Artykuł metodologiczny

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

DOI:

10.3791/51995

⸱

14 września 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikoproteiny otoczki HIV-1 (Env) pośredniczą w wnikaniu wirusa do komórek docelowych i są niezbędne w cyklu zakaźnym. Zrozumienie, w jaki sposób te glikoproteiny są w stanie napędzać proces fuzji poprzez zmiany konformacyjne, może doprowadzić do zaprojektowania lepszych, skuteczniejszych immunogenów dla strategii szczepień. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env przez przeciwciała monoklonalne. Po ekspresji trimerycznego Env HIV-1 na powierzchni transfekowanych komórek, z komórkami inkubuje się specyficzne dla konformacji przeciwciała anty-Env. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową i prosta reakcja chemiluminescencyjna są następnie wykorzystywane do wykrywania przeciwciał związanych. System ten jest bardzo elastyczny i może wykrywać zmiany konformacyjne Env indukowane przez rozpuszczalne białka CD4 lub komórkowe. Wymaga minimalnej ilości materiału i nie wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu ani know-how. W związku z tym technikę tę można ustalić dla średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych antygenów i przeciwciał, takich jak nowo wyizolowane przeciwciała.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wejście ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), w którym pośredniczą glikoproteiny otoczki wirusa trimerycznego (Env), jest pierwszym etapem cyklu zakaźnego. Będąc jedynym narażonym antygenem wirusowym prezentującym się na powierzchni wirionów, trimer Env wywołuje przeciwciała neutralizujące i nieneutralizujące. W związku z tym stanowi interesującego kandydata do projektowania immunogenów szczepionkowych. Jednak badania szczepień Env w postaci rozpuszczalnej lub rekombinowanej wywołały odpowiedzi z minimalną skutecznością przeciwko większości pierwotnych izolatów HIV-11-3. Niemniej jednak częściowa skuteczność zaobserwowana w badaniu klinicznym szczepionki RV1444 odnowiła zainteresowanie wirusem HIV-1 Env jako kandydatem na immunogen. Zostało to potwierdzone w niedawnym badaniu opisującym, że przeciwciała anty-Env wywołane szczepionką były wystarczające do wytworzenia pewnego stopnia ochrony przed wyzwaniami SIV i HIV5.

Po zsyntetyzowaniu w retikulum endoplazmatycznym, prekursor glikoproteiny Env, gp160, przechodzi różne modyfikacje potranslacyjne, które są kluczowe dla jego zdolności do napędzania procesu fuzji wirusa. Prekursor Env musi prawidłowo się fałdować i łączyć w trimery, zanim zostanie rozszczepiony na swoje pozacytoplazmatyczne podjednostki gp120 i transbłonowe gp416-10, z oddziaływaniami niekowalencyjnymi utrzymującymi związek gp120-gp41. Zainfekowana maszyneria komórkowa jest również odpowiedzialna za silnie glikozylujący Env, stanowiący około 50% jego całkowitej masy11,12. Uzyskana złożona struktura pozwala Env być konformacyjnie elastycznym13,14, zapewniając jednocześnie metastabilność, która, jak się uważa, pozwala Env na adaptację i ukrywanie pewnych wysoce immunogennych epitopów, które w przeciwnym razie zostałyby odsłonięte15-19, podkreślając znaczenie lepszego zrozumienia różnych konformacji pobieranych przez natywny trimer Env.

Do tej pory opracowano kilka technik i z powodzeniem wykorzystano je do badania zmian konformacyjnych Env. Różnią się one jednak swoimi ograniczeniami, często są ograniczone do określonych kontekstów Env. Na przykład testy powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub immunoprecypitacji z wykorzystaniem specyficznych dla konformacji przeciwciał monoklonalnych (mAb) opierają się na monomerycznych rozpuszczalnych lub rozpuszczonych cząsteczkach Env, o których wiadomo, że różnią się immunogenetycznie od ich trimerycznych form20,21. Ostatnie badania sugerują również, że rozszczepienie wpływa na konformacje Env, powodując ekspozycję epitopów rozpoznawanych głównie przez przeciwciała nieneutralizujące14,22,23.

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która pozwala na szybkie i łatwe określenie konformacji komórkowych trimerów Env18,24-26. Po przejściowej transfekcji Env w ludzkiej przylegającej linii komórkowej wykrywa się wiązanie przeciwciał specyficznych dla Env za pomocą prostej reakcji chemiluminescencyjnej. Technika ta może być również wykorzystana do scharakteryzowania preferencji konformacyjnych przeciwciał zależnych od konformacji. W związku z tym test ten zapewnia solidną i wysoce elastyczną metodę wykrywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dzień 1 - Hodowla komórkowa

  1. Płytka 2 x 104 komórki ludzkiego kostniakomięsaka (HOS) na studzienkę w nieprzezroczystej, 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej odpowiedniej do odczytu luminescencji. Użyj zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny. Inkubować do następnego dnia w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Dzień 2 – Transfekcja polietyleninu (PEI)

