Method Article

Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

DOI:

10.3791/52014

⸱

November 22nd, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S-adenozylo-l-metionina (AdoMet) zależne od metylotransferazy (MTazy) katalizują transfer aktywowanej grupy metylowej z AdoMet do określonych pozycji w DNA, RNA, białkach i małych biomolekułach. Ta naturalna reakcja metylacji może być rozszerzona na szeroką gamę reakcji alkilacji przy użyciu syntetycznych analogów kofaktorów. Zastąpienie reaktywnego centrum sulfonowego AdoMet pierścieniem azyrydynowym prowadzi do kofaktorów, które mogą być sprzężone z DNA za pomocą różnych MTaz DNA. Te kofaktory azyrydyny mogą być wyposażone w grupy reporterowe w różnych pozycjach ugrupowania adeninowego i stosowane do specyficznego dla Ssekwencjonowania Metylotransferazy-I indukowanego L abelingu DNA (SMILing DNA). Jako typowy przykład podajemy protokół biotynylacji plazmidowego DNA pBR322 w sekwencji 5'-ATCGAT-3' z MTazą DNA M.BseCI i kofaktorem azyrydyny 6BAz w jednym kroku. Rozszerzenie aktywowanej grupy metylowej o nienasycone grupy alkilowe skutkuje powstaniem kolejnej klasy analogów AdoMet, które są stosowane do kierowanej przez metylotransferazę T frakcji G(mTAG). Ponieważ wydłużone łańcuchy boczne są aktywowane przez centrum sulfonu i wiązanie nienasycone, kofaktory te nazywane są podwójnie aktywowanymi analogami AdoMet. Analogi te funkcjonują nie tylko jako kofaktory dla MTaz DNA, takich jak kofaktory azyrydyny, ale także dla MTaz RNA, białek i małych cząsteczek. Są one zwykle używane do enzymatycznej modyfikacji substratów MTazy z unikalnymi grupami funkcyjnymi, które są znakowane grupami reporterowymi w drugim etapie chemicznym. Przykładem tego jest protokół znakowania fluorescencyjnego białka histonu H3. Mała grupa propargylowa jest przenoszona z analogu kofaktora SeAdoYn do białka przez histon H3 lizynę 4 (H3K4) MTazę Set7/9, a następnie znakowanie alkinylowanego histonu H3 azydkiem TAMRA. Znakowanie za pośrednictwem MTazy z analogami kofaktorów jest technologią umożliwiającą wiele ekscytujących zastosowań, w tym identyfikację i badanie funkcjonalne substratów MTazy, a także genotypowanie DNA i wykrywanie metylacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne znakowanie kwasów nukleinowych1,2 i białek3,4 jest bardzo interesujące dla charakterystyki funkcjonalnej, diagnostyki medycznej i (nano)biotechnologii. W tym miejscu przedstawiamy enzymatyczną metodę znakowania tych biopolimerów, która opiera się na metylotransferazach zależnych od S-adenozylo-l-metioniny (AdoMet lub SAM) (MTazy). Ta klasa enzymów (EC 2.1.1.) jest ukierunkowana na poszczególne pozycje nukleofilowe (atomy azotu, tlenu, siarki i węgla) w określonych resztach kwasów nukleinowych i białek i w naturalny sposób przenosi aktywowaną grupę metylową kofaktora AdoMet (rysunek 1A)5. Ponadto MTazy mogą wykorzystywać syntetyczne analogi kofaktorów do specyficznego etykietowania za pomocą znaczników powinowactwa, fluoroforów lub innych etykiet (rysunek 1B)6. Opracowano dwie klasy analogów AdoMet: kofaktory azyrydyny dla specyficznej dla Sswoistości Metylotransferazy-I indukowanej Labelingu (SMILing)7 oraz podwójnie aktywowane analogi AdoMet dla kierowanej przez metylotransferazy Transfery Aaktywowanych G(mTAG)8.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Reakcje katalizowane przez metylotransferazy (MTazy). ZA. Przenoszenie grup metylowych z naturalnego kofaktora AdoMet (SAM) do różnych substratów, w tym DNA, RNA, białek i małych biomolekuł. Ur. Znakowanie/funkcjonalizacja kwasów nukleinowych i białek (NNNNN = pary zasad dla DNA, nukleotydy dla RNA i aminokwasy dla białek; XXXXX = sekwencja rozpoznawania MTazy z resztą docelową w kolorze zielonym) z analogami syntetycznych kofaktorów. Kofaktory azyrydyny zawierające grupę reporterową (niebieską kulę) przyłączoną do pierścienia adeninowego są sekwencyjnie sprzężone z resztą docelową (po lewej), a podwójnie aktywowane analogi AdoMet prowadzą do przeniesienia rozszerzonych łańcuchów alkilowych przenoszących reporter chemiczny Y (po prawej), który można znakować za pomocą bioortogonalnej reakcji kliknięcia w drugim kroku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kofaktory azyrydyny działają najlepiej z MTazami DNA. Zawierają trójczłonowy pierścień z atomem azotu9 (lub N-musztardą10,11) zamiast centrum sulfonium jako grupy reaktywnej. Protonacja tego atomu azotu aktywuje pierścień azyrydynowy do ataku nukleofilowego przez docelowy nukleotyd, co prowadzi do kowalencyjnego sprzężenia całego kofaktora z DNA. Przyłączając grupy reporterowe do pierścienia adeninowego, kofaktory azyrydyny można stosować w połączeniu z MTazami DNA do znakowania DNA w jednym kroku (Figura 1B, po lewej)7,12. Wykazano to szczegółowo dla biotynylacji DNA za pomocą 6BAz13-15 (kofaktor azyrydyny z biotyną przyłączoną do pozycji 6 pierścienia adeninowego) i specyficznej dla adeniny MTazy DNA z Bacillus stearothermophilus (M.BseCI)16 (Figura 2, patrz sekcja protokołu 2: Jednoetapowe znakowanie DNA za pomocą kofaktorów azyrydyny). Oprócz M.BseCI (sekwencja rozpoznająca 5'-ATCGAT-3'), MTazy DNA z Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCGA-3'), z Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5'-GCGC-3') i ze Spiroplasmy (M.SssI, 5'-CG-3') zostały z powodzeniem wykorzystane do biotynylacji DNA za pomocą 6BAz17. Ponadto kofaktory azyrydyny mogą być stosowane do jednoetapowego znakowania fluorescencyjnego DNA18,19.

