Izolowanie i wykorzystanie odcinków tętnicy i żyły krezkowej bydła jako testu biologicznego do badania wazoaktywności w jelicie cienkim

Podsumowanie

Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą wpływać na przepływ krwi i negatywnie wpływać na wchłanianie składników odżywczych. Za pomocą multimiografu i izolatów tętnic i żył krezkowych można badać pod kątem wazoaktywności związki lub toksyny.

Streszczenie

Układ pokarmowy ssaków jest stale narażony na związki (pożądane i niepożądane), które mogą mieć wpływ na przepływ krwi do i z tego układu. Zmiany w przepływie krwi do jelita cienkiego mogą mieć wpływ na funkcje absorpcyjne narządu. Szczególne zainteresowanie toksynami uwalnianymi z pasz w procesach fermentacyjnych i trawiennych rozwinęło się u przeżuwaczy jako obszaru, w którym można poprawić wydajność produkcyjną. Film związany z tym artykułem opisuje test biologiczny in vitro opracowany do badań przesiewowych związków pod kątem wazoaktywności w izolowanych przekrojach tętnicy krezkowej i żyły bydlęcej przy użyciu multimiografu. Po zamontowaniu naczyń krwionośnych i zrównoważeniu ich w miografie, sam test biologiczny może być wykorzystany: jako narzędzie przesiewowe do oceny odpowiedzi skurczowej lub wazoaktywności związków będących przedmiotem zainteresowania; określić obecność typów receptorów poprzez farmakologiczne ukierunkowanie na receptory o określonych agonistach; określić rolę receptora z obecnością jednego lub więcej antagonistów; lub określić potencjalne interakcje związków będących przedmiotem zainteresowania z antagonistami. Dzięki temu dane są zbierane w czasie rzeczywistym, tkanka pobrana od pojedynczego zwierzęcia może być wystawiona na dużą liczbę różnych zabiegów eksperymentalnych (zaleta in vitro) i reprezentuje unaczynienie po obu stronach łożyska naczyń włosowatych, aby zapewnić dokładny obraz tego, co może się dziać w dopływie krwi aferentnej i odprowadzającej podtrzymującej jelito cienkie.

Wprowadzenie

Zmiany w przepływie krwi do łożyska tkankowego mogą mieć duży wpływ na funkcjonowanie narządów. Podstawową funkcją jelita cienkiego jest wchłanianie składników odżywczych. Przepływ krwi tętniczej do chłonnej powierzchni jelita jest wymagany do wchłaniania składników odżywczych, a przepływ krwi zwiększa się, aby wspomóc wchłanianie składników odżywczych, gdy trawienie przemieszcza się po powierzchni¹. Zmniejszenie przepływu krwi może powodować zmniejszenie wchłaniania składników odżywczych z powodu zmniejszenia gradientu przeznabłonkowego². Oprócz składników odżywczych jelito cienkie może być również narażone na metabolity wtórne, leki lub toksyny, które wywierają wpływ na zlokalizowany przepływ krwi w krezce. W przypadku przeżuwaczy związki mogą być uwalniane z paszy (np. składniki odżywcze, takie jak aminokwasy, lub toksyny, takie jak alkaloidy sporyszu) w wyniku procesów fermentacyjnych w jelicie przednim. Jeśli związki te przetrwają metabolizm mikrobiologiczny podczas fermentacji w żwaczu, są teraz dostępne do wchłaniania lub interakcji podczas przemieszczania się przez przewód pokarmowy zwierzęcia.

Istnieje wiele różnych metod pomiaru przepływu krwi in vivo (np. ultrasonografia dopplerowska, przepływomierze krwi na stałe, radioznakowane mikrosfery i techniki rozcieńczania wskaźników), które pozwalają na ocenę różnych scenariuszy eksperymentalnych lub zabiegów. Jednakże, aby uzyskać informacje dotyczące mechanicznych lub farmakologicznych właściwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych, metody pozostały ograniczone do dużych naczyń do czasu, gdy Mulvany i Halpern³ opublikowali artykuł opisujący technikę wykorzystującą preparaty pierścieni naczyniowych montowanych drutem w miografie. Od czasu opracowania tej techniki nadal wprowadzane są modyfikacje powiązanych systemów miografów, które pozwalają na wiele różnych zastosowań do oceny struktur rurowych. System został również przystosowany do wykorzystania stałych prętów do montażu większych naczyń⁴, w których techniki perfuzji nie są pożądane.

