Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Podsumowanie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie. Zastosowanie MSCs w procesach naprawy i regeneracji tkanek zależy więc przede wszystkim od skutecznego wdrożenia technik umieszczania tych komórek w tkance gospodarza. Z tego powodu projektowanie biomateriałów i rusztowań komórkowych zyskało w ostatnich latach na znaczeniu, ponieważ charakterystyka topograficzna wybranego rusztowania musi zapewniać adhezję, proliferację i różnicowanie do pożądanej linii komórkowej w mikrośrodowisku uszkodzonej tkanki. Ta opcja dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSCs) wykorzystuje macierz kostną bydła jako rusztowanie komórkowe i jest wydajną techniką hodowli, ponieważ komórki reagują na topograficzne cechy macierzy kostnej bydła Nukbone (NKB), tj. rozprzestrzeniają się na powierzchni, makroporowate pokrycie i kolonizują głębokość biomateriału, po procesie izolacji komórki. Przedstawiono procedurę izolacji i hodowli MSCs na matrycy bydlęcej.

Wprowadzenie

Tam para i regeneracja tkanek jest jednym z głównych celów nauk medycznych, ponieważ uszkodzenie tkanki lub narządu może być obezwładniające, a w niektórych przypadkach śmiertelne. W tym kontekście, pracownicy służby zdrowia i naukowcy nieustannie poszukują technik, metod i narzędzi, aby zapewnić nowe alternatywy terapeutyczne, aby promować proces regeneracji par uszkodzonych tkanek. Dlatego nauki biomedyczne skupiły się na badaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs), zwłaszcza dorosłych komórek macierzystych, ponieważ ta linia komórkowa stanowi idealny model do badania procesu regeneracji tkanek, ze względu na jej potencjał do różnicowania się do linii komórek ektodermalnych, mezodermalnych i endodermalnych Jednak, aby terapia MSCs stała się rzeczywistością, charakterystyce potencjału terapeutycznego MSCs musi towarzyszyć wdrożenie nowych technik hodowli komórkowych z wykorzystaniem biomateriały i rusztowania komórkowe, które gwarantują pożądane zachowanie MSCs w tkance gospodarza.

Głównym wyzwaniem do pokonania przy wdrażaniu hodowli z MSCs w regeneracji kości jest zapewnienie adhezji komórek na wybranym biomateriale, który zazwyczaj prezentuje porowatą strukturę z rozkładem porów od mikrometrów do milimetrów, ale często wymaga zaawansowanych odczynników, sprzętu i procedur, które zmieniają zachowanie komórek. Procedury te nadają się do oceny in vitro, ale nie do ekstrapolacji i implementacji w złożonych systemach otwartych, takich jak testy na ludziach lub in vivo. Techniki, które koncentrują się na zapewnieniu adhezji komórek do losowych topografii, takich jak porowate materiały kostne, zostały zbadane przez adhezję materiału do dna studzienek hodowlanych i wykorzystano kolageny i polimery agarozy. W przypadku tych metod komórki, które zostały wysiane na powierzchni, zostały zatrzymane w porach i na górnej powierzchni. Jednak ten aspekt nie może być zapewniony w systemie in vivo, w którym płyny ustrojowe otaczające biomateriał mogą ciągnąć komórki z pożądanego miejsca na porowatych rusztowaniach, jest zastosowanie stymulacji ultradźwiękowej, która wymaga wyrafinowanego sprzętu, ale sprzyja ekspresji markerów osteoblastycznych w testach in vitro ⁵. Stosowanie hodowli ciągłych wymaga bioreaktorów, które gwarantują jednorodne rozprowadzenie składników odżywczych w pożywce hodowlanej; Jednak znaczny procent hodowanych komórek jest tracony podczas wymiany pożywki hodowlanej ze względu na natężenie przepływu stosowane w tej technice i pożywkę przylegającą do ścianek sprzętu. Kwestie te zwiększają masę komórkową, która jest niezbędna do tego typu hodowli i czas uzyskania wystarczającej liczby komórek⁷. Metodologia przedstawiona w niniejszej pracy stanowi zatem technikę, którą należy ekstrapolować na systemy in vivo, ponieważ komórki są wysiewane w mikromasie na materiale o górnej powierzchni, a po odpowiednich czasach inkubacji przylega 60% początkowej masy komórkowej. Co więcej, technika ta nie wymaga dodawania cewki osteoblastycznej (np. deksametazonu, kwasu askorbinowego lub beta-glicerofosforanu) ani bodźców ultradźwiękowych w celu wywołania różnicowania osteoblastycznego i utrzymania fenotypu osteoblastów, ponieważ NKB jest rusztowaniem osteokondukcyjnym i osteoindukcyjnym⁸, metoda hodowli MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSCs) na makroporowatym biomateriale kostnym przedstawiona w tej pracy przedstawia możliwość wprowadzenia komórki do uszkodzonej tkanki kostnej i indukują różnicowanie do linii osteoblastycznej.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską Światowego Stowarzyszenia Medycznego dotyczącą etycznego prowadzenia badań z udziałem ludzi i zostało zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Facultad de Medicina, UNAM (numer projektu 101-2012).

