Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

Podsumowanie

Szybki preparat bakteryjny z dodatniego posiewu krwi może być użyty jako próbka do zastosowań takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF, barwienie metodą Grama, testowanie wrażliwości na antybiotyki i test oparty na PCR. Wyniki mogą być szybko przekazywane klinicystom w celu poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

Streszczenie

Zakażenia krwi i sepsa są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Pomyślny wynik leczenia pacjentów cierpiących na bakteriemię zależy od szybkiej identyfikacji czynnika zakaźnego w celu ukierunkowania optymalnego leczenia antybiotykami. Analiza barwień metodą Grama z dodatniego posiewu krwi może być szybko przeprowadzona i już teraz znacząco wpływa na schemat antybiotykowy. Jednak dokładna identyfikacja czynnika zakaźnego jest nadal wymagana w celu ustalenia optymalnego leczenia celowanego. Przedstawiamy tutaj prosty i szybki preparat osadów bakteryjnych z dodatniej liczby kultur krwi, który można wykorzystać jako próbkę do kilku istotnych dalszych zastosowań, takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF MS, badanie wrażliwości na antybiotyki (AST) za pomocą testu dyfuzji krążka lub zautomatyzowanych systemów AST oraz za pomocą zautomatyzowanych testów diagnostycznych opartych na PCR. Wydajność tych różnych systemów identyfikacji i AspAT stosowanych bezpośrednio na osadach bakteryjnych z hodowli krwi jest bardzo podobna do wydajności zwykle uzyskiwanej z izolowanych kolonii hodowanych na płytkach agarowych. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, szybkie pozyskanie osadu bakteryjnego znacznie skraca czas zgłaszania zarówno identyfikacji, jak i AspAT. W związku z tym, po dodatnim wyniku posiewu krwi, identyfikacja za pomocą MALDI-TOF może być zgłoszona w czasie krótszym niż 1 godzina, podczas gdy wyniki AST za pomocą zautomatyzowanych systemów AST lub testów dyfuzji krążków odpowiednio w ciągu 8 do 18 godzin. Podobnie, wyniki szybkiego testu opartego na PCR mogą być przekazane klinicystom w czasie krótszym niż 2 godziny od zgłoszenia bakteriemii. Łącznie wyniki te pokazują, że szybkie przygotowanie osadu bakteryjnego do posiewu krwi ma znaczący wpływ na identyfikację i czas realizacji AST, a tym samym na pomyślne wyniki leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

Wprowadzenie

Zakażenia krwi i sepsa u hospitalizowanych pacjentów są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Tak więc śmiertelność związana z zakażeniami krwi obserwuje się u około 14% do 37% hospitalizowanych pacjentów i może wzrosnąć do 35% u pacjentów oddziałów intensywnej terapii ^1-3. Szybka identyfikacja czynnika zakaźnego ma zasadnicze znaczenie dla ukierunkowania optymalnego leczenia przeciwbakteryjnego i zwiększenia pomyślnego wyniku terapii przeciwbakteryjnej ^4,5. Szybka analiza barwień metodą Grama z dodatniego posiewu krwi ma już znaczący wpływ na adaptację terapii przeciwdrobnoustrojowej ^6,7, ale dokładna identyfikacja czynnika zakaźnego jest wymagana, aby zapewnić pacjentom najlepiej przystosowane leczenie antybiotykami. Na przykład po bakteriemii enterokoków i paciorkowców, które są trudne do odróżnienia za pomocą barwienia metodą Grama, konieczne jest wdrożenie różnych schematów leczenia antybiotykami. Podobnie, identyfikacja na poziomie gatunku jest wymagana w celu wykrycia enterobakterii Gram-ujemnych kodujących chromosomalny gen ampC, który nadaje zwiększoną oporność na β-laktamy ⁸.

Przy dodatnim posiewie krwi, konwencjonalnym podejściem diagnostycznym jest subhodowla czynnika zakaźnego na różnych płytkach agarowych, co wymaga kilku godzin dodatkowej inkubacji przed identyfikacją za pomocą różnych metod, w tym testów biochemicznych, wzrostu na różnych selektywnych pożywkach i zautomatyzowanych systemów identyfikacji mikrobiologicznej. Czas oczekiwania na wyniki konwencjonalnego podejścia diagnostycznego wynosi około 1 do 3 dni.

