Artykuł metodologiczny

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/52010

⸱

23 września 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje pilna potrzeba opracowania metod naprawy uszkodzonego serca, odkrycia nowych leków terapeutycznych, które nie mają toksycznego wpływu na serce, oraz ulepszenia strategii dokładnego modelowania chorób serca. Potencjał wykorzystania technologii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do generowania mięśnia sercowego "w naczyniu" do tych zastosowań nadal wzbudza duże zainteresowanie. W ostatnich latach zdolność do wydajnego generowania komórek kardiomiogennych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) znacznie się poprawiła, oferując nam nowe możliwości modelowania bardzo wczesnych etapów rozwoju serca człowieka, które nie są dostępne w inny sposób. W przeciwieństwie do wielu poprzednich metod, opisany tutaj protokół różnicowania kardiomiocytów nie wymaga agregacji komórek ani dodawania aktywiny A lub BMP4 i solidnie generuje kultury komórek, które są wysoce dodatnie dla sercowej troponiny I i T (TNNI3, TNNT2), białka homeodomeny klasy irokezów IRX-4 (IRX4), regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny 2, izoformy komór/mięśnia sercowego (MLC2v) i regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny 2, izoforma przedsionkowa (MLC2a) do 10 dnia we wszystkich przebadanych do tej pory liniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i hiPSC. Komórki mogą być pasażowane i utrzymywane w hodowli przez ponad 90 dni. Strategia jest technicznie prosta do wdrożenia i opłacalna. Charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z komórek pluripotencjalnych często obejmuje analizę markerów referencyjnych, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W przypadku analizy białek cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem analitycznym do oceny jakości komórek w hodowli i określania jednorodności subpopulacji. Jednak różnice techniczne w przygotowaniu próbek mogą znacząco wpłynąć na jakość danych z cytometrii przepływowej. W związku z tym standaryzacja protokołów barwienia powinna ułatwić porównania między różnymi strategiami różnicowania. W związku z tym opisano zoptymalizowane protokoły barwienia do analizy IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 i TNNT2 za pomocą cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generacja kardiomiocytów z hPSC, w tym hESC i hiPSC, może funkcjonować jako model in vitro bardzo wczesnych procesów rozwojowych ludzkiego serca, dostarczając wglądu w etapy niedostępne dla badań mechanistycznych. Ten system modelowy zapewnia unikalne możliwości badania szlaków molekularnych, które kontrolują zaangażowanie linii serca i specyfikację losu komórki. W ostatnich latach znacznie poprawiła się zdolność do wydajnego generowania komórek kardiomiogennych z hPSC1-15. Jednak wśród protokołów występuje zmienność linii komórkowej w odniesieniu do wydajności w generowaniu komórek kardiomiogennych i czasu, w którym komórki wyrażają markery specyficzne dla komory (np. komora i przedsionki). Idealnie, dla przyszłych zastosowań tego systemu modelowego, pożądane są bardziej jednorodne populacje funkcjonalnie zdefiniowanych komórek. W przeciwieństwie do poprzednich metod, opisany tutaj protokół różnicowania kardiomiocytów nie wymaga agregacji komórek ani dodawania aktywiny A lub białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i solidnie generuje kultury wysoce dodatnie dla TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v i MLC2a do 10 dnia komórek we wszystkich testowanych do tej pory liniach hESC i hiPSC. Strategia ta jest technicznie prosta do wdrożenia, zwłaszcza w porównaniu z kulturami trójwymiarowymi, kulturami masowymi lub strategiami opartymi na ciele embrionalnym4-9, a ostatnio została zdefiniowana w badaniu, które opisuje małą cząsteczkę o selektywnej toksyczności dla hPSC (Boheler i wsp.)65. Cechy tego protokołu obejmują różnicowanie hPSC w hodowli jednowarstwowej przy użyciu pojedynczej warstwy matrycy kwalifikowanej do hESC (Matrigel), w pełni zdefiniowane pożywki wykorzystujące małe cząsteczki do modulacji sygnalizacji Wnt (podobne, ale różne od1,2,7,13) oraz zoptymalizowane metody barwienia cytometrii przepływowej do oceny wydajności różnicowania i tożsamości komórki. Podsumowując, zalety tego protokołu w porównaniu z poprzednimi raportami obejmują jego opłacalność, odtwarzalność i wysoką skuteczność w generowaniu kardiomiocytów wśród wielu linii hPSC, w tym linii hESC i hiPSC.

Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem analitycznym do oceny jakości komórek w hodowli i określania jednorodności subpopulacji, a przy odpowiednim projekcie eksperymentalnym może dostarczyć pomiarów ilościowych. Podobnie jak w przypadku wszystkich strategii opartych na przeciwciałach, dokładna interpretacja wyników eksperymentalnych wymaga, aby elementy projektu testu, w tym stężenie przeciwciał oraz warunki wiązania i przenikania (w przypadku celowania w antygeny wewnątrzkomórkowe), zostały dokładnie przetestowane dla każdego przeciwciała, ponieważ warunki nieoptymalne znacząco wpływają na skuteczność wiązania przeciwciał, a tym samym na interpretację wyników. Co ważne, jeśli wymagane jest oznaczanie ilościowe, niezbędne są przeciwciała monoklonalne, ponieważ przeciwciała poliklonalne mogą rozpoznawać wiele epitopów i są podatne na zmiany między partiami. Obecnie opisano różne protokoły przeciwciał (poliklonalnych i monoklonalnych) oraz barwienia do oceny różnicowania in vitro, co utrudnia porównanie skuteczności kardiomiogenezy między protokołami1,2,9,11. Z tego powodu przeciwciała monoklonalne są stosowane, jeśli są dostępne, do wszystkich analiz cytometrii przepływowej. Idąc dalej, oczekuje się, że standaryzacja tych protokołów barwienia, zwłaszcza w odniesieniu do oceny ilościowej, powinna lepiej umożliwić porównanie strategii różnicowania.

Wybór markerów i odpowiadających im przeciwciał, używanych do oceny czystości kardiomiogenezy in vitro, różni się w zależności od raportu. TNNT2 został uznany za wskaźnik komórek zaangażowanych w kardiomiogenny los i jest rutynowo stosowany do oceny skuteczności protokołów różnicowania serca. Jednak TNNT2 ulega również ekspresji w mięśniach szkieletowych podczas wczesnego rozwoju piskląt i szczurów16,17 i jest obecny w mięśniach gładkich człowieka18. Tak więc TNNT2 niekoniecznie jest specyficznym markerem ludzkiej kardiomiogenezy in vitro. MLC2v i MLC2a są rutynowo stosowane jako markery zastępcze odpowiednio podtypów komorowych i przedsionkowych. Jednak wyzwania związane z poleganiem na MLC2v i MLC2a w celu określenia podtypu kardiomiocytów w kontekście różnicowania in vitro wynikają z faktu, że te produkty genów mogą nie być ograniczone do określonej komory przez cały okres rozwoju serca, od cewy serca do osoby dorosłej. W zapętlonym sercu gryzoni mRNA MLC2a dominuje w obszarze dróg przedsionkowych/dopływowych, a mRNA MLC2v dominuje w obszarach dróg komorowych/odpływowych. W zapętlonym sercu koekspresję mRNA MLC2a i MLC2v obserwuje się w przewodzie dopływowym, kanale przedsionkowo-komorowym i drodze odpływu19,20. Do 3 dni po urodzeniu mRNA MLC2v jest ograniczone do komory, a po 10 dniach po urodzeniu MLC2a jest ograniczone do przedsionków w sercu noworodkaszczura 19. W związku z tym interpretacja danych dotyczących skuteczności kardiomiogenezy i tożsamości podtypu musi uwzględniać nie tylko obecność i ilość poziomów markerów referencyjnych, ale także etap (etapy) rozwojowy, któremu odpowiadają analizowane punkty czasowe różnicowania. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę, że etap dojrzewania komórek kardiomiogennych powstałych w wyniku różnicowania hPSC in vitro najbardziej przypomina etap rozwoju embrionalnego/płodowego21-25. W związku z tym poleganie na ekspresji przestrzennej markera w sercu po urodzeniu może nie być odpowiednie do oceny komórek pochodzących z hPSC, przynajmniej w niektórych przypadkach.

W celu ułatwienia opracowania bardziej szczegółowych kryteriów definiowania tożsamości kardiomiocytów in vitro, TNNI3 jest uważany za cenny marker do oceny kardiomiogenezy in vitro, ponieważ jest ograniczony do mięśnia sercowego podczas embriogenezy u piskląt i danio pręgowanego15,20 i nie występuje w ludzkich mięśniach szkieletowych płodu26. Podczas gdy TNNI1 jest obecny w ludzkim sercu płodu, TNNI3 jest jedyną izoformą TNNI obecną w normalnym sercu dorosłegoczłowieka 27,28. Jeśli chodzi o tożsamość podtypu kardiomiocytów, IRX429-31 jest informacyjnym markerem komórek z losem komorowym. Na poziomie białka ostatnio wykazano, że IRX4 jest ograniczony do komory od liniowej rurki serca przez stadium noworodkowe u myszy32. W związku z tym opisano zoptymalizowane protokoły barwienia do analizy TNNI3 i IRX4 za pomocą cytometrii przepływowej. Według naszej wiedzy jest to pierwszy opis metody skutecznego barwienia i analizy poziomów IRX4 w ludzkich kardiomiocytach za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu i podłoża