1. Izolacja ludzkiej mezenchymalnej komórki macierzystej

1. Przygotowanie odczynnika
   1. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) i uzupełnić 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
   2. Przygotuj Dulbecco's Modified Eagle's Medium o wysokiej zawartości glukozy (HG-DMEM) i dodaj 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Wysterylizuj tę pożywkę hodowlaną przez filtrację przez filtr 0,2 μm.
   3. Przygotować roztwór kolagenazy II w stężeniu 100 j./ml w HG-DMEM bez FBS lub roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
   4. Sterylizuj następujące narzędzia chirurgiczne, które są potrzebne do izolacji, przez autoklawowanie: standardowe nożyczki, proste kleszcze preparacyjne, kleszcze drobnoziarniste i zębate oraz rękojeść skalpela (#4).
2. Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych błony płodowej człowieka
   1. Jedną ręką trzymaj pępowinę, a drugą odłącz błonę owodniową (AM), która wygląda jak półprzezroczyste prześcieradło, aby uzyskać fragment o wielkości około 5^cm2. Jeśli w próbce występuje odcinek kosmówki, należy oddzielić leżącą poniżej kosmówkę przez ręczne rozwarstwienie, ponieważ odcinek kosmówki jest grubszy niż owodnia.
   2. Usunąć resztki krwi za pomocą trzech przemyć 5 ml PBS i usunąć skrzepy za pomocą zwykłych kleszczyków. Wykonaj małe nacięcie skalpelem w godzinach porannych, aby uzyskać fragmenty o wielkości około 0,5 cm².
3. Trawienie enzymatyczne błony owodniowej
   1. Inkubować AM z 5 ml 0,125% roztworu trypsyny/0,5 mM EDTA w temperaturze 37 °C przez 30 minut w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ . Wirować w temperaturze 250 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut, a następnie usunąć roztwór trypsyny, odrzucając supernatant.
   2. Dodać 15 ml roztworu kolagenazy typu II i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ z okazjonalnym wstrząsaniem zgodnie z Leyva i wsp.⁹
   3. Bezpośrednio po roztrawieniu kolagenazą II dodać 15 ml PBS i wirować w temperaturze 250 x g i 25 °C przez 10 min.
   4. Odrzucić sklarowany osad i przemyć osad komórkowy 15 ml roztworu PBS i odwirować w temperaturze 250 x g i temperaturze 25 °C przez 15 minut. Odrzucić sklarowany osad.
   5. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml HG-DMEM, delikatnie wstrząsając.
4. Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych
   1. Zasiać 2 ml zawiesiny komórkowej (1 x 10⁴ komórki/^cm2) w kolbie hodowlanej, dodać 2 ml HG-DMEM i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2. Wyeliminuj nieprzylegającą komórkę, zmieniając pożywkę hodowlaną po 5-7 dniach.
   2. Po tym czasie należy zmieniać pożywkę co 3 dni przez dodatkowe 7-10 dni, aby uzyskać zbieżność komórkową na poziomie 90%.
   3. Odzyskać komórki i inkubować je przez 5 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ z 0,125% roztworem trypsyny/EDTA (trypsyna).
   4. Natychmiast po trypsynizacji zebrać komórki za pomocą pipety i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 250 x g przez 5 minut.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml HG-DMEM.
   6. Zawiesinę komórek hodowlanych w dwóch kolbach hodowlanych^{o długości 75 cm 2} (po 5 ml w każdej kolbie) i utrzymywać kulturę aż do 90% konfluencji.
   7. Powtarzaj kroki od 1.4.3. do 1.4.6, aż do 9. przejścia lub subkultury.
   8. Odzyskaj komórki przez trypsynizację, jak w krokach od 1.4.3 do 1.4.5 dla cytometrii przepływowej lub innych badań.

