Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Podsumowanie

Reakcje alergiczne, charakteryzujące się aktywacją komórek tucznych i bazofilów, są napędzane przez sieciowanie IgE i uwalnianie mediatorów prozapalnych. Ilościową ocenę reakcji alergicznych można uzyskać, stosując barwnik Evans Blue do monitorowania zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych po prowokacji alergenem.

Streszczenie

Reakcje alergiczne są wynikiem aktywacji komórek tucznych i bazofilów, a następnie uwolnienia mediatorów wazoaktywnych i prozapalnych. Narażenie na alergen u osoby uczulonej może powodować objawy kliniczne, które wahają się od niewielkiego rumienia do zagrażającej życiu anafilaksji. W laboratorium opracowano różne modele zwierzęce, aby zrozumieć mechanizmy kierujące reakcjami alergicznymi. W niniejszym artykule opisujemy szczegółową metodę pomiaru zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych w celu ilościowego określenia zlokalizowanych reakcji alergicznych. Test miejscowej anafilaksji został po raz pierwszy opisany w 1920 roku i został zaadaptowany z techniki opublikowanej przez Kojima i wsp. W 2007 r.¹. W tym teście myszy uczulone na OVA są prowokowane w lewym uchu z nośnikiem, a w prawym uchu z OVA. Następnie podaje się dożylne wstrzyknięcie barwnika Evans Blue. Dziesięć minut po wstrzyknięciu Evans Blue zwierzę zostaje poddane eutanazji, a barwnik, który wynaczynił się do uszu, jest ekstrahowany przez noc w formamidzie. Absorbancja wyekstrahowanego barwnika jest następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrofotometru. Ta metoda niezawodnie daje wizualny i wymierny objaw miejscowej reakcji alergicznej.

Wprowadzenie

Nadwrażliwość typu I jest spowodowana przez indukowane antygenem sieciowanie IgE na powierzchni komórek tucznych i bazofilów. Powoduje to degranulację komórkową i uwalnianie mediatorów wazoaktywnych i prozapalnych, takich jak histamina, tryptaza i czynnik aktywujący płytki krwi². Po uwolnieniu wstępnie uformowanych mediatorów podczas degranulacji, komórki tuczne syntetyzują i uwalniają prostaglandyny i leukotrieny, które dodatkowo zwiększają przepuszczalność naczyń^{krwionośnych 3}. Początkowa odpowiedź kliniczna pojawia się szybko i jest określana jako "reakcja natychmiastowa". W skórze reakcja bąbla i zaostrzenia jest łatwo widoczna w ciągu kilku minut od prowokacji antygenem. W zależności od dawki prowokacji, możliwe jest zaobserwowanie "odpowiedzi późnej fazy" kilka godzin później. Obrzęk późnej fazy jest spowodowany miejscowym obrzękiem i rekrutacją leukocytów do tkanek². Histamina, powszechnie uważana za główny mediator biorący udział w natychmiastowych reakcjach alergicznych, działa na receptor histaminowy 1 (HR1) wyrażany na naczyniach i receptor histaminowy 2 (HR2) wyrażany na mięśniach gładkich. Połączone działanie zwiększa przepływ krwi i przepuszczalność naczyń w miejscu zapalenia⁴.

W celu zbadania mechanizmów związanych z alergicznym zapaleniem opracowano różne modele zwierzęce, w tym modele astmy alergicznej, anafilaksji ogólnoustrojowej i anafilaksji miejscowej. Dożylne podawanie barwnika jest stosowane do pomiaru miejscowych reakcji alergicznych w modelach zwierzęcych od prawie wieku, a publikacje opisujące tę technikę pochodzą z lat dwudziestych XX wieku^. Króliki i świnki morskie były pierwszymi modelami zwierzęcymi używanymi do testowania natychmiastowych reakcji nadwrażliwości, a najbardziej czułe reakcje znajdowano na ogół w uchu^5,6. Test został później zatwierdzony do stosowania u szczurów⁷ i myszy⁸.