  1. Roztwór podstawowy do powlekania matrycy z kwalifikacją hESC
    1. Powoli rozmrażać matrycę kwalifikowaną do hESC (5 ml) na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Dozować porcje do wstępnie schłodzonych, sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze -20 ºC.
      UWAGA: Objętość podwielokrotności będzie się różnić w zależności od partii i zwykle waha się w zakresie 270-350 μl. Producent podaje szczegółowe informacje dotyczące objętości podwielokrotności wymaganej do osiągnięcia stężenia 1x po rozcieńczeniu do 25 ml, jak opisano w kroku 2.1.
  2. Rozwiązania stockowe hPSC Media
    1. Używaj ultraczystej wody jako rozcieńczalnika, chyba że wskazano inaczej. Wysterylizuj wszystkie składniki za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w postaci roztworów sypkich w temperaturze 4 °C: wodorowęglan sodu (75 mg/ml); kwas cytrynowy (10 mM, pH = 3).
    2. Wysterylizować wszystkie składniki za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i przechowywać każdy w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 ºC: inhibitor kinazy Rho (ROCK) Y-27632 (10 mM w DPBS, 100 μl podwielokrotności); 2-fosforan kwasu L-askorbinowego (64 mg/ml, 500 μl podwielokrotności); selenin sodu (70 μg/ml, 100 μl podwielokrotności); transferyna (50 mg/ml, 107 μl podwielokrotności); czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2; 200 ng/μl w DPBS, 250 μl podwielokrotności); transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGFβ1, 100 ng/μl w zimnym 10 mM kwasu cytrynowego, 10 μl podwielokrotności).
  3. Skład roztworu hPSC Media E8
    1. Przygotować pożywki przy użyciu podwielokrotności przygotowanych w kroku 1.2: DMEM/F12 (z L-glutaminą i HEPES; 500 ml), wodorowęglan sodu (3,62 ml; wersja ostateczna: 543 μg/ml), 2-fosforan kwasu L-askorbinowego (500 μl; wersja ostateczna: 64 μg/ml), selenin sodu (100 μl; wersja ostateczna: 140 ng/ml), transferyna (107 μl; wersja ostateczna: 10,7 μg/ml), insulina (1 ml; wersja ostateczna: 20 μg/ml), FGF2 (250 μl; wersja końcowa: 100 ng/ml), TGFβ1 (10 μl; wersja końcowa: 2 ng/ml).
    2. Połącz wszystkie składniki, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 ºC do 2 tygodni.
  4. hPSC Media E8 z inhibitorem ROCK
    1. Dodać 15 μl inhibitora ROCK do 12 ml pożywki E8 przygotowanej jak powyżej i dobrze wymieszać. Upewnij się, że końcowe stężenie wynosi 10 μM po dodaniu komórek/pożywki w kroku 3.7.
  5. Standardowe rozwiązania modulatorów Wnt
    1. Następujące podwielokrotności przechowywać w temperaturze -20 °C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-dichlorofenylo)-5-(5-metylo-1 H-imidazol-2-ylo)-2-pirymidynylo]amino]etylo]amino]-3-pirydynokarbonitryl; 10 mM w DMSO, 15 μl podwielokrotności). IWR-1 (4-(1,3,3a,4,7,7a-heksahydro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-izoindol-2-ylo)-N-8-chinolinylo-benzamid; 10 mM w DMSO, 6 μl podwielokrotności).
  6. Zróżnicowane media
    1. Przygotuj pożywkę różnicującą #1 z RPMI 1640 (z L-glutaminą) z 2% B27 minus suplement insuliny.
    2. Przygotuj pożywkę różnicującą #2 z RPMI 1640 (z L-glutaminą) z 2% B27 plus suplement insuliny i 2% FBS.
  7. Roztwór do płukania komórek do hodowli komórkowych
    1. Stosować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, bez wapnia i magnezu.
  8. Roztwór do płukania komórek do cytometrii przepływowej
    1. Stosować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, bez wapnia i magnezu) z 1% FBS. Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
  9. Rozwiązanie do konserwacji komórek w cytometrii przepływowej
    1. Użyj Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; bez wapnia i magnezu) z 5% FBS. Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
  10. Roztwory fiksacyjne do cytometrii przepływowej
    1. Należy stosować bufor Cytofix jako roztwór utrwalający przeciwciała TNNI3 i IRX4.
    2. Użyj 4% paraformaldehydu w 1x PBS (make fresh) jako roztwór utrwalający przeciwciała TNNT2 i MLC2a.
    3. Użyj 70% metanolu/30% acetonu jako roztworu utrwalającego przeciwciało MLC2v.
    4. Przechowywać wszystkie roztwory w temperaturze 4 °C.
  11. Roztwory permeabilizacji do cytometrii przepływowej
    1. Użyj Phosflow Perm Buffer III jako roztworu do permeabilizacji przeciwciał TNNI3 i IRX4. Przechowywać w temperaturze pokojowej (25 °C).
    2. Użyj 0,2% Triton X-100 w 1x PBS jako roztwór przepuszczalny dla przeciwciał TNNT2, MLC2v i MLC2a. Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
  12. Rozwiązanie blokujące
    1. Użyj 10% koziego serum w 1x PBS. Przygotuj świeże i przechowuj w temperaturze 4 ºC do czasu użycia.

