Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Akwizycja wysokiej jakości cyfrowego wideo larw Drosophila i zachowań dorosłych z perspektywy bocznej

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51981

⸱

4 października 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Willamette University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną technikę mikroskopową, która pozwala uzyskać wysokiej jakości cyfrowe wideo z fenotypami dorosłych i larw zmutowanych Drosophila z perspektywy bocznej.

Streszczenie

Drosophila melanogaster to potężny eksperymentalny system modelowy do badania funkcji układu nerwowego. Mutacje genów, które powodują dysfunkcję układu nerwowego, często wytwarzają zdolne do życia larwy i dorosłe osobniki, które mają fenotypy z wadami lokomocji, które trudno jest odpowiednio opisać tekstem lub całkowicie przedstawić za pomocą jednego obrazu fotograficznego. Obecne sposoby publikowania naukowego wspierają jednak składanie cyfrowych nośników wideo jako materiału uzupełniającego do manuskryptu. W tym artykule opisujemy prostą i powszechnie dostępną technikę mikroskopową służącą do pozyskiwania wysokiej jakości cyfrowych filmów wideo zarówno larw, jak i dorosłych fenotypów Drosophila z perspektywy bocznej. Wideo lokomocji larw i dorosłych osobników z boku jest korzystne, ponieważ umożliwia obserwację i analizę subtelnych różnic i zmian w nieprawidłowych zachowaniach lokomotywy. Z powodzeniem wykorzystaliśmy tę technikę do wizualizacji i ilościowego określenia nieprawidłowych zachowań pełzania u larw w trzecim stadium rozwojowym, a także dorosłych zmutowanych fenotypów i zachowań, w tym pielęgnacji.

Wprowadzenie

Pospolita muszka owocowa Drosophila melanogaster to potężny eksperymentalny system modelowy do badania funkcji układu nerwowego1-3. Ewolucyjne zachowanie budowy i funkcji układu nerwowego u człowieka, a także łatwość manipulacji genetycznych i szeroki wachlarz narzędzi genetycznych sprawiają, że Drosophila jest pierwszym organizmem do modelowania chorób neurodegeneracyjnych człowieka4. Mutacje genów, które powodują dysfunkcję układu nerwowego, często skutkują żywotnymi zmutowanymi larwami i dorosłymi Drosophila z upośledzoną lokomocją. Fenotypy obserwowane u mutantów z wadami układu nerwowego obejmują zmniejszoną szybkość poruszania się, nieprawidłową koordynację i ruchy spastyczne u dorosłych, a także deficyty w perystaltycznym skurczu mięśni ściany ciała i częściowy paraliż larw. Fenotypy te zostały wykorzystane w rozwoju wysokoprzepustowych genetycznych badań przesiewowych i testów lokomocji zmutowanych larw5,6 i dorosłych7-10 Drosophila, mających na celu ilościowe określenie upośledzenia lokomocji i identyfikację genów niezbędnych do funkcjonowania układu nerwowego. Chociaż podejścia te są niezwykle przydatne do ilościowego określania zachowań larw i dorosłych osobników lokomucyjnych, nie są one w stanie przekazać jakościowych informacji o każdym konkretnym nieprawidłowym zachowaniu. Na przykład, podczas gdy zmutowane larwy trzeciego stadium rozwojowego mogą wykazywać zmienione parametry lokomocji w teście behawioralnym, może być niejasne, czy jest to wynikiem zmian w rytmicznych skurczach perystaltycznych podczas cyklu pełzania, ogólnego braku koordynacji, czy częściowego paraliżu mięśni tylnej ściany ciała. W tym miejscu opisujemy prostą i szeroko dostępną technikę mikroskopową służącą do pozyskiwania wysokiej jakości cyfrowych filmów fenotypów dorosłych i larw lokomotyw Drosophila z perspektywy bocznej. Cyfrowe wideo pozyskane z perspektywy bocznej pozwala na bezpośrednią obserwację i analizę subtelnych różnic w zachowaniach lokomotyw z bardziej pouczającej orientacji bocznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. System mikroskopu stereoskopowego

Uwaga: Chociaż ten protokół można łatwo dostosować do praktycznie każdego systemu mikroskopu stereoskopowego połączonego z kamerą cyfrową z możliwością pozyskiwania wideo, szczegóły są podane na temat systemu używanego w naszym laboratorium (Tabela materiałów/sprzętu).

