikowana za pomocą wykonanych na zamówienie komór z poli(chlorku winylu) (PVC), szklanej powierzchni, elektrod platynowych i zastosowania zmotoryzowanego stolika, na którym obrazowane są ogniwa. Komory z PVC i elektrody platynowe wykazują niską cytotoksyczność, są niedrogie i nadają się do wielokrotnego użytku. Szklana powierzchnia i zmotoryzowany stolik mikroskopowy poprawiają jakość obrazów i umożliwiają ewentualne modyfikacje powierzchni szkła i obróbkę komórek. Sfilmowaliśmy galwanotaksję dwóch nienowotworowych, unieśmiertelnionych SV40 linii komórek prostaty, pRNS-1-1 i PNT2. Te dwie linie komórkowe wykazują podobne prędkości migracji i obie migrują w kierunku katody, ale wykazują inny stopień kierunkowości w galwanotaksji. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu sugerują, że linie komórkowe pRNS-1-1 i PNT2 mogą mieć różne cechy wewnętrzne, które regulują ich kierunkowe odpowiedzi migracyjne.

Introduction

Endogenne pola elektryczne są wykrywane w różnych tkankach, takich jak skóra ^{1, 32, 33} i mózg ². Fizjologiczne pole elektryczne pełni określone funkcje biologiczne, w tym kieruje rozwojem zarodka ^{3, 4}, kieruje rozwojem procesów neuronalnych ^{5, 6} i sprzyja zamykaniu ran nabłonka i rogówki ^{1, 7}. In vitro zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego do hodowanych komórek naśladuje fizjologiczne pole elektryczne i indukuje kierunkową migrację komórek, czyli galwanotaksję. Galwanotaksję badano w fibroblastach ⁸, keratynocytach ryb ⁹, keratynocytach ludzkiego nabłonka i rogówki ^10-12, limfocytach ¹³, neuroblastach ² i neuronalnych komórkach progenitorowych ¹⁴. Po wystawieniu na działanie zastosowanego pola większość badanych komórek migruje kierunkowo w kierunku bieguna katodowego (-). Jednak kilka komórek rakowych, w tym wysoce przerzutowe ludzkie komórki raka piersi i ludzka linia komórkowa raka prostaty PC-3M, przemieszcza się do bieguna anodowego (+) ^{15, 16}. Zaproponowano kilka mechanizmów pośredniczących w galwanotaksji lub wyjaśniających zdolność komórek do wyczuwania pola elektrycznego, w tym aktywację receptorów EGF ¹², nabłonkowego kanału sodowego ¹⁷, PI3K i PTEN ¹⁸ oraz uwalnianie jonów wapnia ^{15, 19}. Mechanizm ten nie jest jeszcze w pełni poznany i możliwe, że w galwanotaksji zaangażowanych jest wiele szlaków sygnałowych.

Metoda 2-wymiarowej galwanotaksji, którą tutaj demonstrujemy, jest przydatna do scharakteryzowania kierunkowej migracji przylegających, ruchliwych komórek, zarówno do monitorowania migracji pojedynczych komórek ^{10, 12, 17}, jak i migracji arkusza zlewających się komórek ^{18, 20}. Technika ta została zmodyfikowana z Peng i Jaffe²¹ oraz Nishimura et al.¹⁰ z wykonanymi na zamówienie, przezroczystymi komorami z PVC, z wyjmowanymi szkiełkami nakrywkowymi umożliwiającymi łatwe pobieranie komórek po galwanotaksji w celu analizy wtórnej, takiej jak obrazowanie immunofluorescencyjne. Szklana powierzchnia komór galwanitoraksji jest kompatybilna optycznie, co pozwala na filmowanie w dużym powiększeniu i z komórkami znakowanymi fluorescencyjnie. Pozwala również na eksperymentalne projektowanie z modyfikacją powierzchni szkła, taką jak zmiana powłoki powierzchniowej lub ładunków. W komorach zastosowano przekładki wykonane ze szkła nakrywkowego nr 1 w celu zminimalizowania przepływu prądu przez ogniwa; Dlatego ogrzewanie dżulowe, które jest proporcjonalne do kwadratu przepływu prądu, nie przegrzałoby ogniw podczas eksperymentu. Mostki agarowe łączące zapobiegają bezpośredniemu kontaktowi elektrod z komórkami i zapobiegają zmianie pH podłoża lub stężenia jonów podczas galwanoksji.