2. Przygotowanie porowatego dysku macierzy kostnej (NKB)

1. Aby zwilżyć krążki NKB (średnica, 12 mm; grubość, 2 mm), należy inkubować każdy krążek przez noc z 3 ml HG-DMEM bez FBS w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C, zgodnie z Fassina i wsp. ⁵
2. Po procesie zwilżania umieścić krążek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wirować z prędkością 250 x g przez 5 minut, aby usunąć nadmiar pożywki hodowlanej. Umieścić krążek na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
   1. Dodać 500 μl HG-DMEM i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Upewnij się, że na krążku NKB nie ma pęcherzyków powietrza, co sprzyja prawidłowemu rozprowadzeniu składników odżywczych i komórek.
   2. Jeżeli na dysku zaobserwowane są pęcherzyki, należy wstrząsnąć i dodać 300 μl pożywki hodowlanej i inkubować przez 15 minut w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C. Po tym czasie usunąć 300 μl pożywki hodowlanej zasysanej przez ścianę studzienki hodowli komórkowej i upewnić się, że nie tworzą się pęcherzyki.
3. Umieść krążek w nowej 24-dołkowej płytce za pomocą prostych kleszczyków.

3. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na porowatej macierzy bydlęcej

1. Wysiewać zawiesinę komórkową (5 x 10⁵ AM-hMSC w 100 μl HG-DMEM) z trzech subkultur na powierzchni wstępnie zwilżonego dysku biomateriału i inkubować przez 30 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Wykonaj ten krok powoli i w sposób ciągły na górnej powierzchni biomateriału, aby umożliwić komórkom interakcję z topografią wszystkich rusztowań. Uwaga: W tej procedurze uzyskuje się 60% komórek przyłączonych do biomateriału pokazanego w Tabeli 1.
2. Dodać 1,5 ml HG-DMEM w temperaturze 37 °C i utrzymywać kulturę przez 3 dni w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Nie wytwarzaj turbulencji podczas dodawania pożywki hodowlanej, aby uniknąć osadzania się komórek na dnie szalki hodowlanej. To jest czas pierwszy.

4. Charakterystyka markerów powierzchni komórek za pomocą cytometrii przepływowej

1. Odłącz komórki od 9. subkultury przed wysiewem ich na dysk matrycy. Użyj 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i utrwal je przez 30 minut w lodowatym 2% formaldehydzie. Po utrwaleniu przemyj komórki raz 0,05% PBS.
2. Zablokuj niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację komórek z 20% ludzką immunoglobuliną przez 3 minuty na lodzie i inkubację 0,1 x 10⁶ porcji komórkowych z MAb sprzężonym z fikoerytryną (PerCP) przeciwko CD73, MAb sprzężonemu z FITC CD90, MAb sprzężonemu z PE przeciwko CD34, MAb sprzężonemu z FITC CD45 i MAb CD105 sprzężonego z PE przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w ciemności. Dopasowane izotypowo MAb sprzężone z FITC, MAb sprzężone z PE i MAb sprzężone z PerCP będą służyć jako kontrole negatywne.
3. Obliczanie poziomów wyrażenia znaczników powierzchni za pomocą oprogramowania do gromadzenia i analizy danych.