figure-introduction-2
Rycina 2: Sekwencyjna jednoetapowa biotynylacja DNA za pomocą M.BseCI i 6BAz. MTaza DNA M.BseCI rozpoznaje dwuniciową sekwencję DNA 5'-ATCGAT-3' i naturalnie metyluje grupę aminową drugiej reszty adeninowej (zielonej) za pomocą AdoMet. W przypadku kofaktora azyrydyny 6BAz przebieg reakcji ulega zmianie, a M.BseCI prowadzi do specyficznej sekwencyjnie biotynylacji DNA poprzez sprzężenie całego kofaktora, w tym biotyny (niebieskiej) z docelową adeniną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podwójnie aktywowane analogi AdoMet zawierają rozszerzone nienasycone łańcuchy boczne zamiast grupy metylowej w środku sulfonium (Rysunek 1B, po prawej)20. Nienasycone wiązanie podwójne lub potrójne w pozycji β do centrum sulfonu elektronicznie kompensuje niekorzystne efekty steryczne w stanie przejściowym poprzez stabilizację koniugacyjną. Ponieważ zarówno centrum sulfonium, jak i wiązanie nienasycone aktywują łańcuch boczny do transferu enzymatycznego, kofaktory te nazwano podwójnie aktywowanymi analogami AdoMet. Zazwyczaj są one używane do przenoszenia łańcuchów bocznych z unikalnymi grupami chemicznymi (reporterami chemicznymi), takimi jak grupy aminowe, alkinowe i azydkowe, do chemoselektywnego znakowania w drugim etapie8,21. Ogólnie rzecz biorąc, podwójnie aktywowane analogi AdoMet mogą funkcjonować nie tylko jako kofaktory dla MTaz DNA8,20,21, ale także dla MTaz RNA22,23 i MTaz białkowych24-28, umożliwiając dodatkowe znakowanie RNA i białek. Jednak rozszerzone łańcuchy boczne są sterycznie bardziej wymagające niż grupa metylowa, a zwiększenie miejsc aktywnych MTazy przez inżynierię białkową jest często wymagane w celu uzyskania wydajnych szybkości transferu. Innym rozwiązaniem tego problemu jest użycie analogu AdoMet z małą grupą propargylową (trzy atomy węgla), w której końcowy alkin pełni dwie funkcje: 1. Stabilizacja stanu przejściowego podczas transferu enzymatycznego i 2. reaktywny uchwyt do śledzenia modyfikacji chemicznych za pomocą katalizowanej miedzią cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC) kliknij chemię. Okazało się, że powstały propargylowy analog AdoMet29 jest dość niestabilny w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych i ma tylko ograniczone zastosowanie. Tę wadę można naprawić, zastępując atom siarki selenem. Otrzymany kofaktor 5'-[(Se)[(3S)-3-amino-3-karboksypropylo]prop-2-ynylselenonio]-5'-deoksyadenozyna (SeAdoYn, ryc. 3) jest akceptowany przez MTazy DNA, RNA i białek typu dzikiego30-32, które w wielu przypadkach znoszą potrzebę inżynierii białkowej. Przykładem tego jest znakowanie białek fluorescencyjnych za pomocą histonu H3 lizyny 4 (H3K4) MTazy Set7/933 (Figura 3, patrz sekcja 3 protokołu: Dwuetapowe znakowanie białek za pomocą podwójnie aktywowanych kofaktorów).

