Artykuł metodologiczny

Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

DOI:

10.3791/51993

⸱

15 sierpnia 2014

 ,  , 
1Institute of Applied Research, Aalen University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano moduł do mikroskopii z oświetleniem jednopłaszczyznowym (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych. Próbka znajduje się w prostokątnej kapilarze, a za pomocą układu mikroprzepływowego można w niewielkich ilościach aplikować barwniki fluorescencyjne, środki farmaceutyczne lub leki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany jest moduł do mikroskopii świetlnej lub jednopłaszczyznowej (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych, np. wielokomórkowych sferoid nowotworowych (MCTS). Moduł wzbudzenia SPIM kształtuje i odchyla światło w taki sposób, że próbka jest oświetlona przez arkusz świetlny prostopadły do ścieżki detekcji mikroskopu. System charakteryzuje się zastosowaniem prostokątnej kapilary do przetrzymywania (a w wersji zaawansowanej również podejścia mikrokapilarnego do obracania) próbek, synchroniczną regulacją arkusza światła oświetlającego i soczewki obiektywu służącego do detekcji fluorescencji, a także adaptacją układu mikroprzepływowego do aplikacji barwników fluorescencyjnych, środków farmaceutycznych lub leków w małych ilościach. Podano protokół pracy z tym systemem i podano pewne szczegóły techniczne. Reprezentatywne wyniki obejmują (1) pomiary wychwytu leku cytostatycznego (doksorubicyny) i jego częściowej konwersji do produktu degradacji, (2) pomiary redoks za pomocą genetycznie kodowanego czujnika glutationu po dodaniu środka utleniającego oraz (3) inicjację i znakowanie martwicy komórek po zahamowaniu mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Omówiono różnice i zalety obecnego modułu SPIM w porównaniu z istniejącymi systemami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz dobrze znanych metod (konfokalna lub wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa1-4, mikroskopia z oświetleniem strukturalnym5,6), arkusz świetlny lub mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM) okazała się wartościową metodą obrazowania 3D7,8,9. Szczególnie interesujące jest jego zastosowanie w trójwymiarowych hodowlach komórkowych, np. wielokomórkowych sferoidach nowotworowych (MCTS), które są coraz częściej wykorzystywane do badań nad odkrywaniem leków10,11. Ponadto SPIM jest metodą preferencyjną, gdy nawet przy długotrwałej ekspozycji lub powtarzających się pomiarach wymagane są niskie dawki światła do utrzymania żywotności próbki, ponieważ do pomiaru każdej płaszczyzny próbki tylko ta płaszczyzna jest wystawiona na działanie światła. Jest to przeciwieństwo innych technik mikroskopowych, w których w celu wykrycia każdej płaszczyzny ogniskowej cała próbka jest oświetlana, tak że po zarejestrowaniu wielu płaszczyzn dawka światła sumuje się i może uszkodzić próbkę12.

Mikroskopia arkuszowa światła lub SPIM opiera się na oświetlaniu próbki w kierunku prostopadłym do ścieżki obserwacji, albo za pomocą soczewki cylindrycznej, albo przez skanowanie wzbudzającej wiązki laserowej (dla przeglądu patrz Ref. 8). Często wymaga to specjalnych komór na próbki13,14 lub matryc, np. agarozy 7,15, stosowanych w specjalnych drogich mikroskopach. Jako alternatywę dla tych systemów opracowano porównywalnie proste urządzenie oświetleniowe do SPIM i dostosowano je do konwencjonalnego mikroskopu odwróconego16 (patrz rysunek 1). Składa się z wiązki laserowej rozprężonej do średnicy 8 mm i zogniskowanej przez soczewkę cylindryczną (ogniskowa: 50 mm, apertura numeryczna: 0,08) na arkuszu światła o grubości 6–10 μm przy głębi ostrości około 100 μm. Próbki umieszcza się w prostokątnej kapilarze o średnicy wewnętrznej 600–900 μm, umieszczonej przed soczewką obiektywu mikroskopu w celu wykrywania fluorescencji. Te główne cechy są obecnie uzupełniane i optymalizowane poprzez zastosowanie zaawansowanych metod mikrokapilarnych do zatrzymywania i obracania próbek, synchroniczną regulację arkusza światła oświetlającego (w kierunku osiowym) i soczewki obiektywu używanego do detekcji fluorescencji (identyczne długości drogi optycznej przemieszczenia wymagają korekty posuwu mechanicznego) oraz adaptację systemu mikroprzepływowego do nakładania barwników fluorescencyjnych. środków farmaceutycznych lub leków, minimalizując w ten sposób wymagane ilości i wydatki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla i inkubacja sferoidów komórkowych