Z powodu różnic w naczyniach o różnym pochodzeniu anatomicznym i różnic w tych samych naczyniach od różnych gatunków zwierząt, dane z naczynia i typu zwierzęcia nie mogą być łatwo ekstrapolowane na różne naczynia lub to samo naczynie w różnych typach zwierząt⁵. W związku z tym za każdym razem, gdy te aspekty ulegają zmianie, należy opracować i zwalidować oddzielne testy biologiczne. Ostatnio opracowano kilka testów biologicznych z wykorzystaniem tych technologii do stosowania w bydle, bocznej żyle odpiszczelowej oraz prawej tętnicy i żyle żwacza^6,7.

Ten test biologiczny został opracowany specjalnie do zbadania wpływu alkaloidów sporyszu na układ naczyniowy wspierający jelito cienkie. Doniesiono, że 50-60% podawanych alkaloidów pojawia się w trawieńcu, ale tylko 5% jest odzyskiwanych w kale⁸. Strickland i wsp.⁹ stwierdzono w przeglądzie alkaloidów sporyszu, że dostępne dane sugerują, że jelito cienkie może być najważniejszym miejscem wchłaniania ergopeptyny. Eckert i wsp.¹⁰ dokonało przeglądu biofarmaceutycznych aspektów alkaloidów sporyszu i stwierdziło, że po przekroczeniu bariery nabłonkowej alkaloidy sporyszu są transportowane albo przez układ limfatyczny do żyły podobojczykowej, albo przez żyłę krezkową i do krwi wrotnej. Rhodes i wsp.¹¹ zgłosiło zmniejszenie przepływu krwi do dwunastnicy i okrężnicy u wołów spożywających dietę o wysokiej zawartości endofitów (alkaloidów o wysokiej zawartości sporyszu). Korzystając z prawego testu biologicznego tętnicy żwacza i żyły, Foote i wsp.¹² wykazało, że alkaloidy sporyszu są wazoaktywne w unaczynieniu żwacza. Foote i wsp.¹³ wykazano następnie in vivo, że narażenie żwacza na alkaloidy sporyszu powoduje zmniejszenie przepływu krwi w nabłonku żwacza. To zmniejszenie przepływu krwi do chłonnej powierzchni żwacza spowodowało jednocześnie zmniejszenie strumienia składników odżywczych (lotnych kwasów tłuszczowych). Biorąc pod uwagę ilość alkaloidów sporyszu przechodzących do jelita cienkiego z jelita przedniego; Postawiono hipotezę, że podobny wpływ wystąpi na unaczynienie jelita cienkiego i wchłanianie składników odżywczych. Wymagało to opracowania bydlęcej tętnicy krezkowej proksymalnej jelita krętego i testu biologicznego żyły.

Protokół

Procedury użyte w tym badaniu nie wymagały zatwierdzenia przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky, ponieważ nie wykorzystano żadnych żywych zwierząt. Przed pobraniem jakiejkolwiek próbki użytej w niniejszym dokumencie, wszystkie zwierzęta zostały ogłuszone bełtem uwięzionym i wykrwawione. Zostało to przeprowadzone w kontrolowanej przez rząd federalny rzeźni na Uniwersytecie Kentucky. Oficjalny przedstawiciel Służby Bezpieczeństwa i Kontroli Żywności USDA obserwował wszystkie czynności, które dotyczyły żywego zwierzęcia i obchodzenia się z tuszą.