2. Powłoka płyty

  1. Powoli rozmrażać 1 podwielokrotność kwalifikowanej matrycy hESC w temperaturze 4 °C przez 30 minut, dodać do 25 ml schłodzonego DMEM/F12 i dobrze wymieszać w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkankowych bezpośrednio przed pokryciem płytek 6-dołkowych.
  2. Dodać 1 ml do dołka 6-dołkowej płytki pod wysterylizowanym kapturem do hodowli tkankowych (1 podwielokrotność matrycy kwalifikowanej do hESC wystarcza do pokrycia czterech płytek 6-dołkowych).
  3. Pozwól, aby matryca z kwalifikacją hESC zastygła na 30 minut w temperaturze pokojowej pod maską. Odessać nadmiar matrycy kwalifikowanej do hESC i dodać 2 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do każdej studzienki. Płytki należy zużyć natychmiast lub, w razie potrzeby, przechowywać w temperaturze 4 °C bezpośrednio po posianiu przez okres do 1 tygodnia i utrzymywać w równowadze do temperatury pokojowej przez 30 minut przed użyciem.

3. Pasaż i utrzymanie niezróżnicowanych hPSC w hodowli jednowarstwowej

  1. Utrzymuj hPSC w hodowli jednowarstwowej na płytkach 6-dołkowych i wykonuj wszystkie etapy pod sterylnym kapturem do hodowli tkankowej.
  2. Stosować linie hPSC, które są dobrze ugruntowane (>p20) i wykazują jednorodną morfologię bez obecności komórek o morfologii podobnej do neuronalnej, nabłonkowej lub fibroblastów. Upewnij się, że komórki rozmnażają się silnie i średnio przechodzą co trzy dni przy 75% konfluencji, gdy są wysiewane w temperaturze 0,75 x 106 na studzienkę.
  3. Pasaż hPSC z dysocjacją do poziomu pojedynczej komórki co najmniej 5 razy przed rozpoczęciem różnicowania, aby zapewnić maksymalną efektywność różnicowania. Aby przejść przez hPSC, odessać pożywkę E8 i dwukrotnie przemyć komórki 4 ml 1x DPBS (wstępnie podgrzanego do temperatury pokojowej). Dodaj 1 ml roztworu do oddzielania komórek (wstępnie podgrzanego do temperatury pokojowej) do każdej studzienki i pozostaw studzienkę w spokoju na 3-7 minut, aż granice komórek zaczną się zaokrąglać.
  4. Za pomocą szklanej pipety z bawełnianym korkiem z gruszką usunąć komórki i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml pożywki DMEM/F12 (w celu dezaktywacji roztworu do odrywania komórek).
  5. Pobrać 10 μl podwielokrotności roztworu komórkowego i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki. Zlicz komórki (np. hemocytometr automatyczny lub ręczny), podczas gdy pozostałe komórki zbiera się przez odwirowanie przy 130 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Korzystając z tego protokołu, spodziewaj się 70-80% żywotności za pomocą automatycznego hemocytometru, a idąc dalej, opieraj wszystkie liczby komórek na całkowitej liczbie komórek.
  6. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w DMEM/F12 do końcowego stężenia 0,75 x 106 komórek na 500 μl.
  7. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka na płytce 6-dołkowej, gdzie każda studzienka zawiera 2 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK, przygotowanej w kroku 2.3. Pozostawiając płytkę na blacie, delikatnie poruszaj się ruchem od przodu do tyłu i z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzience. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 ºC.
  8. Zaczynając 24 godziny po pasażu, codziennie wymieniaj pożywkę, używając 2 ml / studzienka E8 bez inhibitora ROCK. Zoptymalizuj gęstość siewu, aby osiągnąć 100% zbieżność przed rozpoczęciem różnicowania. Wysiew 0,75 x 106 komórek/dołek na cztery dni przed rozpoczęciem różnicowania, ale optymalizuj dla każdej linii komórkowej w razie potrzeby.