Historycznie, stosowano różne metody eksperymentalne, w tym wstrzyknięcie antygenu przed wstrzyknięciem barwnika, wstrzyknięcie barwnika przed wstrzyknięciem antygenu oraz jednoczesne wstrzyknięcie barwnika i antygenu. Dożylne podawanie barwnika jako sposób pomiaru reakcji alergicznych jest wszechstronnym testem, ponieważ może być stosowane do pomiaru aktywnych, biernych i odwrotnych reakcji biernych^5,9. Do oceny reakcji alergicznych wykorzystano liczne barwniki, w tym Trypan Blue, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blue 536 i India Ink^5,6,9. Roztwór 0,5% Evans Blue jest obecnie standardowym barwnikiem stosowanym do pomiaru reakcji alergicznych w skórze.

Reakcja anafilaktyczna na wyzwanie jest przejściowa; maksymalna intensywność jest osiągana w ciągu 10 - 15 minut od wstrzyknięcia barwnika, a żadna reakcja nie jest widoczna, jeśli barwnik jest podawany później niż 30 minut po prowokacji, niezależnie od użytego gatunku zwierzęcia⁹. Kwantyfikacja wynaczynienia barwnika została pierwotnie uzyskana przez pomiar wielkości bąbla, jak wskazuje niebieski barwnik^7-9. Dodatkowo liczbę zdegranulowanych komórek tucznych można określić ilościowo, wycinając tkankę skórną z miejsca reakcji i barwiąc błękitem toluidynowym⁷. Degranulacja komórek tucznych jest często stosowana jako marker skórnych odpowiedzi alergicznych zależnych od IgE, ponieważ komórki tuczne są główną lokalną populacją komórek wyrażających receptor IgE o wysokim powinowactwie FcεRI. Techniki spektrofotometryczne do pomiaru wynaczynienia barwnika do tkanki zostały opracowane dla biernej anafilaksji skórnej (PCA) u szczurów¹⁰ i myszy¹¹ w latach 90.

Następujący protokół testu anafilaksji miejscowej został zaadaptowany z Kojima et al. ¹ i wykorzystuje albuminę jaja kurzego (OVA) jako antygen do wywoływania reakcji alergicznych. Jednak w razie potrzeby można użyć antygenów innych niż OVA. Test następnie wykorzystuje niebieski barwnik Evansa do monitorowania zmian w przepuszczalności naczyń krwionośnych, które występują w wyniku sieciowania komórek tucznych IgE i uwalniania histaminy.

Protokół

1. Uwrażliwić myszy

1. Przygotować roztwór podstawowy OVA, rozcieńczając OVA w 1x PBS do końcowego stężenia 20 mg/ml. Roztwory należy zamrozić w kriowiałach i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
2. Doprowadzić jedną lub więcej podwielokrotności 20 mg/ml materiału wyjściowego OVA do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć OVA w 1x PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml w 5 ml polistyrenowej probówce z okrągłym dnem z nakrętką. Krótko zmieszaj, aby wymieszać.
3. Trzymając probówkę z polistyrenu zawierającą 1 mg/ml OVA na wirze ustawionym na średnią prędkość, dodać kroplami równą objętość dokładnie zhomogenizowanego ałunu Imject (40 mg/ml), kontynuując wirowanie probówki, aby uzyskać stosunek ałunu do immunogenu w stosunku 1:1.
4. Umieść nasadkę na tubie i przyklej rurkę do wiru. Ustaw wir na najniższym ustawieniu i pozwól OVA adsorbować się do ałunu przez 30 minut.
   1. Nie pozwól, aby upłynęła duża ilość czasu między przygotowaniem OVA/Ałunu a uczuleniem myszy. Jeśli uczulenie nie może być zakończone bezpośrednio po przygotowaniu OVA/Ałun, przechowuj OVA/Ałun w temperaturze pokojowej. Wirować przez 1 minutę przed użyciem.
5. Załadować strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml mieszaniną OVA/Ałun. Nastrzykać strzykawkę igłą o rozmiarze 27.
6. Wstrzyknąć 100 μl OVA/Alum do otrzewnej myszy BALB/c w dawce 50 μg OVA i 2 mg ałunu na mysz.
7. W celu kontroli ujemnej należy uczulić inną grupę myszy na PBS. Przygotuj mieszaninę ałunu i PBS w stosunku 1:1 w taki sam sposób, jak podano powyżej, pomijając OVA.
8. Uczulaj wszystkie myszy (kontrola OVA i PBS) raz w tygodniu przez 3 tygodnie, w sumie 3 wstrzyknięcia. Po ostatnim wstrzyknięciu należy odczekać co najmniej 2 tygodnie przed wykonaniem miejscowego testu anafilaksji.