1. Przygotowanie oprzyrządowania

1. Aby zminimalizować czas między pobraniem próbek tkanek do rozpoczęcia eksperymentu, należy ustawić sprzęt i przygotować przed pobraniem tkanki doświadczalnej (lub, jeśli dostępny jest dodatkowy personel, zadania te mogą być wykonywane jednocześnie).
   UWAGA: Zapewnia to nie tylko największą ilość czasu, w którym tkanka pozostaje zdolna do przeprowadzania eksperymentów, ale niektóre eksperymenty mogą trwać przez długi czas (lub istnieje chęć wykonania wielu eksperymentów w ciągu dnia), dlatego zwykle pożądane jest rozpoczęcie tak wcześnie, jak to możliwe.
2. Włącz powiązany komputer, sprzęt do akwizycji danych, łaźnię wodną (dla)) i jednostkę (jednostki) miografu. Umieść sprzęt kalibracyjny na jednostce (jednostkach) miografu (jednostkach) i włącz ogrzewanie miografu (ustawione na 37.5 °C) i pozwól jednostkom i sprzętowi kalibracyjnemu nagrzać się do zadanych temperatur.
   1. Otwórz wcześniej utworzony plik ustawień oprogramowania Wykres na komputerze i rozpocznij przebieg (ale nie pobieraj danych).
3. Rozgrzej sprzęt przez 10 min.
   1. Zacznij zbierać dane.
   2. Wyzeruj wszystkie kanały.
   3. Sprawdź i przeprowadź kalibrację (jeśli to konieczne) na każdym kanale (4 kanały na multimiograf), aby ustandaryzować sygnał elektryczny dostarczany z odpowiedniego przetwornika siły powiązanego z tym kanałem na siłę 2 g dostarczaną przez certyfikowany wzorzec masy.
   4. Po zakończeniu kalibracji i konwersji jednostek zapisz wszystkie kolejne dane w gramach. Zmieniaj odpowiednio w oparciu o pragnienia każdego oddzielnego laboratorium; sprzęt i oprogramowanie pozwalają na korzystanie z innych jednostek, takich jak miliniutony i wolty.
4. Upewnij się, że przewody gazowe są wolne od zatorów i włącz dopływ gazu (95% O₂/5% CO₂) do jednostek miograficznych. Przez cały czas trwania zabiegu należy w sposób ciągły gazować wszystkie (w komorach miografu).
5. Napełnij wszystkie komory miografu 70% etanolem i moczyć przez 10 minut, usunąć etanol i powtórzyć przez drugie 10 minut namaczania.
   1. Po usunięciu etanolu przepłukać trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie trzykrotnie przepłukać przygotowanym buforem (patrz sekcja 2 w celu przygotowania buforu), pozostawiając trzeci dodatek buforu w komorach.
      UWAGA: W tym momencie sprzęt może pozostać bezczynny w tym stanie, dopóki bufor i tkanka nie zostaną przygotowane, a personel nie będzie gotowy do kontynuowania eksperymentu.

2. Przygotowanie

1. Przygotować 1 l roztwór buforowy Krebsa-Henseleita do stosowania w transporcie i przetwarzaniu próbek tkanek w celu uzyskania końcowych stężeń 11,1 mM D-glukozy; 1,2 mM_MgSO4; 1,2 mM KH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3,4 mM CaCl₂; 24,9 mM NaHCO₃.
   1. Wymieszaj 9,6 g soli Krebsa z około 900 ml wody dejonizowanej na talerzu do mieszania.
   2. Wymieszać 0,373 g odwodnionego chlorku wapnia, a następnie 2,1 g wodorowęglanu sodu na litr pożądanego buforu.
   3. Bufor gazowy przez 20 min z 95% O₂/5% CO_{2 .}
   4. Po zagazowaniu należy dostosować pH do 7,05 (filtracja buforu zwiększa pH; końcowe docelowe pH powinno wynosić 7,4) i dostosować objętość do 1 l.
   5. Przefiltrować, wysterylizować bufor do czystej, autoklawowanej butelki o pojemności 1 l i przechowywać bufor w temperaturze 4 °C do momentu użycia gotowego do użycia.
2. Przygotować oddzielny roztwór buforu Krebsa-Henseleita do użycia w doświadczeniach miograficznych, jak opisano w kroku 2.1 dla transportu buforu Krebsa-Henseleita z dodatkowymi związkami, które odnoszą się do eksperymentów kurczliwości.
   UWAGA: Zazwyczaj 2 litry wystarczają do eksperymentów opisanych w tym artykule, ale ta objętość może wymagać zwiększenia lub zmniejszenia w zależności od długości eksperymentu, liczby komór miografu i liczby wymian (w stosunku do dodatków do leczenia).
   1. Przed etapem gazowania (etap 2.1.3) dodać 9,1 mg (na litr przygotowywanego buforu) dezypraminy-HCl do buforu.
   2. Przygotować 1,0 μM roztwór chlorowodorku propranololu i dodać 1 ml (na litr przygotowywanego buforu) tego roztworu do roztworu buforowego Krebsa-Henseleita. Sporządzić ten bufor w dniu użycia i przechowywać w temperaturach roboczych miografu (temperatura, która daje temperaturę 37,5 °C w miografie).
      UWAGA: Dezypramina jest dodawana w celu zahamowania mechanizmów wychwytu zwrotnego amin biogennych i umożliwienia szybszego usuwania eksperymentalnych dodatków z buforu kąpiącego naczynia krwionośne. Dodatek propranololu zapobiega niespecyficznemu wiązaniu związków leczniczych z receptorami β-adrenergicznymi.