  1. Eksperyment 1: Sferoidy komórkowe inkubowane z lekiem chemioterapeutycznym
    1. Przygotuj agarozę 1,5% w pożywce hodowlanej, dodając 0,45 g agarozy do 30 ml pożywki hodowlanej (wystarcza na 6 płytek).
    2. Podgrzać mieszaninę od etapu 1.1.1 do temperatury co najmniej 80 °C, mieszając ją od czasu do czasu.
    3. Wlać 50 μl podgrzanej mieszaniny z kroku 1.1.2 do każdego dołka 96-dołkowej płytki i pozostawić do zestalenia się w ciągu 1-2 godzin. Przechowywać płytki zamknięte i przykryte w lodówce w temperaturze 5 °C do czasu użycia.
    4. Wysiewać około 150 komórek raka piersi MCF-7 w każdym dołku przygotowanej 96-dołkowej płytki w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z pożywką hodowlaną F-12 Hama uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
    5. Sferoidy należy hodować przez 5–7 dni do średnicy około 200–300 μm w inkubatorze w temperaturze 5%CO2 i temperaturze 37 °C.
    6. Inkubować sferoidy komórkowe z antybiotykiem antracyklinowym, chlorowodorkiem doksorubicyny przez 6 godzin w stężeniu w zakresie od 2 μM do 8 μM (w pożywce hodowlanej) w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
    7. Przed mikroskopią przemyć sferoidy komórek pożywką hodowlaną lub zrównoważonym roztworem soli Earle'a (EBSS).
  2. Eksperyment 2: Proces utleniania w sferoidach wyrażających czujnik redoks
    1. Wysiewać około 400 komórek glejaka wielopostaciowego U251-MG-L106 trwale transfekowanych wrażliwym na glutation zielonym fluorescencyjnym czujnikiem redoks Grx1-roGFP2 w studzienkach pokrytych żelem agarozowym (procedura opisana w krokach 1.1.1–1.1.3) 96-dołkowej płytki w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i higromycyny B (150 μg/ml).
    2. Sferoidy należy hodować przez 5–7 dni do średnicy około 200–300 μm w inkubatorze w temperaturze 5%CO2 i temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 10 μl roztworu nadtlenku wodoru (purum p.a., ≥ 30%) do 990 μl wody bidestylowanej, aby uzyskać 100 mM roztwór podstawowy, który należy zużyć w ciągu 12 godzin.
    4. Rozcieńczyć roztwór podstawowy od kroku 1.2.3 do 50 μM w EBSS bezpośrednio przed doświadczeniem.
    5. Podczas pomiaru należy inkubować sferoidy komórek za pomocą układu mikroprzepływowego z nadtlenkiem wodoru 50 μM w EBSS w celu utlenienia czujnika redoks.
  3. Eksperyment 3: Inicjacja i znakowanie nekrozy komórkowej w sferoidach
    1. Wysiewać około 400 komórek (np. komórki glejaka U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) w studzienkach pokrytych żelem agarozowym (procedura opisana w krokach 1.1.1–1.1.3) z 96-dołkowej płytki w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i higromycyny B (150 mg / ml).
    2. Sferoidy należy hodować przez 5–7 dni do średnicy około 200–300 μm w inkubatorze w temperaturze 5%CO2 i temperaturze 37 °C.
    3. Inkubować sferoidy komórkowe z mitochondrialnym inhibitorem transportu elektronów rotenonem przez 3 godziny w stężeniu 1 μM w pożywce hodowlanej w celu wywołania martwicy komórkowej. Dodatkowo należy współinkubować z zielonym barwnikiem cytotoksyczności przez 3 godziny w stężeniu 1 μl w 1 ml pożywki hodowlanej, aby oznaczyć komórki nekrotyczne.
    4. Przed mikroskopią przemyć sferoidy komórek pożywką hodowlaną lub EBSS.

2. Regulacja arkusza światła

UWAGA: Aby osiągnąć najlepsze wyniki, należy upewnić się, że pas wiązki arkusza światła znajduje się w płaszczyźnie ostrości soczewki obiektywu. Położenie talii belki można wyrównać tylko poprzez obserwację arkusza świetlnego w pozycji pionowej w stosunku do kapilary (patrz kroki 2.5 - 2.8).