2. Miejscowy test anafilaksji

1. Doprowadzić roztwór podstawowy OVA do temperatury pokojowej. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 20 mg/ml materiału OVA do końcowego stężenia 5 mg/ml za pomocą PBS (rozcieńczenie OVA 1:4 w 1X PBS). Krótko zmieszaj, aby wymieszać.
2. Znieczulenie myszy za pomocą systemu znieczulenia gryzoni RC² (lub porównywalnego systemu dostarczania oparów). Napełnij zbiornik izofluranem i włącz przepływ powietrza O₂. Umieść myszy w komorze indukcyjnej i ustaw pokrętło sterujące izofluranem na 5%, aby rozpocząć znieczulenie. Gdy myszy są w pełni znieczulone, co wskazuje na brak mobilności, ustaw pokrętło kontrolne izofluranu na 3%, aby utrzymać głębokie znieczulenie. Celem znieczulenia w tej procedurze jest unieruchomienie zwierzęcia. Iniekcje do ucha i żyły ogonowej nie powodują znacznego bólu ani niepokoju u zwierzęcia.
   UWAGA: Izofluran może mieć negatywny wpływ na układ rozrodczy człowieka. Pamiętaj, aby używać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i przymocować kanister przedmuchujący do komory indukcyjnej, aby zneutralizować gazy odlotowe. Jeśli jesteś w ciąży podczas stosowania izofluranu, noś maskę z filtrem węglowym, aby zminimalizować narażenie.
3. Załadować 10 μl 5 mg/ml OVA do strzykawki insulinowej o pojemności 3/10 ml z igłą 31 G. Załaduj kolejną strzykawkę insulinową o pojemności 3/10 ml z 10 μl 1x PBS.
4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wstrzyknąć 10 μl OVA do prawego ucha znieczulonej myszy w celu uzyskania dawki prowokacyjnej 50 μg OVA. Dopuszczalne są również inne dawki, takie jak 20 μg.
   1. Aby ustabilizować ucho do wstrzykiwań, owinąć taśmę klejącą (lepką stroną do góry) wokół stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Przymocuj grzbietową stronę prawego ucha do taśmy. Włóż igłę skośną stroną do góry między dwa listki ucha. Powoli wstrzyknąć OVA w środek tkanki ucha, uważając, aby nie uderzyć w żadne naczynia krwionośne.
5. Stosując tę samą metodę opisaną powyżej, wstrzyknąć 10 μl PBS do lewego ucha jako kontrolę ujemną.
6. Poczekaj 3 min.
   1. W tym czasie umieść mysz w uchwycie i trzymaj ogon pod lampą grzewczą lub w ciepłej kąpieli wodnej przez 1 minutę, aby rozszerzyć naczynia krwionośne.
7. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml zwieńczonej igłą 27 G, powoli wstrzyknij 200 μl 0,5% barwnika Evans Blue do żyły ogonowej myszy. Szybkie wstrzyknięcie może zniszczyć strukturę naczynia przed podaniem całych 200 μl. Jeśli tak się stanie, spróbuj wstrzyknąć pozostałą objętość barwnika do żyły po przeciwnej stronie ogona.
8. Odczekaj 10 min.
9. Poddaj mysz eutanazji i usuń oba uszy za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych.
   1. Chwyć krawędzie ucha kleszczami, upewniając się, że nie wywierany jest nacisk na miejsce wstrzyknięcia na środku ucha. Usuń jak najwięcej tkanki ucha, przecinając ją blisko, ale nie przez grzbiet chrząstki znajdujący się u podstawy ucha. Na wyciętym uchu mogą znajdować się niewielkie ilości sierści; Nie będzie to miało wpływu na test.
10. Podaniec 700 μl formamidu do 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Przygotuj jedną rurkę na ucho (dwie rurki na mysz).
    UWAGA: Formamid jest teratogenny, mutagenny i drażniący. Nosić rękawice, okulary ochronne i ochronę twarzy. Kobiety w ciąży powinny zachować ostrożność podczas obchodzenia się z formamidem, ponieważ może być fetotoksyczny.
11. Dodać kłosy do formamidu, zakryć probówki i inkubować przez noc w suchej łaźni grzewczej ustawionej na 63 °C. Uszy mogą nadal wydawać się lekko niebieskie po inkubacji, jednak większość barwnika zostanie wyekstrahowana do formamidu.
12. Dodać 300 μl każdej próbki, po dwóch kroplach, do płytki 96-dołkowej. Unikaj przenoszenia futra, jeśli jest ono obecne w próbce. Upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków, ponieważ wpłyną one na odczyt absorbancji.
13. Dodać 300 μl formamidu, w dwóch odstępach, do płytki 96-dołkowej. Te studnie będą używane jako półfabrykaty.
14. Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć absorbancję przy 620 nm. Odejmij studzienki formamidu od każdego odczytu próbki.
    UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytecką Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt przy Służbach Mundurowych.