figure-introduction-3
Rysunek 3: Dwuetapowe znakowanie fluorescencyjne histonu H3 za pomocą Set7/9, SeAdoYn i azydku TAMRA. Białko MTase Set7/9 naturalnie metyluje grupę aminową lizyny 4 w histonie H3 (H3K4, zielony) za pomocą AdoMet. Dzięki podwójnie aktywowanemu kofaktorowi SeAdoYn MTaza przenosi małą grupę propargylową (czerwoną) do reszty lizyny. Dołączone końcowe wiązanie potrójne jest następnie selektywnie modyfikowane w bioortogonalnej reakcji kliknięcia (cykloaddycja azydkowo-alkinowa katalizowana miedzią, CuAAC) z azydkowatym fluoroforem TAMRA (tetrametylorodamina, niebieska). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólne instrukcje

  1. Przechowywać kofaktor azyrydyny 6BAz (w DMSO) i białkowy MTazę Set7/9 w temperaturze -80 °C oraz wszystkie inne odczynniki, w tym podwójnie aktywowany kofaktor SeAdoYn i MTazę DNA M.BseCI (w 50% glicerolu) w temperaturze -20 °C.
  2. Określić stężenie 6BAz i SeAdoYn za pomocą spektroskopii UV/Vis przy użyciu współczynników ekstynkcji ε269nm (6BAz) = 16 000 cm-1 M-1 i ε260 nm (SeAdoYn) = 15 400 cm-1 M-1 w wodzie dejonizowanej. Oznaczyć stężenie MTaz za pomocą testu Bradforda lub, jeśli współczynnik ekstynkcji jest dostępny, poprzez bezpośrednią absorpcję przy 280 nm.
  3. Należy unikać tworzenia pęcherzyków poprzez intensywne pipetowanie lub wirowanie, aby zapobiec utracie aktywności enzymu. Zamiast tego należy mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  4. Dodając kofaktory azyrydyny z roztworów podstawowych w DMSO, upewnij się, że końcowe stężenie DMSO w teście jest mniejsze niż 5%. W buforze testowym należy zawsze umieszczać 10 mM jonów magnezu, aby zapobiec niespecyficznym reakcjom z DNA.
  5. Podczas dodawania podwójnie aktywowanych kofaktorów z kwaśnych roztworów podstawowych należy używać małych objętości (wysoce skoncentrowanych roztworów podstawowych), aby uniknąć zmian pH i upewnić się, że pH roztworu testowego nie zmienia się znacząco. Należy unikać tioli, np. β-merkaptoetanolu lub ditiotreitolu (DTT), w buforze testowym, ponieważ mogą one zakłócać reakcję kliknięcia poprzez kompleksowanie wymaganych jonów miedzi.