  1. Rejestruj cyfrowe wideo za pomocą trójokularowego mikroskopu stereoskopowego sprzężonego z komercyjną kamerą cyfrową.
  2. Aby podłączyć komercyjną kamerę cyfrową do portu trójokularowego mikroskopu stereoskopowego, należy usunąć mocowanie C 1/2x z portu lampy fotometrowej mikroskopu stereoskopowego i zastąpić je mocowaniem 1X C.
  3. Zamontuj łącznik do aparatu cyfrowego (gwint 43 mm) do mocowania 1X C-mount.
  4. Zamontuj dwa pierścienie obniżające napięcie, od 58 mm do 48 mm i od 48 mm do 43 mm, do złącza aparatu, aby zmostkować połączenie między złączem aparatu cyfrowego a zestawem adaptera obiektywu do aparatu cyfrowego.
  5. Zamontuj aparat cyfrowy w zestawie adaptera obiektywu.
  6. Rejestruj wideo za pomocą mikroskopu, powiększenia i zoomu optycznego zestawu aparatu cyfrowego, aby uzyskać łączne powiększenie około 12x (30 klatek na sekundę, 640 x 480 pikseli). Uwaga: Powiększenie mikroskopu stereoskopowego musi być skompensowane zgodnie z nowo skonfigurowanym mocowaniem 1X C portu trinokularowego.

2. Obrazowanie larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila

  1. Przyklej marker permanentny do czarnej płytki scenicznej mikroskopu stereoskopowego sprzężonego z kamerą cyfrową tak, aby bok nasadki markera zajmował około 1/3 do 1/4 pionowego pola widzenia obserwowanego na monitorze LCD kamery. Użyj wierzchołków markerów jako sceny do wykonywania obrazowania larw, ponieważ są one dostępne w różnych kolorach, które można wykorzystać do kodowania kolorami i różnicowania genotypów obrazowanych larw.
  2. Odznacz pole widzenia obserwowane na monitorze LCD aparatu cyfrowego na powierzchni górnej części znacznika za pomocą cienkiego znacznika punktowego.
  3. Wybierz trzecią larwę w stadium rozwojowym do sfotografowania. Kryteriami wyboru larw w trzecim stadium rozwojowym były: długość ciała, wyłanianie się ze źródła pożywienia w fazie larwalnej cyklu życiowego, obecność przetchlinków przednich i tylnych oraz budowa haków żuchwy aparatu gębowego11. Upewnij się, że larwa jest czysta, myjąc ją dokładnie w wodzie.
  4. Oświetl górny stopień markera permanentnego od góry światłem z systemu oświetlenia światłowodowego. Dostosuj kąt padania światła, aby zapewnić optymalne oświetlenie.
  5. Ustaw ostrość mikroskopu na krawędzi górnej części markera permanentnego. Rozpocznij pobieranie cyfrowego wideo.
  6. Umieść larwę z boku nasadki znacznika w odległości około 75° od osi pionowej, tuż poza polem widzenia, z przednią częścią larwy skierowaną w stronę pola widzenia (ryc. 1). Uwaga: Umieszczenie larwy z boku nasadki markera pozwala kamerze rejestrować ruch larwy z perspektywy bocznej. Pomaga utrzymać wilgotność larwy w wodzie, dzięki czemu nie spadają z boku nasadki markera. Należy jednak uważać, aby nie używać zbyt dużej ilości wody, ponieważ nadmierne ilości będą przylegać do larwy podczas czołgania się po polu.
  7. Delikatnie szturchnij i szturchnij larwę małym pędzlem, aby zmusić ją do czołgania się po polu widzenia. Uzbrój się w cierpliwość, ponieważ larwy rzadko współpracują i często muszą być wielokrotnie zwracane do punktu wyjścia, zanim przeczołgają się prosto przez pole.
  8. Nagraj około 10-15 minut nieprzerwanego cyfrowego materiału wideo, a następnie przytnij i usuń cały niepotrzebny materiał po akwizycji za pomocą oprogramowania do cyfrowej edycji wideo.