4. Indukcja hPSC w kardiomiocytach przez selektywną modulację szlaku Wnt

  1. Odświeżaj pożywkę (2 ml / dołek) codziennie w dniach 0-7 i co drugi dzień po 8 dniu.
  2. W dniu 0 rozpocznij proces różnicowania, zastępując nośniki E8 nośnikami różnicującymi #1. Dodaj 1,2 μl CHIR (6 μM końcowy) do każdego dołka. Powtórz w dniu 1.
  3. W dniach 2-3 zastąp je świeżymi pożywkami różnicującymi #1.
  4. W dniu 4 zastąp je świeżymi pożywkami różnicującymi #1. Dodać 1 μl IWR-1 (5 μM final) do każdego dołka. Powtórz w 5 dniu.
  5. W dniach 6-7 zastąp je świeżymi pożywkami różnicującymi #1.
  6. W dniu 8 zastąp je świeżymi pożywkami różnicującymi #2.
  7. Kontynuuj zastępowanie pożywką różnicującą #2 co drugi dzień dla pożądanego czasu hodowli.
  8. W razie potrzeby kardiomiocyty pasują za pomocą roztworu do odłączania komórek, postępując zgodnie z krokami opisanymi w 3.3-3.6, ale zastępując pożywkę pożywką różnicującą #2. Podczas pasażowania rozdziel kardiomiocyty na małe skupiska ~ 3-10 komórek. Wysiew w ~ 6 x 105 komórek na studzienkę przy użyciu dołków pokrytych matrycą z kwalifikacją hESC i pożywki różnicującej # 2.

5. Zbiór komórek do cytometrii przepływowej

  1. Wykonaj wszystkie pozostałe aspekty kroków 5-9 na stole laboratoryjnym (tj. nie sterylnie).
  2. Odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki 1x PBS. Dodaj 1 ml roztworu do oddzielania komórek (wstępnie podgrzanego do temperatury pokojowej) do każdej studzienki i pozostaw w spokoju na 3-7 minut, aż granice komórek zaczną się zaokrąglać. Użyj jednorazowej pipety 9" ze szkła borokrzemianowego z bawełnianym korkiem, aby usunąć komórki i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
  3. Przez pozostałą część protokołu utrzymuj komórki na lodzie i przeprowadzaj wirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 ºC.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór. Zawiesić komórki w 10 ml roztworu do przemywania komórek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml z wielokrotnym rozcieraniem, aby zapewnić rozproszenie grudek komórek na pojedyncze komórki. Policz komórki jak w kroku 3.5, podczas gdy pozostałe komórki zbiera się przez odwirowanie.
  5. Ponownie zawiesić komórki w roztworze do płukania komórek, uważając, aby całkowicie zdezagregować osad komórkowy i podzielić 1 x 106 komórek na probówkę z okrągłym dnem. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.

6. Utrwalanie i przenikanie komórek do wewnątrzkomórkowego barwienia antygenów

  1. Dodać 100 μl roztworu utrwalającego do osadu komórkowego. Dodawać roztwór kroplami, ciągłe, delikatne wirowanie, a następnie ustawić na lodzie na 15 minut.
  2. Dodać 3 ml roztworu do przemywania komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.
  3. Dodać 100 μl roztworu przepuszczalnego do osadu komórkowego. Dodawać roztwór kroplami, ciągł, delikatnie wirując, a następnie ustawić na lodzie na 30 minut. Należy stosować warunki fiksacji i przepuszczalności, jak opisano dla każdego przeciwciała w tabeli 1.
  4. Dodać 3 ml roztworu do przemywania komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór. Powtórz w sumie dwa prania po przepuszczalności.
powiedział:
Przeciwciało pierwotne (klon)Rozpoznany immunogen/epitopKontrola typu istotypuIlość przeciwciała pierwszorzędowego na 1 x 106 komórek w 100 μlRozwiązanie do naprawyRozwiązanie do przepuszczalnościPrzeciwciało wtórneIlość przeciwciała drugorzędowego/1 x 106 komórek w 100 μl
Dla procentu dodatnich pomiarówDo oznaczania ilościowego antygenu
TNNI3 (284 (19C7)ISASRKLQL (człowiek)Mysz IgG2b1,0 μg3,0 μgBD CytofixBd Phosflow trwała ondulacja IIIKozia anty-mysz IgG2b-Alexa488600 ng
TNNT2 (1C11)Pełnowymiarowe oczyszczone natywne ludzkie białko T troponiny.Mysz IgG11,0 μg2,0 μg4% PFA w 1% PBS0,2% Triton X-100 w 1% PBSKozia anty-mysz IgG1 - Alexa 488600 ng
MLC2v (330G5)FDPEGKG powiedział:Mysz IgG2a2,0 μg3,0 μg70% metanolu/30% acetonu0,2% Triton X-100 w 1% PBSKozia anty-mysia IgG2a - Alexa 647600 ng
Zobacz materiał MLC2a (4E7)pełnowymiarowe ludzkie rekombinowane białko ludzkiego MYL7 wytwarzane w E. coliMysz IgG10,5 μg3,0 μg4% PFA w 1% PBS0,2% Triton X-100 w 1% PBSKozia anty-mysz IgG1 - Alexa 488600 ng
IRX4LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST		Królik IgG0,5 μg0,5 μgBD CytofixBd Phosflow trwała ondulacja IIIKozia anty-królicza IgG-PE600 ng