  1. Przygotuj mieszankę transfekcyjną zgodnie z kolejnymi krokami. Dostosuj odczynniki i ilości DNA zgodnie z liczbą studzienek, które mają być transfekowane tym samym Env.
  2. Rurka A: Dodaj plazmid kodujący 10 ng Tat (taki jak pTat-III27) i plazmid kodujący 150 ng Env do 5 μl DMEM uzupełnionego 25 mM HEPES.
  3. Plazmid kodujący Tat jest wymagany tylko w przypadku korzystania z plazmidów kodujących Env zależnych od Tat, takich jak pSVIII.
  4. Probówka B: Dodaj 450 ng PEI (z roztworu 1 μg/μl) do 5 μl DMEM.
  5. Dodać zawartość probówki B do probówki A. Dokładnie wymieszać przez wirowanie przez 10 sekund i inkubować mieszankę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22 °C).
  6. Dodać 10 μl mieszanki transfekcyjnej do dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

3. Dzień 4 – ELISA

  1. Wykonuj wszystkie eksperymenty w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować możliwą endocytozę kompleksów Env/przeciwciała.
  2. Przygotować 250 ml buforu myjącego na każdą płytkę, która jest używana w tym samym czasie. Bufor płuczący to 1x sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 150 mM NaCl), uzupełniona 1 mM MgCl2 i 1,8 mM CaCl2.
  3. Przygotuj 125 ml buforu blokującego na płytkę, dodając 1% beztłuszczowego mleka w proszku i 5 mM Tris pH 8,0 do buforu myjącego.
  4. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i mieszaninę transfekcyjną (supernatant) z płytki 96-dołkowej.
  5. Dodać 100 μl buforu blokującego do studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć supernatant i dodać 50 μl przeciwciała (lub surowicy) do dołka, rozcieńczonego do odpowiedniego stężenia w buforze blokującym. Zazwyczaj stosuje się stężenie 1 μg/ml. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć 3x 100 μl buforem blokującym, a następnie powtórzyć proces mycia 3x za pomocą 100 μl buforu myjącego.
  8. Usunąć supernatant, dodać 100 μl buforu blokującego i inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Usunąć supernatant i dodać 50 μl przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczonego w stosunku 1/3 000 w buforze blokującym. Różnią się optymalnym rozcieńczeniem przeciwciał w zależności od różnic producenta. Inkubować 40 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyć 3x 100 μl buforem blokującym, a następnie powtórzyć proces mycia 3x za pomocą 100 μl buforu myjącego.

4. Akwizycja danych

  1. Usunąć supernatant z płytki i dodać 30 μl 1x substratu o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) do dołka.
  2. Odbierać sygnał chemiluminescencji przez 1 sekundę/studzienkę na odpowiednim czytniku płytek zgodnie z instrukcjami producenta. Czas odczytu może się różnić w zależności od różnic sprzętowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z ogólnej procedury opisanej powyżej, dostosowaliśmy protokół do oceny wpływu rozpuszczalnego CD4 (sCD4) i koeksprymowanego komórkowego CD4 na ekspozycję epitopów CD4i na Env typu dzikiego (wt) lub zmutowanego, jak opisano wcześniej18,24,25,28. Rycina 1 schematycznie przedstawia ogólną procedurę i ekspozycję epitopów CD4i po leczeniu sCD4 lub przez koekspresję komórkowego CD418. Na rycinie 2 użyliśmy sCD4 do wywołania zmian konformacyjnych Env, które ods...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania interakcji określonych mAb z trimerycznym Env HIV-1 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki. Po ustaleniu protokołu można go stosować przy średniej lub wysokiej przepustowości przy niskich całkowitych kosztach materiałów i niewielkiej ilości przeciwciał. Ponieważ test ten jest oparty na transfekcji, można go łatwo dostosować do koekspresji białek komórkowych, takich jak CD4, w celu zbadania ich wpływu na konformację Env.

Jednak baza transf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Jamesowi Robinsonowi za hojny dar mAb A32, 17b, 48d i C11. PGT 121 został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (Cat#12343). Praca ta była wspierana przez Lidera Programu Kanadyjskiej Fundacji na rzecz Innowacji #29866, przez CIHR działającą #257792, przez grant FRQS Establishment of Young Scientist #24639 dla AF oraz przez grant CRCHUM continuum, a także przez grant katalizatora CIHR #126630 dla AF i MR. AF jest odbiorcą stypendium FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 #24639. MV otrzymał wsparcie w ramach CIHR Doctoral Research Award #291485.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki HOSATCCCRL-1543
Biała nieprzezroczysta płytka do hodowli tkankowej, 96-dołkowa, płaskodennaBD353296
Polietyleninina, liniowa, 25 000 MWPolysciences23966Przygotowany w roztworze 1 mg/ml
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)Invitrogen11995
Kozia anty-ludzka IgG, peroksydaza sprzężonaPierce31413
Ulepszony substrat chemiluminescencyjnyPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, czytnik płytekBerthold Technologies

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HIV 1 Envelope GlycoproteinsConformational ChangesMonoclonal AntibodiesChemiluminescence DetectionSoluble CD4Transfected CellsHorseradish PeroxidaseEpitope ExposureHigh Throughput Screening

Powiązane artykuły