Dwie nierakotwórcze linie komórek prostaty ludzkiej zostały zbadane pod kątem ich reakcji galwanotoksji w tym badaniu. pRNS-1-1 ²² i PNT2 ²³ są unieśmiertelnionymi SV40, zależnymi od czynnika wzrostu liniami komórkowymi eksprymującymi markery nabłonkowe cytokeratyny 5, 8, 18 i 19 z niską lub zerową ekspresją antygenu specyficznego dla prostaty (PSA). Obie linie komórkowe zachowują wielokątną morfologię normalnych komórek nabłonkowych, ale nieprawidłowość chromosomów zaobserwowano w kariotypowaniu ^{22, 24}. Chociaż pRNS-1-1 i PNT2 mają podobne zachowania w większości eksperymentów, wykazują różnice w tworzeniu struktury groniastej i galwanotaksji. Na matrycy 3D, Matrigel, komórki pRNS-1-1 tworzą puste struktury groniaste o światłach przypominających normalną tkankę gruczołu krokowego ²⁵. Jednak komórki PNT2 tworzą stałe sferoidy bez światła lub spolaryzowanego nabłonka ²⁶. Komórki pRNS-1-1 wykazują również wyższą odpowiedź galwanotaktyczną niż PNT2 w obecnym badaniu. Korelacja między tworzeniem struktury groniastej a galwanotaksją w pRNS-1-1 sugeruje, że sygnały galwanotaktyczne mogą odgrywać rolę w organizowaniu ruchów tkanki gruczołu krokowego w odpowiedzi na endogenne pola elektryczne i dostarczają dalszych cech do rozróżnienia między tymi 2 liniami komórkowymi.

Protocol

1. Hodowla komórek prostaty

1. Hodowla komórek gruczołu krokowego pRNS-1-1 i PNT2 na 100 mm szalkach hodowlanych w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i antybiotyko-antybiotykowym w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Odświeżaj pożywkę hodowlaną codziennie, aż komórki osiągną 80% zbiegu do eksperymentów z galwanotaksją.

2. Montaż komór galwanicznej

1. Montaż studzienek dennych
   1. Przetrzyj plastikową komorę galwanotaksji 2-propanolem. Nałóż uszczelniacz silikonowy klasy morskiej wokół okrągłych otworów na spodzie komory za pomocą strzykawki i przymocuj dużą szklankę nakrywkową (rysunek 1). Użyj tylnej strony bawełnianego aplikatora, aby docisnąć szklankę nakrywkową i zetrzyj nadmiar kleju bawełnianymi wacikami. Okrągłe otwory umożliwiają przepływ medium i prądu elektrycznego przez ogniwa znajdujące się między dwoma wewnętrznymi zbiornikami medium.
   2. Wytnij małe szkło nakrywkowe, aby wykonać przekładki o wymiarach 6 mm x 25 mm za pomocą markera diamentowego.
   3. Odwróć komorę. Nałóż 2 paski kleju silikonowego za pomocą strzykawki i/lub metalowej szpatułki, aby utworzyć powierzchnię kanału o wymiarach 10 mm x 25 mm do mocowania komórek między 2 okrągłymi otworami w dolnej szybie. Przyklej 2 kawałki szklanej przekładki między 2 okrągłymi otworami. Użyj tylnej strony bawełnianych aplikatorów, aby docisnąć przekładki i zetrzyj nadmiar kleju bawełnianymi wacikami i/lub wykałaczkami.
   4. Suszyć komorę przez 24 godziny, aż klej silikonowy się utwardzi. Namocz komorę w wodzie destylowanej na noc, aby usunąć pozostałości kwasu octowego z kleju. Wysuszyć komorę do natychmiastowego użycia lub przechowywać komorę do późniejszego wykorzystania w czystym pojemniku.
      