Tabela 1. Stężenia przeciwciał. Wymieniono przeciwciało pierwszorzędowe, klon (w przypadku monoklonalne), zoptymalizowane stężenia oraz warunki wiązania i przepuszczalności dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego stosowanego do analiz cytometrii przepływowej. Ponieważ stężenia podstawowych przeciwciał mogą się różnić w zależności od dostawców tego samego klonu, podaje się końcowe stężenia każdego przeciwciała na 1 x 106 komórek w ustalonej objętości testu, a nie rozcieńczenia. Immunogen używany do wytwarzania przeciwciała lub epitopu rozpoznawanego przez przeciwciało, dostarczony przez producenta, jest wymieniony, ale nie został tutaj zweryfikowany eksperymentalnie.

7. Barwienie przeciwciał

  1. Dla każdego eksperymentu należy uwzględnić jedną niebarwioną kontrolę na warunek fiksacji/przepuszczalności oraz odpowiednią kontrolę izotypu dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego. Uwzględnij typy komórek nienależących do kardiomiocytów jako kontrolę ujemną (np. pluripotencjalne komórki macierzyste lub fibroblasty). Stosować kontrole izotypowe w tym samym stężeniu, co odpowiadające im przeciwciała pierwszorzędowe (patrz Tabela 1).
  2. Ponownie zawiesić komórki w roztworze blokującym o stężeniu 100 μl za pomocą pipety P200 w celu dezagregacji komórek. Umieść próbki na lodzie na 25 minut, delikatnie kołysząc.
  3. Nie usuwając roztworu blokującego, dodać pierwszorzędowe przeciwciało lub kontrolę izotypu zgodnie z wytycznymi w Tabeli 1. Inkubuj 45 minut na lodzie z delikatnym kołysaniem.
  4. Dodać 3 ml roztworu do przemywania komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór. Powtórz w sumie dwa płukania po znakowaniu przeciwciał pierwotnych.
  5. Jeżeli stosuje się przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z fluoroforem, należy przejść do punktu 8.1. Gdy stosuje się niesprzężone przeciwciało pierwszorzędowe (takie jak dla wszystkich opisanych tutaj markerów), wykonaj znakowanie przeciwciałem drugorzędowym, które jest sprzężone z fluoroforem w następujący sposób.
  6. Ponownie zawiesić komórki w roztworze blokującym o stężeniu 100 μl za pomocą pipety P200 w celu dezagregacji komórek.
  7. Dodać przeciwciało drugorzędowe zgodnie z wytycznymi w tabeli 1. Inkubować 30 minut na lodzie z delikatnym kołysaniem.
  8. Dodać 3 ml roztworu do przemywania komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór. Powtórz w sumie dwa płukania po wtórnym znakowaniu przeciwciałami.

8. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej

  1. Zawiesić komórki w roztworze do konserwacji komórek o stężeniu 400 μl za pomocą pipety P1000 w celu dezagregacji komórek.
  2. Przygotuj nasadkę sitka komórkowego na okrągłej probówce, wstępnie zwilżając ją 50 μl roztworu do konserwacji komórek. Ustaw rurkę na lodzie. Użyj nasadki sitka komórkowego, aby zapobiec zatykaniu cytometru przepływowego przez agregaty komórek.
  3. Przenieś roztwór komórek do nasadki sitka komórkowego i pozwól, aby zawiesina komórek spłynęła grawitacyjnie. W razie potrzeby delikatnie postukaj dnem probówki w blat stołu, aby komórki zostały zebrane do probówki i jak najszybciej odłożone z powrotem na lód. Przepłucz sitko 250 μl roztworu do konserwacji komórek, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek.
  4. Utrzymuj komórki na lodzie i chroń przed światłem do czasu analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

9. Analiza cytometrii przepływowej

Szczegółowe ustawienia akwizycji będą się różnić w zależności od instrumentu. Podstawowe parametry, które należy wziąć pod uwagę w celu optymalnego gromadzenia danych, opisano poniżej.