5. Wykrywanie adhezji komórek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

1. Przepłukać próbki krążka komórkowego po 3 dniach hodowli dwukrotnie PBS i utrwalić próbki 4% (v/v) roztworem aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze Na-kakodylanu (pH 7,2).
2. Przygotuj próbki do obserwacji mikroskopowej, jak wcześniej informowali Rivera-N i wsp. ¹⁰ i obserwować za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego przy potencjale elektrycznym 15 kV i przy powiększeniu 500X i 2000X.

6. Test proliferacji komórek

1. Do próbek krążka komórkowego zawierających 1,5 ml pożywki hodowlanej dodać 150 μl barwnika witalnego (AB) zgodnie z wytycznymi producenta i inkubować komórki w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Natychmiast po dodaniu AB (0 godz.) i co 24 godziny aż do osiągnięcia 7 dni hodowli komórkowej zmierzyć absorbancję przy 570 nm przy referencyjnej długości fali 600 nm.

7. Jednostka tworzenia kolonii (CFU)¹¹

1. Wyhodować 100 komórek na 100 mm w dyskinie HG-DMEM i inkubować przez 14 dni w wilgotnej atmosferze 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
2. Umyj kulturę PBS i zabarwij 0,5% fioletem krystalicznym w metanolu przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dwukrotnie umyć płytki PBS i policzyć widoczne kolonie za pomocą hemocytometru.

Wyniki

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Po mechanicznym oddzieleniu błony amnestycznej od chorionu za pomocą tępej dyssekcji (Rysunek 1), uzyskano populację komórek przylegających poprzez trawienie trypsyną i kolagenazą II. Populacje komórek tych, które przytwierdziły się do naczynia hodowlanego, wykazywały morfologię charakterystyczną dla fibroblastów w 3. dniu po izolacji, co przedstawiono na mikrografii optycznej (Rysunek 2A) oraz mikrografii z pomiarem skaningowym (Rysunek 2B). Łożki wykorzystane w tej pracy pobrano od zdrowych matek-dawczyń po uzyskaniu uprzedniej świadomej zgody.

Charakterystyka komórek za pomocą cytometrii przepływowej

Populacja komórek uzyskana z AM wykazywała silną reaktywność w stosunku do powierzchniowych markerów mezenchymalnych CD90+ (93,5% ± 6,85) oraz CD73+ i CD105+ (79% ± 3,46) i nie wykazywała reakcji na markery hematopoetyczne, takie jak CD34- i CD45. Zatem użyte w tej pracy AM-hMSCs miały charakter mezenchymalny, zgodnie z informacjami raportowanymi wcześniej przez Leyva et al. (Rycina 3). Dodatkowo wynik ten jest zgodny z charakterystyką immunofenotypową ustaloną przez International Society for Cellular Therapy (ISCT) dla mezenchymalnych komórek macierzystych.

Adhezja komórek do macierzy kostnej

Mikrografie skaningowe przedstawiają zachowanie AM-hMSCs siedem dni po wysianiu na NKB. Powierzchnia biomateriału była pokryta sferycznymi komórkami (dzień pierwszy), a w siódmym dniu niektóre rozprzestrzeniające się komórki były najwyraźniej przytwierdzone do powierzchni macierzy bydlęcej. Przy większym powiększeniu rozprzestrzeniające się komórki zdawały się być w bliskim kontakcie via wypustki filopodialne (FL) (Rysunek 4).

Proliferacja komórek na macierzy kostnej

Wyniki analizy AB wykazały niewielki spadek względnych jednostek absorbancji (RAU) w warunkach z macierzą bydlęcą (+bone matrix) po 1 dniu inkubacji, a następnie w piątym dniu obecność rusztowania wywołała wzrost proliferacji komórek, który był statystycznie istotny w porównaniu z hodowlą prowadzoną bez macierzy bydlęcej (-bone matrix) (Rysunek 5).