      Rysunek 1: Montaż dolnej komory galwanotaksji. A) Duża szklana osłona jest przymocowana do dna czystej komory. B) Dwa kawałki szklanych przekładek są przyklejone między 2 okrągłymi otworami, aby utworzyć kanał o wymiarach 10 mm x 25 mm, do którego można przymocować komórki.
2. Komórki wysiewające w komorach galwanotaksji
   1. Przygotuj wymaganą liczbę komór galwanotaksyjnych potrzebnych do eksperymentu. Każda linia komórkowa lub leczenie wymaga pojedynczej komory galwanotaksji. Przetrzyj komory galwanotaksji 2-propanolem. Umyj komory sterylnym PBS 3 razy i sprawdź przepływ cieczy między 2 okrągłymi otworami w komorach.
   2. Zamknąć komory sterylnymi szalkami do hodowli komórkowych i pozostawić do zrównoważenia w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Odłączyć komórki prostaty od szalki hodowlanej za pomocą 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizować trypsynę-EDTA za pomocą 5 ml 10% FBS w PBS.
   3. Przenieść komórki do probówek o pojemności 15 ml i odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 200 x g, 37 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej.
   4. Weź 20 μl roztworu komórkowego, aby załadować go do komory liczącej i obliczyć liczbę komórek. Dostosuj stężenie komórek do 8 x 10⁴ komórek/ml za pomocą pożywki hodowlanej.
   5. Wyjąć komory galwanotaksji z inkubatora o temperaturze 37 °C. Wysiewać 350 μl zawiesiny komórkowej na każdą komorę.
   6. Inkubować komórki w komorach przez noc w naczyniu hodowlanym z mokrym Kimwipe lub w komorze wilgotnościowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .

Rysunek 2: Wysiewanie komórek do komory. Dolna komora jest suszona i czyszczona. A) Komórki prostaty są trypsynizowane, liczone i przenoszone do komory i inkubowane przez noc. B) Górna szklana osłona jest przymocowana w celu uszczelnienia komory przed filmowaniem.

3. Montaż górnych komór
   1. Zamontuj górną komorę przed filmowaniem. Mikroskop może pomieścić obrazowanie tylko jednej komory galwanotaksji w tym samym czasie. Rozgrzać 10 ml pożywki hodowlanej w temperaturze 37 °C dla każdej komory galwanotaksji. Przenieść komorę galwanotaksji z inkubatorów na płytę grzewczą o temperaturze 37 °C.
   2. Przepłucz komórki pożywką hodowlaną, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Pozostawić w komorze 400 μl pożywki. Użyj strzykawki, aby nałożyć smar wysokopróżniowy na obie szklane przekładki.
   3. Dodaj małą szklankę nakryciową, aby uszczelnić komorę. Delikatnie dociśnij szklankę nakrywkową tylną stroną bawełnianego aplikatora. Zetrzyj nadmiar podłoża bawełnianymi wacikami.
   4. Osusz powierzchnię szkła i nałóż smar wysokopróżniowy, aby uszczelnić szczelinę między szkłem nakrywkowym a komorą. Użyj metalowej szpatułki, aby rozprowadzić smar. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej do zbiorników wewnętrznych i sprawdzić przepływ cieczy między zbiornikami.
4. Zrób mostki agarowe
   1. Wytnij parę rurek PVC o długości 2 cali (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), odwróć i włóż je do zlewki o pojemności 100 ml.
   2. Odmierz 200 mg Bacto-Agar i dodaj go do kolby o pojemności 50 ml z 10 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać 2% żel agarowy. Kuchenka mikrofalowa przez 30 sekund. Załaduj żel agarowy do plastikowej rurki za pomocą pipety transferowej. Pozostaw mostki agarowe w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby zestalić agar.
   3. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do zewnętrznych zbiorników komory galwanotaksji. Włóż mostki agarowe do wewnętrznych i zewnętrznych zbiorników pożywki, aby przewodzić prąd.