3. Pobieranie i przygotowanie naczyń krwionośnych

1. Tak szybko, jak to możliwe, usuń przewód pokarmowy z tuszy. Gdy zwierzę nie będzie już wykazywać żadnych mimowolnych odruchów, zdejmij głowę i schowaj się, a następnie podnieś tuszę pionowo. Usunięcie wnętrzności żołądkowo-jelitowych (od przełyku do odbytu) z tuszy powinno zostać zakończone przez zatwierdzony personel rzeźni (<20 minut od momentu ogłuszenia).
   UWAGA: Czas oczekiwania jest zazwyczaj ograniczony lokalizacją/placówką, z której pobierany jest przewód pokarmowy, oraz standardowymi procedurami operacyjnymi lub procedurami federalnymi przestrzeganymi przez personel placówki.
   1. W większości placówek należy przeprowadzać manipulacje przewodu pokarmowego w innym miejscu niż przetwarzanie tuszy, która ma dostać się do żywności. Skorzystaj z pobliskiego dogodnego miejsca, w którym można pobrać przewód pokarmowy i rozłożyć go do badania.
2. Po rozłożeniu przewodu pokarmowego zidentyfikuj jelito cienkie, fałd krętniczo-kątniczy łączący jelito cienkie z jelitem ślepym oraz kołnierz jelita krętego rozciągający się proksymalnie do fałdu krętniczo-kątniczego (ryc. 1A).
   1. Za pomocą skalpela lub noża bardzo delikatnie wykonaj nacięcie w błonie krezkowej pośrodku kołnierza jelita krętego. Za pomocą dwóch palców wskazujących tępo wypreparuj tłuszcz i tkankę łączną, odsłaniając unaczynienie krezki (ryc. 1B).
3. Z tego kołnierza lub wybrzuszenia w krezce jelitowej wypreparuj wiele gałęzi (~ 2 cm długości) odsłoniętej tętnicy krezkowej i wiązek żył, które podtrzymują tę część jelita krętego (ryc. 1C).
   1. Jeśli używasz kleszczy do chwytania tkanki, uważaj, aby nie chwytać bezpośrednio ani w ogóle nie ciągnąć za naczynia krwionośne podczas ich usuwania, ponieważ każdy rodzaj rozciągania może uszkodzić i negatywnie wpłynąć na wydajność tkanek¹⁴. Usunięcie naczynia krwionośnego najlepiej wykonać, przecinając każdy koniec usuwanej sekcji, a następnie przecinając wzdłuż lub równolegle do teraz izolowanej sekcji. Dla ułatwienia usuń część otaczającej tkanki wraz z naczyniami, aby zapewnić trochę tkanki do uchwycenia za pomocą kleszczy.
   2. Za pomocą kleszczy zanurz próbkę tkanki w probówce zawierającej lodowaty bufor Krebsa-Henseleita i przechowuj na lodzie do czasu, aż przetwarzanie będzie mogło nastąpić w laboratorium.
4. Umieścić próbkę tkanki na powierzchni cięcia lub na szalce Petriego i częściowo zanurzyć w lodowatym Krebsie-Henseleicie.
   1. Za pomocą kleszczyków jubilerskich #5, nożyczek do tęczówki Noyes i lampy powiększającej lub lunety preparacyjnej (wystarczy powiększenie od 2,5 do 5,0x), ostrożnie wypreparuj otaczający tłuszcz i tkankę łączną oraz oddziel tętnicę i żyłę. Zidentyfikuj otwór naczynia na jednym końcu sekcji i ostrożnie chwyć kleszczami powięź otaczającą naczynie.
   2. Wykonaj cięcie nożyczkami równolegle do naczynia, wsuwając końcówkę nożyczek pod podniesioną powięź. Po początkowym nacięciu tłuszcz i tkankę łączną można dalej odłączyć od naczynia, przecinając obie strony nożyczkami. Upewnij się, że naczynia są tak czyste, jak to możliwe, jednocześnie minimalizując czas, jaki naczynia spędzają na stole.
   3. Umieścić naczynia krwionośne z powrotem w probówkach ze świeżym buforem Krebs-Henseleit i przechowywać w temperaturze 4 °C (próbki mogą być przechowywane do 24 godzin po pobraniu i nadal dawać ważne dane dotyczące kurczliwości).
   4. Za pomocą żyletki pokrój naczynie, które ma być użyte w miografie, na żądaną liczbę odcinków 2 mm (pomocne jest użycie krajalnicy do tkanek, aby uzyskać spójne przekroje).
   5. Zbadaj każdą sekcję pod lunetą preparacyjną (powiększenie 12.5x), aby upewnić się, że każda sekcja nie ma żadnych nieprawidłowości, rozgałęzień, zaworów ani powierzchownych uszkodzeń przypadkowo wykonanych podczas sekcji i czyszczenia. Wymień sekcję naczynia, jeśli występują jakiekolwiek nieprawidłowości, odgałęzienie, zawór lub powierzchowne uszkodzenia.
5. Dopuszczalne pokrojone w plastry kawałki naczynia (zanurzone w buforze Krebs-Henseleit) na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu, aż będą gotowe do zamontowania w komorach miografu (zwykle <30 min).
6. Delikatnie zamontuj naczynie na miografie, wkładając podpory przez światło i zwiększ napięcie (za pomocą mikropozycjonera na miografie), uważając, aby nie rozciągnąć naczyń powyżej odczytu 2 do 3 g.
7. Gdy wszystkie komory zostaną przykryte, odkurz bufor ze wszystkich komór i napełnij 5,0 ml buforu i uruchom 15-minutowy timer, aby rozpocząć okres równowagi i eksperyment.