  1. Użyj odwróconego mikroskopu i zamontuj moduł wzbudzenia SPIM, zgodnie z opisem w odnośniku 16, do płyty podstawy stołu pozycjonującego (patrz rysunek 1A).
  2. Wyposażyć mikroskop w obiektyw mikroskopu 10X/0,3 lub 20X/0,5 oraz odpowiedni filtr długoprzepustowy (np. λ ≥ 515 nm) w ścieżce detekcji mikroskopu.
  3. Zamontuj kamerę integrującą w porcie wykrywania mikroskopu.
  4. Użyj równoległej skolimowanej wiązki lasera lub diody laserowej o długości fali wzbudzenia preferencyjnie 470 nm i zastosuj ją do modułu SPIN.
  5. Obróć soczewkę cylindryczną o 90 stopni, co spowoduje przesunięcie arkusza świetlnego do pozycji pionowej w celu osiowej regulacji talii wiązki arkusza świetlnego.
  6. Umieścić kapilarę zawierającą ciecz z barwnikiem fluorescencyjnym w uchwycie na próbkę.
  7. Przymocuj uchwyt próbki z kapilarą do stołu pozycjonującego mikroskopu i wyrównaj położenie kapilary tak, aby była wyśrodkowana, a talia wiązki arkusza światła była ostra.
  8. Dostosuj talię wiązki, zmieniając położenie osiowe samej soczewki cylindrycznej. Po wyregulowaniu odwróć obiektyw.

3. Aplikacja sferoidów komórkowych i synchronizacja zasilania mikroskopem

  1. Sferoidy komórek należy umieścić oddzielnie lub w grupach w prostokątnych kapilarnach ze szkła borokrzemianowego16 o wewnętrznym przekroju poprzecznym 600 μm x 600 μm i grubości ścianki 120 μm. Dwie techniki zastosowania sferoidy komórkowej okazały się skuteczne.
    1. Weź pustą kapilę pionowo kciukiem i środkowym palcem i uszczelnij górny otwór palcem wskazującym. Zbliżyć dolny otwór do sferoidy komórki w otaczającej ją cieczy (EBSS lub pożywce hodowlanej). Zwolnij palec wskazujący z górnego otworu. Ciecz z sferoidą komórkową zostanie natychmiast wchłonięta przez siły kapilarne. Dostosuj położenie sferoidy w wypełnionej kapilarze grawitacyjnie w odpowiednim pionowym położeniu kapilary.
    2. Alternatywnie, nanieść sferoidę komórkową na kapilarnę za pomocą pipetowania. Należy zwrócić uwagę, aby otwór końcówki pipety był z jednej strony wystarczająco duży w stosunku do wielkości sferoidy, a z drugiej strony mniejszy lub równy wewnętrznej średnicy kapilary.
  2. Umieść kapilarnę ze sferoidą w specjalnym uchwycie na próbkę do mikroskopii.
  3. Przymocuj uchwyt próbki z kapilarą do stołu pozycjonującego mikroskopu i wyrównaj położenie sferoidy komórki tak, aby była wyśrodkowana i skupiona.
  4. Ustaw dopasowanie między arkuszem świetlnym a płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu mikroskopu na ścieżce wykrywania, regulując położenie lustra odbiciowego i soczewki cylindrycznej (patrz śruba regulacyjna na rysunku 1B).
  5. Wyreguluj mikrometryczną (patrz rysunek 1B) zgodnie ze wskaźnikami załamania światła i aperturą numeryczną soczewki obiektywu, aby skompensować efekt akwarium.
    UWAGA: Różne współczynniki załamania światła próbki i ośrodków otaczających soczewkę obiektywu prowadzą do różnicy między przesunięciem soczewki obiektywu a przesunięciem płaszczyzny ogniskowej. Ponieważ arkusz świetlny jest przesuwany przez wieżyczkę obiektywu, niedopasowanie między przesunięciem arkusza światła (odpowiadającym przesunięciu soczewki obiektywu) a przesunięciem płaszczyzny ogniskowej jest kompensowane przez ramię dźwigni (patrz rysunek 1B). Śruba mikrometryczna służy do regulacji odległości między górnym a dolnym kołkiem w celu regulacji przesunięcia arkusza światła zgodnie z aperturą numeryczną soczewki obiektywu i wskaźnikami załamania.