3. Obrazowanie dorosłej Drosophila

  1. Umieść pojedynczą dorosłą Drosophilę w jednorazowej kuwecie spektroskopowej z polistyrenu o pojemności 1,5 ml.
    Uwaga: Znieczulenie CO2 dorosłych Drosophila bezpośrednio przed protokołem analizy behawioralnej może pogorszyć wyniki12. Zaleca się, aby dorosłe Drosophila otrzymały 24-godzinny okres na powrót do zdrowia po znieczuleniu CO2 przed wykonaniem testu behawioralnego13.
  2. Zatkaj koniec kuwety małym wacikiem. Upewnij się, że wacik jest wystarczająco ciasno zapakowany, aby zajmował dużą przestrzeń na nasadkę i ograniczał muchę do komory o zmniejszonej objętości kuwety.
  3. Umieść kuwetę na białym stage płytka mikroskopu stereoskopowego i odpowiednio wyrównaj komorę zmniejszonej objętości kuwety z polem view na monitorze LCD aparatu cyfrowego.
  4. Oświetl kuwetę od góry światłem z systemu oświetlenia światłowodowego. Dostosuj kąt padania światła, aby zapewnić optymalne oświetlenie.
  5. Ustaw ostroskop i rozpocznij nagrywanie cyfrowego wideo.
  6. Nagraj około 30-45 minut nieprzerwanego cyfrowego materiału wideo, a następnie przytnij i usuń wszystkie niepotrzebne nagrania po akwizycji za pomocą oprogramowania do cyfrowej edycji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z sukcesem zastosowaliśmy tę technikę do pozyskania i ilościowego określenia fenotypu behawioralnego larw związanego z utratą funkcji genu stathmin (Rysunek 2)14. Gen stathmin koduje białko regulacyjne mikrotubul, które oddziela dimery tubuliny od pul soluble tubuliny, wiąże mikrotubule i promuje ich depolimeryzację15,16. Funkcja statminy jest niezbędna do utrzymania integralności mikrotubul w aksonach nerwów obwodowych14. Zaburzenie aktywności statminy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Siła Drosophila melanogaster jako modelowego systemu do badania funkcji układu nerwowego wynika w dużej mierze z konwergencji dostępnych potężnych narzędzi genetycznych i szerokiego wachlarza opracowanych solidnych testów behawioralnych. Poniżej przedstawiamy prostą i szeroko dostępną technikę mikroskopową do pozyskiwania wysokiej jakości cyfrowego wideo fenotypów dorosłych i larw lokomotyw Drosophila z perspektywy bocznej. Z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście do scharakteryzowania i ilościowego ok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Alexandrze Opie za pomoc techniczną i wsparcie, Jamesowi Bartonowi za dostarczenie narracji wideo oraz Ramonie Flatz i Joellen Sweeney za pojawienie się w dołączonym filmie. Praca ta była wspierana przez M.J. Murdock Charitable Trust (grant nr 2012205 dla JED).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trójokularowy mikroskop stereozoomowyOlympus CorporationSZ6145TR½ C-mount został usunięty i zastąpiony przez 1X C-mount
1X C-mountLeeds Precision InstrumentsLSZ-1XCMT2
Łącznik do aparatu cyfrowego (gwint 43 mm)Qioptiq Imaging Solutions25-70-10-02
Pierścień obniżający napięcie od 58 mm do 48 mmB& H VideoGBSDR5848
48 mm do 43 mm Pierścień obniżający poziom B& H VideoGBSDR4843
Zestaw adapterów Lensmate do Canon G10LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Aparat cyfrowyCanon USA, Inc.
1,5 ml kuweta spektroskopowa z polistywonuDenville ScientificU8650-4

Bibliografia

  1. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  2. Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
  3. Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
  4. Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
  5. Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
  6. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
  7. Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
  8. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250(2012).
  9. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
  10. Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247(2012).
  11. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
  12. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  14. Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244(2013).
  15. Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
  16. Cassimeris, L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol. 14, 18-24 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zachowanie larw Drosophilazachowanie dorosłych osobników Drosophilawideo z perspektywy bocznejkonfiguracja stereomikroskopusprzęganie kamery cyfrowejtechnika obrazowania larwograniczanie przestrzeni dorosłych muchprotokół akwizycji wideoanaliza fenotypu behawioralnegorejestracja wideo mikroskopowego
Akwizycja wysokiej jakości cyfrowego wideo larw Drosophila i zachowań dorosłych z perspektywy bocznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.