Rysunek 3: Filmowanie komórek w komorze. Schemat demonstrujący końcowy montaż komory galwanotaksji. Komora jest całkowicie uszczelniona smarem wysokopróżniowym. Dodaje się pożywkę w celu napełnienia zbiorników, a do komory wkłada się dwa mostki agarowe. Następnie komora galwanotaksji jest przenoszona do stolika mikroskopu, a elektrody są mocowane w celu przyłożenia pola elektrycznego. Pokazano widok z boku zmontowanej komory galwanotaksji, aby pokazać, że prąd elektryczny przepływa przez ogniwa przez mostki agarowe i przestrzeń między szkłem nakrywkowym.

3. Obrazowanie poklatkowe

1. Włączyć komorę środowiskową do 37 °C z 5% CO₂ w powietrzu obiegowym na 2 godziny przed obrazowaniem.
2. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do pozyskiwania obrazu. Skalibruj stolik mikroskopu i wybierz obiektyw 10X.
3. Przenieś komory galwanotaksji na stolik mikroskopu, zabezpiecz komorę taśmą i skup się na komórkach. Włóż elektrody galwanotaksji do zewnętrznych zbiorników z katodą po prawej stronie. Zabezpiecz drut i elektrody taśmą.
4. Włącz skrzynkę zasilającą, aby przyłożyć pole elektryczne do komory. Zmierz napięcie wyjściowe za pomocą woltomierza w poprzek komory, aby osiągnąć 2.5 V dla komory o długości 25 mm (100 mV/mm). Utrzymuj natężenie pola podczas eksperymentu, regulując prąd wyjściowy.
5. Wybierz 10 punktów w komorze, aby sfilmować w oprogramowaniu, aby wygenerować dziesięć filmów poklatkowych. Ustaw warunki pozyskiwania w 10-minutowych odstępach przez 2 godziny.
6. Rozpocznij filmowanie i dostosuj prąd wyjściowy zgodnie z potrzebami.
7. Pod koniec eksperymentu wyjmij komorę ze sceny i utrwal komórki 95% alkoholem. Otwórz komorę żyletką, aby ją wyczyścić i ponownie użyć.

4. Kwantyfikacja Galvanotaksji

1. Obróć filmy poklatkowe i zmień orientację katody na górze obrazów. Eksportuj filmy do oprogramowania do śledzenia komórek.
2. Ręcznie śledź pozycję (x,y) 10-20 komórek w każdym punkcie czasowym każdego filmu (Rysunek 4 A, B). Odległości migracji i kąty względem kierunku północ-południe, ta sama orientacja pola elektrycznego, zostaną obliczone w oprogramowaniu do śledzenia komórek (rysunek 4C).
   UWAGA: Średnia prędkość migracji jest przeliczana na podstawie całkowitej odległości migracji i całkowitego czasu filmowania. Kierunkowość jest konwertowana z kątów na wartość cosinusową. Jeśli komórki migrują z losową kierunkowością, średnia cosinusa netto będzie bliska zeru. Jeśli komórki migrują bezpośrednio w kierunku katody, wartość cosinusa wyniesie +1. Jeśli komórki migrują bezpośrednio w kierunku anody, wartość cosinusa wyniesie -1.

Rysunek 4: Śledzenie komórek w celu zmierzenia kierunkowości. A) Nałożenie linii śledzenia na obrazy komórek. Pozycje (x, y) komórek są ręcznie śledzone w filmach poklatkowych. Jeśli komórki migrują losowo, średni cosinus jest bliski zeru. B) Jeśli jednak ogniwa migrują w kierunku katody lub anody, wartość średniego cosinusa jest bliska + (katoda) lub – (anoda) 1,0. C) Kierunkowość jest przedstawiana przez wartość cosinusową, która jest przeliczana z kątów migracji (θ). Cosinus (θ) jest równy stosunkowi odległości a (odległości migracji) do odległości b (odległości rzutowanej na kierunek pola elektrycznego).

3. Zapisz pomiary. Zaimportuj dane do aplikacji bazy danych, aby obliczyć połączone wyniki.
4. Wyeksportuj połączone dane dotyczące średniej prędkości migracji i średniej wartości cosinusa do arkusza kalkulacyjnego, aby wykreślić wykresy słupkowe (Rysunek 5).