figure-protocol-1
Rysunek 1. (A) Obraz modułu oświetlenia jednopłaszczyznowego zamontowanego na płycie podstawy stołu pozycjonującego mikroskopu odwróconego, (B) ustawienie modułu oświetlenia jednopłaszczyznowego i synchronizacji zasilania mikroskopu w celu skompensowania niedopasowania podnoszenia (efekt akwarium) między płaszczyzną ogniskową a płaszczyzną oświetlenia. Δzo oznacza przesunięcie soczewki obiektywu, a Δzf przesunięcie płaszczyzny ogniskowej i arkusza światła. Wkładka pokazuje przekroje sferoidów zawierających naczynia włosowate. Po lewej: prostokątna kapilara o średnicy wewnętrznej 600 μm (ścianka 120 μm). Po prawej: Konfiguracja używana do obracania. Wewnętrzna okrągła kapila (średnica wewnętrzna 400 μm, średnica zewnętrzna 550 μm) jest obracana w zewnętrznej prostokątnej kapilarze. Przestrzeń między dwiema naczyniami włosowatymi jest wypełniona płynem immersyjnym.

4. Pomiar w dynamicznym środowisku cieczy

UWAGA: Poprzedni protokół jest używany do statycznej inkubacji przed pomiarem, w którym sferoida komórki została wcześniej inkubowana, a następnie utrzymywana w miejscu w kapilarze przez prostą grawitację. Nie ma potrzeby dalszej fiksacji. Jednak w przypadku pomiarów w przepływających ośrodkach, w których pożądana jest dynamiczna inkubacja, a tym samym dynamiczne środowisko, w celu pomiaru kinetyki wychwytu, można wykonać ten podprotokół. Kroki 4.5–4.9 mają kluczowe znaczenie, aby uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do próbki.

  1. Wypełnij kapilarę FCS przez 30 minut, aby wspomóc późniejsze przyleganie komórkowe sferoidy komórkowej do wewnętrznej powierzchni szkła.
  2. Pozostaw pozostałą powłokę FCS w zubożonej kapilarze do wyschnięcia przez co najmniej 12 godzin.
  3. Wprowadzić sferoidę komórkową do kapilary pokrytej FCS, jak opisano w kroku 3.2.
  4. Pozostawić kapilarnę w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez dodatkowe 2–4 godziny, aby spowodować zrost komórkowy sferoidy.
  5. Ustawić część afluksową układu mikroprzepływowego (patrz rysunek 2). Za pomocą pompy perystaltycznej napełnić rurkę (średnica wewnętrzna: 0,89 mm) pożywką hodowlaną zawierającą barwnik fluorescencyjny, lek lub środek.
  6. Podłączyć część dopływową układu mikroprzepływowego do pułapki pęcherzykowej (patrz rysunek 2).
  7. Najpierw zaciśnij kapilę bez pęcherzyków powietrza do rurki aflaluksowej, a następnie zaciśnij drugą stronę kapilary do rurki odpływowej.
  8. Dostosuj temperaturę cieczy w łaźni wodnej do żądanej wartości (np. 37 °C).
  9. Ustawić pompę perystaltyczną na żądaną prędkość pompy (np. natężenie przepływu: 9 μl/min; prędkość pompy w kapilarze: 25 mm/min).
  10. Zebrać pompowaną ciecz w odbiorniku (konfiguracja z otwartą pętlą), podać ją z powrotem do źródła (konfiguracja z zamkniętą pętlą) lub wprowadzić bezpośrednio do rurki pompy perystaltycznej (konfiguracja z ciasną pętlą zamkniętą).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Konfiguracja mikroprzepływowa (otwarta pętla i ścisła zamknięta pętla); inlay: Oświetlenie sferoidy w mikrokapilarze za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszu światła sprzężonej z mikroskopem odwróconym.