Jednostka tworząca kolonie

CFU jest tradycyjnym testem komórek macierzystych. AM-hMSC wyizolowane w niniejszej pracy zachowały zdolność do tworzenia dyskretnych kolonii po 14 dniach hodowli.

Rycina 1: Izolacja błony owodniowej. (A) Pępowina (UC) jest trzymana jedną ręką w celu zidentyfikowania obszaru, z którego pozyskuje się błonę owodniową. (B) Błona owodniowa (AM) przypomina półprzezroczystą błonę pozbawioną unaczynienia.

Rysunek 2: Charakterystyka morfologiczna komórek macierzystych z ludzkiej błony owodniowej. Kultury AM-hMSC w 3. dniu po izolacji obserwowano pod mikroskopem optycznym, co wykazało morfologię podobną do fibroblastów.

Rycina 3: Charakterystyka metodą cytometrii przepływowej. Komórki z ludzkiej błony owodniowej były w przeważającej mierze komórkami mezenchymalnymi, ponieważ wykazywały one dodatni wynik dla markerów mezenchymalnych (CD73, CD90, CD105), co objawiło się przesunięciem histogramu w prawo, oraz ujemny wynik dla markerów krwiotwórczych (CD34 i CD45), co potwierdzono przesunięciem histogramu w lewo. Antygeny przedstawiono na histogramach czerwonych, natomiast izotypy kontrolne dla fluorochromów PE i FITC widoczne są na kolor czarnym.

Rycina 4: Adhezja komórek do macierzy kostnej bydlęcej. Seria obrazów SEM pokazująca przyleganie komórek do porów biomateriału. (A) Widok panoramiczny poru NKB z kilkoma komórkami przylegającymi do biomateriału w stanie sferycznym (CS) i spłaszczonym (CF) na powierzchni biomateriału; można również dostrzec lakunę kostną oznaczoną jako (Lac) w trzecim dniu hodowli na macierzy bydlęcej. (B) Powiększenie komórki w procesie adaptacji do powierzchni materiału poprzez projekcje filopodialne. (C) Interakcja między dwiema komórkami przylegającymi i spłaszczonymi na macierzy bydlęcej (C1, komórka 1; oraz C2, komórka 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 5: Proliferacja komórek na wołowej macierzy kostnej. Proliferację komórek oceniono za pomocą redukcji AB i wyrażono w względnych jednostkach absorbancji w ciągu 7 dni hodowli. Wyniki wskazują na wpływ macierzy kostnej (+bone matrix) na proliferację AM-hMSCs, która była statystycznie różna w porównaniu z warunkiem negatywnym (-bone matrix). (*p <0.05)

Rycina 6: Test CFU dla MSCs początkowo wysianych z różną gęstością i inkubowanych przez 14 dni (średnia*/- SD, n = 10).

	Komórki przylegające	Adhezja komórek (%)
Komórki na dnie	187667 ± 1208	62.47
Komórki na rusztowaniu	312333 ±1208	37.53

Tabela 1: Efektywność adhezji na macierzy bydlęcej. Komórki przylgnęły do dna płytki hodowlanej, a komórki przylegające do rusztowania policzono za pomocą hemocytometru po ich odzyskaniu poprzez trypsynizację. Dane przedstawione w tabeli odpowiadają dwóm niezależnym eksperymentom wykonanym w trzech powtórzeniach ± odchylenie standardowe

Dyskusja

Komórki macierzyste, które uzyskano z ludzkiej błony owodniowej (ryc. 1), wykazywały morfologię podobną do fibroblastów, podobną do komórek mezenchymalnych (ryc. 2) i były głównie MSC. Ponadto testy cytometrii przepływowej wykazały, że komórki te były dodatnie dla markerów komórek mezenchymalnych (CD73, CD90 i CD105) i ujemne dla markerów linii krwiotwórczej (CD34, CD45) (Figura 3). Ponadto AM-hMSC wyizolowane w tej pracy wykazują zdolność do tworzenia CFU (Rysunek 6). Podobnie, mezenchymalne komórki macierzyste wyizolowane w tej formie zachowały zdolność do przyłączania się do biomateriału osteoinduktora (ryc. 4) i namnażania się na rusztowaniu (ryc. 5).