2. Jednoetapowe znakowanie DNA za pomocą kofaktorów azyrydyny

  1. Specyficzne dla sekwencji znakowanie indukowane metylotransferazą (SMILing) plazmidowego DNA za pomocą MTazy M.BseCI DNA i kofaktora azyrydyny 6BAz.
    1. Rozmrozić roztwór kofaktora w temperaturze 20 °C i przygotować mieszaniny reakcyjne na lodzie.
    2. Oprócz testu należy przeprowadzić kontrolę "kofaktora", aby uwidocznić wszelkie niespecyficzne modyfikacje, oraz kontrolę "enzymatyczną", aby upewnić się, że preparat MTazy jest wolny od naturalnego kofaktora AdoMet.
    3. Do testu zmieszać 2 μl 10-krotnego buforu modyfikującego (zawierającego 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 20 mM β-merkaptoenolu, pH 7,4), 2 μl pBR322 (0,5 μg/μl), 10 eq. M.BseCI na sekwencję rozpoznającą DNA (1 sekwencja rozpoznawcza w pBR322) i kofaktor azyrydyny 6BAz do końcowego stężenia 60 μM w całkowitej objętości 20 μl. Dodać kofaktor i DNA MTase last.
      UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny, i szkodliwy dla środowiska.
    4. Do kontroli "kofaktora" dodaj wodę dejonizowaną zamiast M.BseCI, a do kontroli "enzymatycznej" dodaj wodę dejonizowaną zamiast 6BAz.
    5. Wymieszaj roztwory, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    6. Inkubować probówki w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.
    7. Odwirować na krótko, aby zebrać cały płyn na dnie probówek.
  2. Test modyfikacji restrykcji w celu weryfikacji modyfikacji DNA.
    1. Przygotować roztwór, mieszając 10 μl 10x buforu R.TaqI (zawierającego 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, pH 8,0), 80 μl wody dejonizowanej i 3,3 μl endonukleazy restrykcyjnej (REazy) z Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U/μl). Pamiętaj, aby dodać REase w ostatnim kroku.
    2. Do każdej probówki z ppkt 2.1.7 dodać 2 μl 10x buforu R. TaqI i 28 μl roztworu z góry (2.2.1).
    3. Wymieszaj roztwory, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    4. Inkubować probówki w temperaturze 65 °C przez 30 minut.
    5. Odwirować na krótko, aby zebrać cały płyn na dnie probówek.
  3. Test przesunięcia elektromobilności (EMSA) ze streptawidyną w celu weryfikacji modyfikacji funkcjonalnej.
    1. Pobrać 25 μl z każdej probówki (2.2.5) i dodać 2,4 μl roztworu streptawidyny (1 mM w odniesieniu do monomeru streptawidyny w buforze streptawidyny zawierającym 100 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl, pH 7,5; 4 równoważniki całkowitej biotyny). Do pozostałych probówek dodać 2,4 μl buforu streptawidyny.
    2. Inkubować wszystkie probówki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Analiza za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. Do każdej probówki dodać 5 μl 6-krotnego buforu ładującego (0,25% błękitu bromofenolowego, 30% glicerolu).
    2. Delikatnie wymieszaj roztwory.
    3. Załaduj 10 μl każdej próbki do studzienek żelu agarozowego (1% agarozy w 0,5x buforze TBE zawierającym 1x GelRed z 10 000x roztworu podstawowego).
    4. Uruchom żel w buforze 0,5x TBE o napięciu 80 V przez ok. 1 godzinę.
    5. Wizualizacja prążków DNA na stole UV (312 nm) za pomocą kamery CCD wyposażonej w filtr (540 ± 50 nm).
      UWAGA: Światło UV jest szkodliwe dla oczu i skóry.

