Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Summary

Po egzocytozie, zrośnięta błona plazmatyczna jest odzyskiwana w procesie znanym jako endocytoza. Mechanizm ten reformuje nowe pęcherzyki synaptyczne do następnej rundy uwalniania. Poszczególne zdarzenia endocytarne są wychwytywane i analizowane za pomocą zapisów pojemności przyłączonych do komórek w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy.

Abstract

Transmisja neuronalna jest integralną częścią komunikacji komórkowej w mózgu. Depolaryzacja błony presynaptycznej prowadzi do fuzji pęcherzyków znanej jako egzocytoza, która pośredniczy w transmisji synaptycznej. Późniejsze pobranie pęcherzyków synaptycznych jest konieczne do wytworzenia nowych pęcherzyków wypełnionych neuroprzekaźnikami w procesie identyfikowanym jako endocytoza. Podczas egzocytozy zespolenie błon pęcherzykowych spowoduje zwiększenie powierzchni, a późniejsza endocytoza spowoduje zmniejszenie powierzchni. Tutaj nasze laboratorium demonstruje podstawowe wprowadzenie do zapisów pojemności przyłączonej do komórek pojedynczych zdarzeń endocytarnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy. Ten rodzaj zapisu elektrycznego jest przydatny do zapisów egzocytozy i endocytozy w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczego pęcherzyka. Chociaż ta technika może wykryć zarówno egzocytozę pęcherzyków, jak i endocytozę, nasze laboratorium koncentruje się na endocytozie pęcherzykowej. Co więcej, technika ta pozwala nam analizować kinetykę pojedynczych zdarzeń endocytarnych. Opisano tu metody preparacji tkanki nadnerczy myszy, hodowlę komórek chromochłonnych, podstawowe techniki przyłączania komórek oraz kolejne przykłady indywidualnych śladów mierzących pojedyncze zdarzenie endocytarne.

Introduction

Transmisja synaptyczna odbywa się za pośrednictwem egzocytozy pęcherzyków synaptycznych zawierających neuroprzekaźniki, a pęcherzyki te muszą być poddawane miejscowemu recyklingowi endocytarnemu w obrębie zakończenia nerwowego, aby utrzymać komunikację neuronalną w dłuższej perspektywie. Biorąc pod uwagę zasadniczą rolę transmisji synaptycznej w mózgu, zrozumienie maszynerii molekularnej, która składa się na cykl pęcherzyków synaptycznych, jest niezbędną podstawą do lepszego zrozumienia komunikacji komórkowej jako całości. Wśród systemów modeli komórkowych komórka chromochłonna nadnerczy dostarczyła jednych z najbardziej ostatecznych informacji na temat maszynerii mol....

Protocol

UWAGA: Cała procedura została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Illinois w Chicago.

1. Roztwory i preparaty pożywek hodowlanych

1. Wszystkie roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Pożywkę hodowlaną należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
2. Przygotować 100 ml pożywki hodowlanej, mieszając 1 ml roztworu pen-strep i 1 ml ITSX (suplementacja insuliną-transferyną-selenem) ze 100 ml z DMEM.
3. Przygotować roztwór enzymatyczny, mieszając 2....

Results

Żywotność ogniwa i jakość gigaomowej uszczelki są kluczowe przy określaniu jakości nagrań pojemności dołączonej do ogniwa. Dlatego tak ważne jest, aby przed zapisami elektrofizjologicznymi uzyskać skuteczną i wydajną hodowlę komórkową, a typowe żywotne komórki przedstawiono na rysunku 1. Praktyka i czas będą pomocne w osiągnięciu gigaomowej uszczelki o wysokiej jakości. Jeśli można wyraźnie zobaczyć deformację komórek, gdy pipeta z plastrem zbliża się do celi, jak opisano w kroku 5.3 protokołu, istnieje .......

Discussion

Pomiary pojemności przyłączonej do komórki wymagają kilku krytycznych kroków, aby skutecznie uzyskać nagrania o wysokiej jakości: 1) żywotne i zdrowe komórki przygotowane z nadnerczy; 2) Powłoka PDL szkiełek nakrywkowych; 3) tworzenie uszczelnień gigaomowych; 4) poziom hałasu systemu; oraz 5) korekcja fazy.

W przypadku chirurgii zwierząt modyfikacje, które można potencjalnie wprowadzić, polegają na dostosowaniu podejścia chirurgicznego tak, aby jak najlepiej odpowiadało zręczności i zapobiegał.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Przechowywać z dala od UV
Dulbecco' s Zmodyfikowane szkło osłonowe Eagle Medium	Life Technologies
	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicylina Streptomycyna	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Rozmrażaj tylko na ICE!
Papaina	Worthington	39S11614
EPC-7 plus wzmacniacz krosowy	Płytka
BNC-2090	Oprogramowanie do
Igor	Ściągacz do pipet Wavemetrics
P-97	Sutter Instruments Microforge
	Instrumenty naukowe
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Sutter Instruments	B150-110-10	Średnica zewnętrzna: 1,5 mm Średnica wewnętrzna: 1,10 mm Długość: 10 cm