Pojawienie się technologii spektrometrii mas z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) do szybkiej identyfikacji mikroorganizmów dostarczyło nowego narzędzia do szybkiej identyfikacji mikroorganizmów z kolonii hodowanych na płytkach agarowych, ale także bezpośrednio z dodatnich kultur krwi (Rysunek 1) ^9-12. Zastosowanie MALDI-TOF do identyfikacji czynnika zakaźnego na podstawie posiewów krwi znacznie skróciło czas oczekiwania na wyniki do kilku minut zamiast godzin i dni wymaganych tradycyjnymi metodami. Jak omówili Croxatto i wsp. ¹³, skuteczność identyfikacji MALDI-TOF zależy od różnych parametrów, w tym czystości i ilości mikroorganizmu. Te dwa kryteria można łatwo uzyskać z dyskretnych kolonii hodowanych na płytkach agarowych, ale wymagały one obróbki wstępnej w celu wzbogacenia i oczyszczenia bakterii ze złożonych próbek, takich jak hodowla krwi, które zawierają wiele składników komórkowych i białkowych, które mogą zakłócać identyfikację MALDI-TOF.

Różne metody izolacji mikroorganizmów z hodowli krwi były używane w wielu badaniach, w tym saponina lub inne łagodne detergenty metoda ekstrakcji bakteryjnej ^9,14, metoda separatora surowicy ¹⁰, metody wirowania lizy ¹² i komercyjne rozwiązania, takie jak zestaw sepsityper. Nasze bakteriologiczne laboratorium diagnostyczne opracowało prosty preparat osadów bakteryjnych do hodowli krwi na bazie lizy erytrocytów chlorku amonu, który umożliwia szybką identyfikację bakterii i drożdży za pomocą MALDI-TOF i automatycznych systemów identyfikacji (ryc. 2) ¹⁵. Ten preparat osadów z hodowli krwi stanowi również próbkę do innych bezpośrednich zastosowań końcowych, takich jak barwienie metodą Grama, zautomatyzowane testy diagnostyczne oparte na PCR, TAKIE JAK POCT-PCR do szybkiego wykrywania opornego na metycylinę Staphyloccocus aureus (MRSA) oraz testowanie wrażliwości na antybiotyki za pomocą zautomatyzowanych systemów AST i / lub testów dyfuzji krążkowej na płytkach agarowych (ryc. 3).

W tej pracy opisujemy różne etapy przygotowania osadu bakteryjnego z hodowli krwi, jak wyjaśnili Prod'hom et al.¹⁵ (Rysunek 4). Opiszemy również protokoły dla trzech głównych zastosowań, które można wykonać na osadach do hodowli krwi: identyfikacja za pomocą MALDI-TOF ¹⁵, identyfikacja (ID) i badanie wrażliwości na antybiotyki (AST) za pomocą zautomatyzowanych systemów ¹⁶ dla Enterobacteriaceae i gronkowców oraz zautomatyzowany test diagnostyczny oparty na PCR do wykrywania MRSA ¹⁷.

Protokół

Ten protokół został opracowany i zweryfikowany zgodnie z procesami badawczo-rozwojowymi oraz zasadami etycznymi naszej instytucji, zanim został wdrożony jako rutynowe narzędzie.

1. Przygotowanie osadu bakteryjnego z krwi za pomocą procedury lizy erytrocytów chlorku amonu

1. Przygotowanie dodatniego posiewu krwi do późniejszego odwirowania.
   1. Wysterylizuj nasadkę do hodowli krwi. Dodaj 70% etanolu na nakrętkę butelki i spal go.
      UWAGA: Nie wykonuj tego kroku pod okapem z przepływem laminarnym.
   2. Przenieś butelkę do okapu z przepływem laminarnym. Zebrać 5 ml posiewu krwi za pomocą strzykawki 20 G.
   3. Dodać 5 ml posiewu krwi do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 45 ml sterylnej wody (_H2O) i wymieszać próbkę.
2. Przygotowanie osadu bakteryjnego do hodowli krwi przez wirowanie lizy.
   1. Odwirować próbkę o masie 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Usunąć supernatant (który zawiera głównie_H2Oi komórki krwi) za pomocą laboratoryjnej pompy próżniowej.
   3. Zawiesić osad w 1 ml domowego roztworu lizy chlorku amonu (0,15 M NH₄Cl, 1 mM KHCO₃). Rozbić osad przez zeskrobywanie i wirowanie probówki, a następnie odwirować próbkę o sile 140 x g przez 10 minut w temperaturze suchej masy.
   4. Odrzucić sklarowany stężenie, które zawiera głównie resztki czerwonych krwinek.
      1. Jeśli osad pozostał krwotoczny, należy go ponownie zawiesić w 2 ml sterylnego i destylowanego H₂0 w celu dalszej lizy pozostałych krwinek czerwonych i przepłukania osadu. Odwirować próbkę o masie 140 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   5. Zawiesić osad w 200 μl_H2O
3. Subkultura posiewu krwi na różnych selektywnych i nieselektywnych pożywkach agarowych.
   1. Zebrać 1 ml posiewu krwi za pomocą strzykawki 20 G.
   2. Zaszczepić 1 kroplę kultury krwi w czterech ćwiartkach na agarze z krwią, agarze czekoladowym, agarze McConkeya i agarze Schaedlera.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C płytki agaru z krwią i agarem czekoladowym w atmosferze 5%_CO2, agar McConkey w normalnej atmosferze, a płytkę agarową Schaedlera w warunkach beztlenowych.
   4. Śledź rozwój bakterii na różnych podłożach.
   5. Sprawdź czystość bakteryjną.