3. Dwuetapowe znakowanie białek za pomocą podwójnie aktywowanych kofaktorów

  1. Kierowany metylotransferazą transfer grup aktywowanych (mTAG) z Set7/9 i podwójnie aktywowanym kofaktorem SeAdoYn do znakowania histonu H3 lizyny 4 (etap modyfikacji).
    1. Rozmrozić składniki i przygotować mieszaniny reakcyjne na lodzie. UWAGA: Zawsze utrzymuj SeAdoYn w chłodzie, aby uniknąć degradacji.
    2. Oprócz testu należy przeprowadzić kontrolę "kofaktora", aby uwidocznić wszelkie niespecyficzne modyfikacje, oraz kontrolę "enzymatyczną", aby wykluczyć niespecyficzne reakcje sondy fluorescencyjnej.
    3. Przygotować roztwór testowy (20 μl) zawierający bufor modyfikujący (50 mM Tris-HCl, 5% glicerolu, pH 8,5), 10 μM histon H3, 10 μM Set7/9 i 600 μM SeAdoYn (mieszanina obu epimerów w selenie). W ostatnich krokach dodaj kofaktor, a następnie MTase.
    4. Do kontroli "kofaktora" należy przygotować roztwór testowy jak w ppkt 3.1.3 i dodać 60 mM AdoMet, aby konkurować z kofaktorem syntetycznym. Do kontroli "enzymatycznej" dodaj wodę dejonizowaną zamiast SeAdoYn.
    5. Wymieszaj roztwory, powoli pipetując w górę i w dół. Sprawdź pH, dodając 1 μl każdego roztworu do górnego pola paska pH (zakres pH 5 - 10).
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    7. W międzyczasie przygotuj 12% żel poliakryloamidowy SDS (żel do biegania: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w/v) APS, 0,04% (v/v) TEMED i 12% akrylamid/bisakryloamid 37,5:1; żel nasycający: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w/v) APS, 0,04% (v/v) TEMED i 5% akrylamid/bisakryloamid 37,5:1).
      UWAGA: Akrylamid/bisakryloamid jest toksyczny i niebezpieczny dla zdrowia. Podczas tej procedury należy nosić rękawiczki.
  2. Znakowanie chemiczne alkinylowanej lizyny 4 w histonie H3 poprzez katalizowaną miedzią cykloaddycję azydkowo-alkinową (CuAAC) (etap znakowania).
    1. Tuż przed zakończeniem reakcji modyfikacji należy przygotować 5-krotną mieszankę zawierającą 3 mM CuSO4, 3 mM tris(3-hydroksypropylo-triazolylometylo)aminę (THPTA), 250 mM askorbinian sodu i 6 mM azydek TAMRA o łącznej objętości 20 μl.
    2. Dodaj 5 μl świeżo przygotowanej mieszanki 5x click do każdej probówki, aby rozpocząć CuAAC i wygasić reakcję modyfikacji.
    3. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.
    4. Chroń wszystkie probówki folią aluminiową przed światłem, aby uniknąć fotowybielania fluoroforu.
    5. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 1 godzinę.
  3. Wytrącanie białek w celu usunięcia nadmiaru wolnego fluoroforu TAMRA.
    1. Aby uniknąć przyćmienia znakowanego fluorescencyjnie histonu H3 przez intensywną fluorescencję w żelu wolnego fluoroforu TAMRA, należy usunąć nadmiar fluoroforu przez wytrącanie białek (3.3.2 – 3.3.4)34.
    2. Do każdej probówki dodać 75 μl metanolu, 18,8 μl chloroformu i 50 μl wody dejonizowanej i krótko mieszać po każdym dodaniu. Wirować przy 16 000 x g przez 5 min. Usuń górną fazę, nie naruszając warstwy interfejsu, która zawiera białko.
    3. Dodaj 56,3 μl metanolu do pozostałej fazy w każdej probówce, wiruj i odwiruj przy 16 000 x g przez 5 minut, aby uzyskać granulki białka. Usunąć supernatant. Powtórz ten krok, aby umyć granulkę.
    4. Przykryj otwarte tuby niestrzępiącą się chusteczką i pozostaw do wyschnięcia na 15 – 30 minut.
  4. Analiza za pośrednictwem SDS PAGE.
    1. Rozpuścić wytrącone białka z 3.3.4 w 20 μl buforu ładującego SDS (50 mM Tris-HCl, 2,5% (w/v) SDS, 10% (v/v) glicerolu, 320 mM β-merkaptoetanolu i 0,05% (w/v) błękitu bromofenolowego, pH 6,8). Upewnij się, że pelety całkowicie się rozpuściły, przepłukując ścianki probówek pipetą.
    2. Próbki inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury 20 °C.
    3. Odwirować na krótko, aby zebrać cały płyn na dnie probówek.
    4. Załadować całą ilość każdej próbki do studzienek z żelu poliakryloamidowego SDS (3.1.7). Użyj 50 mM MOPS, 50 mM Tris-X (Tris-base), 5 mM EDTA, 0.1% (w/v) SDS jako bufor do elektroforezy.
    5. Uruchomić żel pod napięciem 120 V przez ok. 90 min.
    6. Wizualizacja fluorescencji w żelu na stole UV (312 nm) za pomocą kamery CCD wyposażonej w filtr (540 nm ± 50 nm).
      UWAGA: Światło UV jest szkodliwe dla oczu i skóry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoetapowe etykietowanie DNA za pomocą kofaktorów azyrydyny

Ta przykładowa reakcja jest przeprowadzana za pomocą MTazy DNA M.BseCI, która modyfikuje drugą resztę adeninową w dwuniciowej sekwencji 5'-ATCGAT-3' i ma jedno miejsce rozpoznawania na plazmidzie pBR322 (Rysunek 4A). Aby przetestować znakowanie plazmidu, pBR322 jest prowokowany endonukleazą restrykcyjną (REaza) R.TaqI (5'-TCGA-3'). R.TaqI posiada siedem lokalizacji na pBR322, z których jedn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoetapowe znakowanie DNA za pomocą MTaz DNA i kofaktorów azyrydyny (SMILing DNA) jest solidną metodą, ale niektóre aspekty powinny być brane pod uwagę podczas planowania eksperymentu.