4. Eksperyment

1. Równoważ wszystkie sekcje naczynia przez 1,5 godziny, aby uzyskać stabilne napięcie spoczynkowe 1,0 g.
   1. Bufor inkubacyjny Krebsa-Henseleita należy wymieniać co 15 minut.
   2. Podczas wyrównywania należy stale regulować napięcie na odcinkach naczyń krwionośnych do 2 g, a następnie pozwolić na rozluźnienie do około 0,80 g. Staraj się, aby naczynia krwionośne nie rozluźniały się zbytnio (mogą zsunąć się z mocowań). Staraj się osiągnąć stałe napięcie podstawowe, w którym naczynie utrzymuje napięcie 1 g bez konieczności regulacji.
2. Podczas równoważenia przygotować wodny roztwór 1,32 M KCl, który zostanie użyty jako punkt odniesienia.
3. Po osiągnięciu zadowalającej równowagi dodać 500 μl 1,32 M roztworu KCl, aby otrzymać 0,12 M roztwór w 5,5 ml roztworu kąpiącego naczynie.
   1. Po dodaniu 1,32 M KCl nie należy regulować napięcia ręcznie, ponieważ maksymalna odpowiedź z tego dodania jest wykorzystywana do oceny żywotności tkanek i może być wykorzystana do normalizacji danych dotyczących leczenia (np. odpowiedzi stężeniowych na agonistę).
   2. Wymieniaj bufor w odstępach 15-minutowych, aż napięcie powróci do wartości wyjściowej 1.0 g.
4. Po osiągnięciu linii bazowej zmień bufor i jednocześnie rozpocznij 1-minutowy timer. Zrób to dla wszystkich komór jednocześnie, aby uniknąć rozsunięcia w czasie rozpoczęcia.
   1. Odwiruj normę, która ma zostać dodana i przygotuj komentarz do komory 1 podczas 1-minutowego odliczania.
   2. Dodaj wzorce w podwielokrotnościach 25 μl do każdej komory, zgodnie z zaleceniami eksperymentu (utrzymuje to obróbkę poniżej 0,5% całkowitej objętości).
   3. Po dodaniu ostatniego standardu uruchom 9-minutowy timer.
   4. Pod koniec 9-minutowej standardowej inkubacji wyjąć z komór bufor zawierający produkt i dodać 5,0 ml świeżego buforu, a następnie uruchomić 2,5-minutowy stoper.
   5. Powtórz krok 4.4.4.
   6. Pod koniec drugiego 2,5-minutowego płukania odkurz komory i dodaj świeży bufor, a następnie uruchom 1-minutowy timer, aby odliczać początek drugiego standardowego dodawania.
5. Kontynuuj ten cykl dla wszystkich standardowych dodatków dnia.
6. Podczas końcowego dodawania wzorca i następującej po nim 9-minutowej inkubacji należy przygotować 1,32 M KCl związku odniesienia do dodania końcowej dawki referencyjnej 500 μl.
7. Po upływie 1 minuty po ostatnim dodaniu do zabiegu dodaj KCl i uruchom 9-minutowy timer.
   UWAGA: Dodatek KCl ma na celu potwierdzenie żywotności tkanek na zakończenie eksperymentu i jest pomocny w przypadku stosowania leczenia, które powoduje znikomą odpowiedź.
8. Po zakończeniu końcowej 9-minutowej inkubacji związku odniesienia należy odkurzyć lub usunąć bufor ze wszystkich komór. Nie dodawaj nowego bufora. Zakończ eksperyment.
9. Zapisz plik wykresu, usuń skrawki naczyń krwionośnych i zutylizuj w odpowiedni sposób, a następnie postępuj zgodnie z protokołem czyszczenia (dostarczonym przez producenta i może być specyficzny dla laboratorium) dla sprzętu miograficznego.