Results

Dwie linie komórek prostaty (pRNS-1-1 i PNT2) zostały zbadane tą metodą. Komórki w obu liniach migrują z podobną prędkością 1,0 +/- 0,3 mikrona/min w ciągu 2 godzin (rysunek 5A). Jednak kierunkowość pola elektrycznego wynosi 0,7 +/- 0,3 dla linii pRNS-1-1 i 0,2 +/- 0,8 dla linii PNT2 (rysunek 5B). Wyniki pokazują znaczącą różnicę w galwanotaksji tych dwóch linii komórkowych (p<0,01, śledzono 100 komórek), co sugeruje, że mają one różne mechanizmy sygnalizacji komórkowej, które skutkuj...

Discussion

Analiza odpowiedzi galwanotaksji komórki była ważnym wskaźnikiem funkcjonalnym dla wielu procesów migracji lub wzrostu komórek ^{27, 28}. Tutaj używamy specjalnie wykonanej komory ze szklaną powierzchnią do filmowania dwóch linii komórek prostaty. Te linie komórkowe wykazały różne stopnie galwanotaksji i spekulujemy, że wewnątrzkomórkowa lokalizacja lub aktywacja białek pośredniczących w galwanotaksji może być zakłócona podczas procesu generowania nieśmiertelnych linii komórkowych, co skutkuje obserwowaną różnicą...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
komórki
pRNS-1-1 komórki			Lee, et al. (1994)
PNT2 komórki prostaty	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium i roztwory
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	rozgrzać do 37 stopni C przed użyciem
Płodowa surowica bydlęca - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% w PBS, rozgrzej do 37 &stopni; C przed użyciem
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)	Life Technologies	15240	dodać 5 ml do 500 ml pożywki
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4 w 1,000 ml H2 O, pH do 7,4 i autoklawowane, podgrzać do 37 & stopni; C przed użyciem
0,25% Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056	rozgrzać do 37 stopni; C przed użyciem traktuj komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 &; C
Urządzenie do galwanotaksji
komory galwanotaksyjne	Precision Plastics Inc, CA		Specjalnie zaprojektowane (1/4" x 2" x 3,5"), nietoksyczne, przezroczyste komory z PVC. Prosimy o kontakt z autorami w celu uzyskania specyfikacji projektu.
Elektrody galwanotaksyjne		elektryczny UCD	Platynowe elektrody zwijane z elastycznymi przewodami Skrzynka
zasilająca Galvanotaxis	Substrate Engineering, CA		Specjalnie zaprojektowana moc wyjściowa prądu stałego z woltomierzem
Szkło pokrywowe mikroskopu, duże, 45 x 50 mm, nr 1.5	Fisher	12-544-F
Szkło osłonowe mikroskopu, małe, 25 x 25 mm, nr 1	ThermoScientific	3307
Diamentowy marker punktowy	ThermoScientific	750
Uszczelniacz silikonowy klasy morskiej, przezroczysty	3M	051135-08019
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning	2021846-0807
Strzykawka 6 ml	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Strzykawka, 1,5 ml	Nichiryo	SG-M
Aplikatory bawełniane	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Rury PVC Johnson	729389
Nalgene 180	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	przygotuj 2% roztwór agaru
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Wirówka stołowa	Eppendorf	5810R	obsługiwana z wirnikiem A-4-62
Celometr Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Komory zliczające celometr	Nexcelom	CHT4-SD100-002	obciążenie 20 μ l roztwory komórkowe do liczenia
Kultura Temp Płyta grzewcza	Bel-Art Scienceware	370150000	do utrzymywania komór galwanotaksji na poziomie 37 & stopni; C
Mikroskop Eclipse TE-2000 ze zmotoryzowanym stolikiem i komorą środowiskową	Obiektyw Nikon
Plan Fluor 10X/0,30	Nikon
Retiga EX CCD	Qimaging		Chłodzony przetwornik CCD camara, monokolorowy, 12-bitowy
Sprężone powietrze z 5% CO2	Airgas		na specjalne zamówienie
Volocity 6.3	PerkinElmer		Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Oprogramowanie śledzące komórki i dostosowane do pomiaru kątów migracji
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 dla komputerów Mac	Microsoft