Z tych powodów metoda hodowli AM-hMSC na makroporowatym biomateriale kostnym, która została wykorzystana w niniejszej pracy, stanowi okazję do wprowadzenia komórek do uszkodzonej tkanki kostnej i wywołania jej różnicowania do linii osteoblastycznej. Ten system hodowli nie wymaga dodawania cewki cewki osteoblastycznej w celu utrzymania fenotypu osteoblastów i procesu różnicowania osteoblastów, ponieważ NKB jest materiałem osteokondukcyjnym i osteoindukcyjnym⁸. Wykorzystanie tkanek odpadowych, takich jak ludzkie łożysko, stanowi prostą i etyczną alternatywę dla uzyskania dostępu do populacji komórek macierzystych z potencjałem różnicowania się w MSC, w porównaniu z innymi źródłami, które często obejmują metody inwazyjne lub niską wydajność komórek.

Proponowaną metodę hodowli można ekstrapolować na systemy in vivo , ponieważ komórki są wysiewane w mikromasie na górnym materiale powierzchniowym, a komórki kolonizują i przylegają do całej powierzchni biomateriału po odpowiednim czasie inkubacji. Ponadto nie są wymagane wyrafinowane odczynniki, sprzęt i procedury, w przeciwieństwie do istniejących metod przy wdrażaniu tej techniki, takich jak hodowla mikromasowa, a także powolne i stałe osadzanie podwielokrotności komórkowej na materiale, aby zapewnić, że komórki preferencyjnie oddziałują z biomateriałem, a nie z dnem płytki. Kolejnym krytycznym punktem jest użycie wstępnie zwilżonego materiału przed hodowlą komórek, ponieważ gwarantuje to, że komórki będą miały niezbędne składniki odżywcze z pożywki hodowlanej, gdy zostaną zintegrowane z materiałem, niezależnie od tego, czy znajdują się na powierzchni, czy w porach. Wreszcie, zastosowanie biomateriału osteoindukcyjnego ma kluczowe znaczenie dla tego procesu, ponieważ pozwala uniknąć dodawania czynników zewnętrznych w celu wywołania i utrzymania różnicowania osteoblastów. Ograniczeniem tej techniki jest to, że opiera się ona na potencjale osteoindukcyjnym macierzy bydlęcej; Proponowany system hodowli można jednak ekstrapolować na dowolny materiał porowaty o rozkładzie porów od 20 do 200 μm. W związku z tym procedura przedstawiona w niniejszej pracy jest alternatywną metodą hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych w różnych materiałach stosowanych w inżynierii tkankowej, zwłaszcza w regeneracji kości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		hodowla komórkowa
penicylina-streptomycyna	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		hodowla komórkowa
FBS	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		hodowla komórkowa
Zmodyfikowane podłoże Orła (DMEM) firmy Dulbecco o wysokim poziomie glukozy	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES	11965118	hodowla komórkowa
kolagenaza typu II	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		hodowla
komórkowa 3 mM chlorek wapnia	SIGMA_ALDRICH	C5670	trypsyna do hodowli komórkowej
0,5 mM roztwór EDTA	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		hodowla komórkowa
Roztwór błękitu trypanowego	GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES		hodowli komórkowej
fikoerytryna (PerCP) sprzężona z fikoerytryną (PerCP)	Pharmigen	562245	cytomera
FITC-CD90,BD	Pharmigen	562245	cytomera
PE-CD34	BD Pharmigen	562245	cytomera
FITC-CD45	BD Pharmigen	562245	cytomera
PE-CD105	BD Pharmigen	562245	cytomera
BD FACSCalibur Cytometr przepływowy	BD Pharmigen	BD FACSCalibur	cytomery
alamarBlue (AB)	LIFE TECHNOLOGIES	DAL1025	test komórek proliferacyjnych
SUNRISE-reader	TECAN, Niemcy	Test komórek proliferacyjnych	Sunrise

10010023 10378016 26140111 17101015 / R001100 15250061