2. Identyfikacja przez MALDI-TOF MS

1. Bezpośrednia identyfikacja na podstawie osadu krwi.
   1. Przenieść 1 μl osadu krwi na tarczę tarczową MALDI i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C.
   2. Nałożyć na próbkę 1 μl 70% kwasu mrówkowego i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C.
   3. Nałożyć na próbkę 1 μl matrycy MALDI (nasycony roztwór kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego w 50% acetonitrylu-2,5% kwasie trifluorooctowym) i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C.
   4. Przejdź do analizy MALDI-TOF MS za pomocą systemu MALDI-TOF MS zgodnie z opisem producenta.
   5. Jeżeli wynik identyfikacji jest nieważny na poziomie gatunku (na przykład z wynikiem < 2), należy przeprowadzić ekstrakcję białkową próbki osadu krwi.
2. Identyfikacja po ekstrakcji białka z osadu hodowli krwi.
   1. Zmieszać 20 μl osadu z 1 ml 70% etanolu i odwirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   2. Odrzucić sklarowany osad i dodać do osadu 25 μl 70% kwasu mrówkowego i 25 μl 100% acetonitrylu. Energicznie wirować, aby ponownie zawiesić granulki. Ponownie zawieś twarde granulki, rozbijając je końcówkami pipet przed wirowaniem.
   3. Odwirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść 1 μl supernatantu (zawierającego wyekstrahowane białka) na płytkę docelową MALDI i pozostawić do wyschnięcia na platformie grzewczej o temperaturze 42 °C. Postępować zgodnie z opisem w ppkt 2.1.2.

3. Identyfikacja bakterii i badanie wrażliwości na antybiotyki za pomocą zautomatyzowanego systemu mikrobiologicznego

1. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej do identyfikacji bakterii i AspAT za pomocą zautomatyzowanego systemu mikrobiologicznego.
   1. Przygotuj plastikową probówkę zawierającą 3 ml sterylnego 0,45% roztworu NaCl kompatybilnego z automatycznym systemem mikrobiologicznym.
   2. Dodać wystarczającą objętość osadu z hodowli krwi do 0,45 % roztworu NaCl, aby otrzymać zawiesinę bakteryjną odpowiadającą zmętnieniu McFarlanda wynoszącemu 0,6 do 0,8. Zmierz zmętnienie za pomocą densytometru.
      UWAGA: Objętość osadu bakteryjnego z hodowli krwi waha się od 50 do 200 μl, aby osiągnąć zmętnienie McFarlanda od 0,6 do 0,8.
2. Zaszczepić automatyczne karty Gram-dodatnie (GP) lub Gram-ujemne (GN) w celu identyfikacji oraz automatyczne karty AST do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe ziarniaków Gram-dodatnich i bakterii Gram-ujemnych, zgodnie z opisem producenta.
   UWAGA: Identyfikacja za pomocą kart GP lub GN nie jest stosowana, jeśli wartość wyniku identyfikacji MALDI-TOF MS wynosi >2. Sprawdź czystość zawiesiny bakteryjnej, umieszczając zawiesinę bakteryjną na płytkach z agordem z krwi (GP i GN) i agarem MacConkey (GN).

4. Badanie wrażliwości na antybiotyki za pomocą testu dyfuzji krążkowej

Test dyfuzji krążka jest opisany przez Europejski Komitet ds. Testowania Wrażliwości na Środki Przeciwdrobnoustrojowe (EUCAST, Wersja 3.0, kwiecień 2013, www.eucast.org).

1. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej do przeprowadzenia badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą testu dyfuzji krążkowej.
   1. Przygotować szklaną probówkę zawierającą 3 ml sterylnego 0,9% roztworu NaCl.
   2. Dodać wystarczającą objętość osadu do hodowli krwi w 0,9% roztworze NaCl, aby uzyskać zawiesinę bakteryjną odpowiadającą zmętnieniu McFarlanda wynoszącemu 0,5. Zmierz zmętnienie za pomocą densytometru.
      UWAGA: Objętość osadu bakteryjnego z hodowli krwi waha się od 50 do 200 μl, aby osiągnąć zmętnienie McFarlanda od 0,6 do 0,8.
   3. Odwiruj zawiesinę bakteryjną.
2. Inokulacja zawiesiny bakteryjnej na agarze Muellera-Hintona (MH) lub agarze Muellera-Hintona z agarem i organizmami wybrednymi (MHF) (MH uzupełniony 5% zdefibrynowaną krwią końską i 20 mg/L dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego).
   1. Zanurz sterylny bawełniany wacik w zawiesinie bakteryjnej i delikatnie usuń nadmiar płynu, obracając wacik na wewnętrznej ściance szklanej rurki.
   2. Zawiesinę bakteryjną rozprowadzić równomiernie na całej powierzchni płytki agarowej MH/MHF, pobierając wymaz w trzech kierunkach lub za pomocą automatycznego rotatora płytek.
3. Nakładanie krążków przeciwdrobnoustrojowych na zaszczepione płytki agarowe.
   1. Nanieść dokładnie krążki na powierzchnię wysuszonych inokulowanych płytek agarowych ręcznie lub za pomocą dozownika krążka do wykrywania wrażliwości.
   2. Inkubować płytkę w odpowiedniej temperaturze i atmosferze, zgodnie z opisem w metodzie badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe EUCAST (wersja 3.0, kwiecień 2013 r., www.eucast.org).