5. Akwizycja i analiza danych

  1. Ustaw moc lasera i czas integracji dla akwizycji obrazu.
  2. Należy zwrócić uwagę, aby parametry określone w kroku 5.1 nie przekraczały wartości dawki światła około 50–100 J/cm2 dla komórek natywnych lub 10–20 J/cm2 dla komórek inkubowanych z barwnikiem fluorescencyjnym lub transfekowanych plazmidem kodującym białko fluorescencyjne, aby uniknąć fototoksyczności (szczegóły patrz odnośnik 12).
  3. Ustaw przyrost dla stosu z na ∆z = 5–10 μm, co jest preferowane w przypadku analizy danych 3-wymiarowych, ponieważ grubość jasnego arkusza wynosi około 10 μm.
  4. Wykonuj pomiary pojedynczych obrazów lub stosów z poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowej w sferoidzie komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperyment 1: Sferoidy komórkowe inkubowane z chemioterapeutykiem

Na rysunku 3 przedstawiono skan stosu Z wcześniej inkubowanej sferoidy komórek MCF-7 (doksorubicyna 8 μM, 6 godzin). Zawiera szczegółowe informacje na temat wychwytu i dystrybucji komórkowej doksorubicyny17 i produktu jej degradacji18,19. W zewnętrznej warstwie komórkowej sferoidalnej czerwonej fluorescencyjnej doksorubicyna jest zlokalizowana głównie w jądrze, podczas gdy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy manuskrypt opisuje arkusz świetlny lub urządzenie do mikroskopii oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM), które jest zoptymalizowane pod kątem trójwymiarowych systemów komórkowych, np. wielokomórkowych sferoid nowotworowych (MCTS). Trzy przykładowe zastosowania obejmują (1) wychwyt leku cytostatycznego i jego częściową konwersję do produktu degradacji (którego udział w skuteczności chemioterapii nadal wymaga oceny), (2) pomiary stanu redoks za pomocą genetycznie kodowanego czujnika glutationu po dodani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został sfinansowany przez Land Baden-Württemberg oraz przez Unię Europejską, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Autorzy dziękują Rainerowi Wittigowi (ILM Ulm) za dostarczenie linii komórkowej U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 oraz Claudii Hintze za umiejętną pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka do mikromiareczkowaniaOrange Scientific4430100Do hodowli sferoidów komórkowych
Agaroza Carl Roth GmbH3810.1Do hodowli sferoidów komórkowych
Linia komórkowa MCF-7CLS Cell Lines Service GmbH300273Linia komórkowa
Linia komórkowaLinia komórkowa
DMEMBiochrom AG (Merck Millipore)FG0435Pożywka hodowlana
DMEM/Ham's F-12Biochrom AG (Merck Millipore)FG4815Pożywka
FCSBiochrom AG (Merck Millipore)S0615Suplement do hodowli komórkowych
Penicylina/streptomycynaBiochrom AG (Merck Millipore)A 2213Antybiotyki
Higromycyna BPAA Laboratories   P02-015
Antybiotyk EBSSSigma-Aldrich Inc.E3024Suplement do hodowli komórkowych
DoksorubicynaSigma-Aldrich Inc.D1515Barwnik fluorescencyjny (UWAGA: ostra toksyczność)
Zielony barwnik cytotoksycznościPromega GmbHG8742CellTox - fluorescencyjny barwnik cytotoksyczny
RotenoneSigma-Aldrich Inc.R8875Inhibitor komórkowy (UWAGA: ostra toksyczność)
Nadtlenek wodoru (H2O2)Sigma-Aldrich Inc.95302Odczynnik do utleniania (UWAGA: toksyczność ostra)
KapilarVitroCom 8260-050Przygotowanie próbki
MikroskopCarl Zeiss JenaAxiovert 200M
AxioCam MRc CCD-cameraCarl Zeiss MicroImaging GmbH426508-9901-000Kamera CCD
Oprogramowanie do akwizycji danych AxioVisionCarl Zeiss MicroImaging GmbHwersja 4.8.2.
Dioda laserowaPico Quant GmbHLDH-P-C-470Używana ze sterownikiem PDL800-B
Pompa perystaltycznaIsmatec LabortechnikMS-1 RegloPonownie skalibrowana w celu zmniejszenia minimalnej prędkości pompy o 1/10 
Rurki silikonoweIDEX Health & Science GmbHTYGON R3607
U251-MG-L106 hodowlana

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
  2. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
  3. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  4. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
  5. Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  8. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
  9. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  10. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
  11. Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
  12. Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
  13. Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
  14. Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027(2010).
  15. Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
  16. Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518(2012).
  17. Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
  18. Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
  19. Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
  20. Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007(2013).
  21. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , 7,787,179 B2 (2010).
  22. Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
  23. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , EP 13 184 931.7 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia arkuszowa wiat atr jwymiarowe hodowle kom rkowedetekcja fluorescencjisystem mikroprzep ywowyanaliza poboru lekuobrazowanie Z stackkapilarny uchwyt do pr bek

Powiązane artykuły