  1. Aby uzyskać optymalną stabilność strumienia, upewnij się, że rozmiar dyszy przekracza 5-6x średnicę analizowanej celi.
    UWAGA: Może się to różnić w zależności od przyrządu, ale jest to ważna kwestia zarówno w przypadku analizatorów, jak i wyboru odpowiedniego rozmiaru dyszy do sortowania komórek. Średnia średnica kardiomiocytów dnia 10 wynosi 11 μm (w zakresie 8-14 μm); W związku z tym dobrze sprawdza się standardowa rurka do wstrzykiwania próbki o średnicy 150 μm w analizatorze.
  2. Bezpośrednio przed analizą danych należy krótko zwirować każdą rurkę, aby rozproszyć agregaty komórek.
  3. Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia przedniego i bocznego dla każdego typu komórki w oparciu o niebarwioną kontrolę dla każdego warunku fiksacji/przepuszczalności użytego w eksperymencie, tak aby populacje będące przedmiotem zainteresowania były na skali i wyśrodkowane (rysunek 2A).
    1. Utrzymuj te ustawienia przez cały czas trwania jednego eksperymentu i bądź konsekwentny w każdym eksperymencie na tym samym instrumencie, ponieważ znaczne przesunięcia mogą wskazywać na potencjalne problemy z cytometrem przepływowym lub przygotowaniem próbki.
  4. Dla każdego fluoroforu przeanalizuj kontrolę izotypu i dostosuj odpowiednie napięcie lasera, aby określić minimalną intensywność wymaganą do uzyskania histogramu fluorescencji, który wyświetla zarówno lewą, jak i prawą krawędź piku. Zachowaj ustawienia lasera dla każdej kontroli izotypu podczas pozyskiwania danych na odpowiednich próbkach barwionych przeciwciałami.
    UWAGA: Dryft sygnału często występuje z czasem na tym samym instrumencie. Bardzo ważne jest, aby dostosować ustawienia lasera na początku każdego eksperymentu w oparciu o odpowiednią kontrolę izotypu.
  5. Zbierz co najmniej 10 000 wydarzeń. Preferowane jest 50 000 wydarzeń.
  6. W przypadku analiz statystycznych należy przesiatkować populację żywych komórek, aby wykluczyć szczątki (rysunek 2A). Określ procent dodatnich komórek w populacji bramkowanej na podstawie umiejscowienia markera, który pozwala na ≤2% udział kontroli izotypu, jak pokazano na rysunku 2B, C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dniu 0 komórki są w 100% zlewające się ze sobą o zwartej morfologii i minimalnej ilości szczątków komórek. W dniach 1-2 często obserwuje się znaczną śmierć komórek (40-50%), ale przyłączone komórki zachowają zwartą morfologię (ryc. 1A). W tym czasie podłoże jest pomarańczowe i mętne. Różowe podłoże wskazuje na nadmierną śmierć komórki, aw takim przypadku potwierdź za pomocą błękitu trypanowego i przerwij, jeśli śmierć komórki przekroczy 70%. Komórki zregenerują się w ciągu 3-4 dni, a gęstość wzrośnie. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu różnicowania ma zastosowanie wysokiej jakości kultur hPSC, które były pasażowane na poziomie pojedynczej komórki przez co najmniej pięć pasaży przed rozpoczęciem różnicowania. Podobną skuteczność różnicowania obserwuje się rutynowo wśród różnych linii hPSC, jeśli są one w 100% zlewające się na początku różnicowania, niezależnie od linii komórkowej. Nieoptymalną wydajność obserwuje się, jeśli zbieg komórek na początku różnicowania wynosi ≤95% lub >100%. Dlatego gęstość siewu i c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NIH 4R00HL094708-03, MCW Research Affairs Committee New Faculty Award oraz fundację Kern (fundusze startowe) w Medical College of Wisconsin (RLG); Rada ds. Grantów Badawczych Hongkongu Tematyczny Program Badawczy T13-706/11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 oraz Nagroda Ustanowionego Badacza AHA (JCW); Stypendium podoktorskie AHA 12POST12050254 (PWB). Dziękujemy Hope Campbell z Flow Cytometry Core w Instytucie Badań Krwi w Wisconsin za pomoc w zbieraniu danych i starannej recenzji manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell Culture
BD Matrigel, matryca z kwalifikacją hESCBD Biosciences354277
Roztwór do odłączania komórek AccutaseTechnologie komórek macierzystych7920
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezuLife Technologies14190-136
Dimetylosulfotlenek (DMSO, Hybri-Max, sterylnie filtrowany)Sigma AldrichD2650
Wodorowęglan soduSigma Aldrich53817
Kwas cytrynowySigma AldrichC2404-100G
Y-27632 dichlorowodorek selektywny inhibitor p160ROCKR& D Systems1254
Kwas L-askorbinowy-2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat SigmaAldrichA8960-5G
Selenin soduSigma AldrichS5261-10G