5. Zautomatyzowany test diagnostyczny oparty na PCR do wykrywania MRSA

1. Za pomocą mikropipety przenieś 50 μl osadu z posiewu krwi do fiolki z odczynnikiem do próbki dostarczonej z zestawem do automatycznego testu diagnostycznego opartego na PCR MRSA i wiruj przez 20 sekund.
2. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml dozować próbkę do portu próbki we wkładzie. Włóż wkład do automatycznego systemu PCR i rozpocznij test zgodnie z opisem producenta.

Wyniki

W badaniu przeprowadzonym przez Prod’homa et al.¹⁵ osady bakteryjne uzyskane poprzez wirowanie po lizie chlorkiem amonu z 122 dodatnich posiewów krwi od 78 pacjentów zostały poddane analizie metodą MALDI-TOF MS. Spośród 122 dodatnich posiewów krwi, 95 (77,9%) zidentyfikowano prawidłowo na poziomie gatunkowym, a jeden (0,8%) na poziomie rodzaju. Pozostałe 26 (21,3%) osadów z posiewów krwi nie pozwoliło na wiarygodną identyfikację za pomocą MALDI-TOF. Wśród nich 21 stanowiły bakterie gram-dodatnie, w ty...

Dyskusja

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami diagnostycznymi z dodatnim wynikiem posiewu krwi, szybkie pozyskanie osadu bakteryjnego przy użyciu metody wirowania chlorku amonu z wirowaniem do lizy skraca czas identyfikacji o 16 do 24 godzin, a czas zgłaszania AspAT o 24 do 48 godzin (ryc. 1 i 3).

Szybkie wprowadzenie odpowiedniej antybiotykoterapii ma kluczowe znaczenie dla poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na zakażenia krwi. W związku z tym wczesna identyfikacja czyn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła 20 G	Terumo, Leuven, Belgia	NN-2038R
50 ml Probówka Falcon	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	Probówki wirówkowe 50 ml
Chlorur amonu	Merck, Darmstadt, Niemcy	101145
Wodorowęglan potasu	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	F0507	Łatwopalny,
α-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Toksyczność ostra
Acetonitryl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Łatwopalny, toksyczny
ostry kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	, ostra toksyczność
Vitek 2 60 instrument	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	27202	zautomatyzowany instrument do systemu mikrobiologicznego
Vitek 2 Gram-dodatnia (GP) karta	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	21342	automatyczna karta identyfikacyjna GP
karta identyfikacyjna Vitek 2 AST-P580	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	22233	zautomatyzowany mikrobiologiczny system AST
Vitek 2 Gram-ujemna (GN) karta	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	21341	automatyczna karta identyfikacyjna GN
karta Vitek 2 AST-N242	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	413391	zautomatyzowany mikrobiologiczny system AST
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Kalifornia, USA&	nbsp; GXMRSA-100N-10	technologia amplifikacji kwasów nukleinowych Instrument MRSA
GeneXpert IV	Cepheid, Sunnyvale, Kalifornia, USA	Przyrząd do amplifikacji kwasów nukleinowych	GXIV-4-D
Przyrząd Microflex LT MALDI-TOF MS Bruker	Daltonics, Brema, Niemcy	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 stal celownicza BC	Bruker Daltonics, Brema, Niemcy	280799	tarcza celownicza MALDI
Densytometr Densicheck przyrząd	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	27208
Zestaw MALDI Sepsityper 50	Bruker Daltonics, Brema, Niemcy	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Mediolan, Włochy	4016702
Agar Mueller-Hinton	Oxoid, Hampshire, Anglia	CM0337	Agar Mueller-Hinton (MH)
Agar MHF	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, Francja	43901	Agar Mueller-Hinton agar-wybredne organizmy (MHF)
BD Columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	agar z krwią
Agar czekoladowy BD	Franklin Lakes, NJ, USA	254089	agar czekoladowy
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Agar Schaedler

,