Wyniki

Zwierzęta, które pomyślnie przeszły test, będą miały skórę i oczy wyglądające na niebieskie. Zwierzęta uczulone na PBS nie powinny reagować ani na PBS, ani na prowokację OVA, dlatego oba uszy powinny pozostać białe (ryc. 1A). U zwierząt uczulonych na OVA ucho otrzymujące prowokację PBS (po lewej) powinno być albo całkowicie białe, albo lekko niebieskie w sposób zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia. Ucho otrzymujące prowokację OVA (po prawej) powinno stawać się stopniowo ciemnoniebieskie w ciągu 10 minut...

Dyskusja

Liczne markery choroby alergicznej są wykorzystywane do oceny siły reakcji alergicznych po prowokacji alergenem, w tym zmian poziomu krążącej histaminy, produkcji cytokin Th2 i rekrutacji komórek do płynu oskrzelowo-pęcherzykowego w warunkach prowokacji dróg oddechowych. Chociaż monitorowanie zmian tych parametrów jest ważne dla badania reakcji alergicznych, markery biologiczne nie zawsze korelują z kliniczną chorobą alergiczną. Test miejscowej anafilaksji opisany w tym protokole zapewnia powtarzalny pomiar miejscowej pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy BALB/c	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7,4	Jakość Biologic	114-058-101
Albumina jaja kurzego	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Dokładnie wymieszaj przed użyciem
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamid	Sigma	295876	99%+ Izofluran klasy spektrofotometrycznej
, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Strzykawki insulinowe	BD	329654
3/10 cc Strzykawka insulinowa z igłą 31 G	Terumo	NDC 100861
27 G Igły	BD	305109
Kleszcze	FST	11000-12
Nożyczki chirurgiczne	FST.14070-12
5 ml Polistyrenowe probówki okrągłodenne	BD Falcon	352058
1,5 ml Probówki do mikrowirówek	Partnerzy zaopatrzenia medycznego	15-1151
15 ml Probówki stożkowe	BD Falcon	352097
Płytka płaskodenna 96-dołkowa	Costar	3590
Taśma
RC2 System znieczulenia gryzoni	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 z 3-calową platformą