Wyniki

Naczynia krwionośne wykorzystane do uzyskania przedstawionych wyników pobrano od 6 jałowców rasy Holstein (425 ± 8 kg) w odstępie 3 tygodni. Przykład typowej odpowiedzi skurczowej żyły krezkowej na KCl oraz dodatki substancji badawczych o rosnącym stężeniu przedstawiono na Rysunku 2. Amplituda odpowiedzi będzie w pewnym stopniu różnić się w zależności od wielkości naczynia (skorelowana z wielkością zwierzęcia dawcy), ale może być również (negatywnie) wpływana przez niewłaściwą obsługę (rozciąganie) naczy...

Dyskusja

Początkowym wyzwaniem przy opracowywaniu tego testu biologicznego było ustanowienie powtarzalnego miejsca pobierania naczyń krezkowych. Spójność miejsca próbki ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre funkcje jelita cienkiego zmieniają się podczas progresji od jelita czczego przez jelito kręte, a w konsekwencji krezkę, zmienia się w podobny sposób. Gałęzie jelita krętego tętnicy krezkowej i żyły były najłatwiejsze do zidentyfikowania za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych. Lokalizując jelito ślepe i podążając za ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	Miograf ma kluczowe znaczenie dla tego testu biologicznego, ale istnieją inne platformy dostępne do użytku, które wystarczą.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Zestaw do kalibracji siły	Duńskie technologie Myo	100055	specyficzne dla miografów DMT
Filtr butelkowy	Nalgene	595-4520	0.22 μ m wielkość porów; 45 mm rozmiar szyjki
#5 Jewler' s Kleszcze	Miltex	555008FT	Można użyć kleszczyków dowolnej marki
Noyes Irys Nożyczki	Miltex	18-1510	Można użyć nożyczek dowolnej marki
Luneta preparcyjna	Zeiss	Stemi 2000-C	Wystarczy dowolna marka mikroskopu do preparowania światła
Regulowana matryca tkankowa	Braintree Scientific	TM C12	Nie ma to krytycznego znaczenia dla testu, ale znacznie zmniejsza różnice w długości między sekcjami i znacznie przyspiesza proces krojenia
Bufor Krebs-Hensleit	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	Nie trzeba kupować Krebsa, można go zrobić we własnym zakresie
Odwadnianie chlorku wapnia	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Dezypramina-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156