Transferyna (Optiferrin – Zdefiniowany, wolny od zwierząt, rekombinowany człowiek)Invitria777TRF029
Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)R& D Systems4144-TC-01M
Transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGFβ 1)Peprotech100-21
DMEM / F12 z L-glutaminą i 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
InsulinaSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640 z L-GlutaminąLife Technologies11875-093
Suplement B-27 Minus InsulinLife TechnologiesA1895601
Suplement B-27 (z insuliną)Life Technologies17504-044
Surowica bydlęca płoduLife Technologies10437
odczynniki do cytometrii przepływowej silnymfosforanem
(10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Zrównoważony roztwór soli Hanka bez Ca2+ i Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Bufor do trwałej ondulacji Phosflow IIIBD Biosciences558050
16% ParaformaldehydThermo Scientific28906
MetanolSigma Aldrich179957-4L
AcetonMallenckrodt Chemicals 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Serum kozieLife Technologies16210-064
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Life Technologies15250-061
Materiały
5 ml Rurka z polistyrenu o okrągłym dnie (bez nakrętki)Corning352008Do przygotowania Komory do cytometrii przepływowej
5 ml Rurka z polistyrenu okrągłodennego (z 35 & mikro; M zatrzaskowa nasadka sitkowa komórek)Corning352235Do przygotowania komórek do cytometrii przepływowej
2 ml gumowy gruszkiFischer Scientific03-448-24
9-calowe borokrzemianowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowegoBioExpressP-2904-2
0,65 ml Probówki do mikrowirówek, z podziałką, zieloneGeneMateC-3259-G
1,5 ml Probówki do mikrowirówek, z podziałką, czerwonyGeneMateC-3260-R
TC20 automatyczny licznik komórekBioRad145-0102
Szkiełka zliczające do TC20BioRad145-0011
6-dołkowa płytka z płaskim dnem poddawana działaniu kultur tkankowychCorning353046
20 ml StrzykawkiBD Plastipak300613Do filtracji sterylizacji podwielokrotności
Sterylne filtry strzykawkowe, 0,2 i mikro; m polieterosulfonVWR28145-501Do sterylizacji filtrów podwielokrotności
250 ml System filtracyjny, 0,22 &mikro; m polieterosulfon, sterylizujący, o niskim stopniu wiązaniaCorning431096Do sterylizacji filtracyjnej mediów masowych 
System filtracyjny 500 ml, 0,22 &mikro; m polieterosulfon, sterylizujący, słabo wiążącyCorning431097Do sterylizacji filtracyjnej mediów
Przeciwciała i kontrole izotypów
Anti-TNNI3 (klon: 284 (19C7))Abcamab19615Przeciwciało pierwszorzędowe
anty-TNNT2 (klon: 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Przeciwciało pierwszorzędowe
Anti-MYL2 (MLC2v, klon: 330G5)Systemy synaptyczne310111Przeciwciało pierwszorzędowe
anty-MYL7 (MLC2a, klon: 4E7)AbcamAB131661Przeciwciało pierwszorzędowe
anty-IRX4   BiossBS-9464RPrzeciwciało pierwszorzędowe
Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie IgG1 Life TechnologiesA21121Przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 647 Koza anty-mysie IgG2aLife TechnologiesA21241Przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 488 Kozioł anty-mysie IgG2bLife TechnologiesA21141Przeciwciało drugorzędowe
Fikoerytryna(PE) Kozia anty-królicza IgGR& D SystemsF0110Przeciwciało wtórne
Mysz IgG1BD Biosciences557273Mysz kontrolująca izotyp
IgG2aeBiosciences16-4724-81Kontrola izotypu
IgG-PE królikaR& D SystemsIC105PIsotype Control
TaqMan Zestawy sond do qRT-PCR
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Life TechnologiesHs00158126
MESP1Life TechnologiesHs01001283
MYH11 (SMMHC)Life TechnologiesHs00224610
MYH6Life TechnologiesHs01101425
MYL2 (MLC2v)Life TechnologiesHs00166405
MYL7 (MLC2a)Life TechnologiesHS01085598
MYOGLife TechnologiesHs01072232
NKX2.5Life TechnologiesHs00231763
NPPALife TechnologiesHs01081097
POU5F1Life TechnologiesHS04260367
SOX17Life TechnologiesHS00751752
TNNI1Life TechnologiesHS00913333
TNNI2Life TechnologiesHS00268536
TNNI3Life TechnologiesHS00165957
TNNT2Life TechnologiesHS00165960
masowych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293(2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657(2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979(2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784(2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474(2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037(2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cardiomyocyte DifferentiationPluripotent Stem CellsFlow CytometryCardiac Troponin IIRX4 MarkerMLC2v MarkerMLC2a MarkerTNNT2 MarkerStem Cell CultureAntibody Staining

Powiązane artykuły