Kofaktor azyrydyny: Stężenie 6BAz do znakowania DNA za pomocą M.BseCI wynosiło 60 μM. W przypadku stosowania innych MTaz DNA stężenie kofaktora powinno być zoptymalizowane, np. stężenia tak niskie jak 20 μM zostały zastosowane w przypadku MTazy DNA M.TaqI19. Niskie stężenia 6BAz ma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ujawniają następujące konkurencyjne interesy finansowe: E.W. jest wynalazcą powiązanych patentów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Kerstin Glensk za przygotowanie MTaz M.BseCI i Set7/9 oraz dziękują za dofinansowanie przez Inicjatywę Doskonałości Niemieckiego Rządu Federalnego i Krajowego oraz Uniwersytet RWTH w Akwizgranie. Autorzy z przyjemnością dostarczają 6BAz i SeAdoYn lub inne analogi kofaktoryzacji do wspólnych badań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6BAzZsyntetyzowany zgodnie z Weinhold et al., numer patentu US 8,129,106, opublikowany 6 marca 2012 r.
β-MerkaptoetanolServa28625
Kwas octowyFisher Scientific10304980
Roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1Serva10688
Ultraczysta agarozaInvitrogen16500100
Nadsiarczan amonu (APS)Serva13375
Bis-TrisGerbu1304
Kwas borowyGerbu1115
Błękit bromofenolowy Na sólServa15375
Siarczan miedzi(II)AldrichC1297
ChloroformFisher Scientific10020090
Coomassie Brilliant BlueServa17525
EDTA sól disodowaGerbu1034
EtanolMerck100983
GelRed (10 000x w wodzie)Biotium41003
Glicerol (99,5%)Gerbu2006
FastRuler Drabinka DNA Niskiego ZasięguThermo ScientificSM1103
Histone H3Plazmid ekspresyjny uzyskany od dr Philippa Voigta i prof. Danny'ego Reinberga; ekspresja i izolacja według T. J. Richmond i wsp., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
Plazmid ekspresji M.BseCIuzyskany od dr Michaela Kokkinidisa; ekspresja i izolacja według Kapetaniou i wsp., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
MetanolFisher Scientific10675112
Chlorek magnezu  sześciowodnyJ.T. Baker4003
MOPSGerbu1081
Chlorek soduGerbu1112
Pasek pH (Neutralit)Merck1,095,330,001
pBR322Thermo ScientificSD0041
R.TaqI (10 u/µ l)Thermo ScientificER0671
SeAdoYnZsyntetyzowany według Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9Plazmid ekspresji uzyskany od prof. Danny'ego Reinberga, ekspresja i izolacja według D. Reinberg i wsp., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
StreptawidynaGerbu3058
(+)-L-askorbinian soduSigma Life ScienceA7631
SDS GranulowanyGerbu1833
di-wodorofosforan soduMerck106,586
AzydekSyntetyzowany zgodnie z numerem referencyjnym 30: Willnow i wsp., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Bufor TaqI (10x)Thermo ScientificB28
N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Acros Organics42058
Tris-HClGerbu1028
Tris-X (zasada TRIS)Gerbu1018
Tris(3-hydroksypropylotriazolylo-metylo)amina (THPTA)Sigma-Aldrich762342
TAMRA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
  2. Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
  3. Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
  4. Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
  5. Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
  6. Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
  7. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
  8. Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
  9. Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
  10. Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
  11. Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
  12. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
  13. Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
  14. Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
  15. Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
  16. Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
  17. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. , 8,129,106 (2012).
  18. Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
  19. Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
  20. Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
  21. Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
  22. Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
  23. Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
  24. Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
  25. Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
  26. Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
  27. Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
  28. Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
  29. Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
  30. Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
  31. Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
  32. Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
  33. Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
  34. Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
  35. Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
  36. Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
  37. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
  38. Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
  39. Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190(2013).
  40. Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
  41. Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
  42. Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
  43. Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
  44. Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Methyltransferase LabelingSequence specific DNA LabelingProtein Fluorescence LabelingAziridine Cofactor AnaloguesDouble activated AdoMet AnaloguesM BseCI DNA MethyltransferaseSet7 9 Histone MethyltransferaseSMILing DNA TechniquemTAG Enzymatic TransferClick Chemistry Labeling

Related Articles