Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Podsumowanie

Po egzocytozie, zrośnięta błona plazmatyczna jest odzyskiwana w procesie znanym jako endocytoza. Mechanizm ten reformuje nowe pęcherzyki synaptyczne do następnej rundy uwalniania. Poszczególne zdarzenia endocytarne są wychwytywane i analizowane za pomocą zapisów pojemności przyłączonych do komórek w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy.

Streszczenie

Transmisja neuronalna jest integralną częścią komunikacji komórkowej w mózgu. Depolaryzacja błony presynaptycznej prowadzi do fuzji pęcherzyków znanej jako egzocytoza, która pośredniczy w transmisji synaptycznej. Późniejsze pobranie pęcherzyków synaptycznych jest konieczne do wytworzenia nowych pęcherzyków wypełnionych neuroprzekaźnikami w procesie identyfikowanym jako endocytoza. Podczas egzocytozy zespolenie błon pęcherzykowych spowoduje zwiększenie powierzchni, a późniejsza endocytoza spowoduje zmniejszenie powierzchni. Tutaj nasze laboratorium demonstruje podstawowe wprowadzenie do zapisów pojemności przyłączonej do komórek pojedynczych zdarzeń endocytarnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy. Ten rodzaj zapisu elektrycznego jest przydatny do zapisów egzocytozy i endocytozy w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczego pęcherzyka. Chociaż ta technika może wykryć zarówno egzocytozę pęcherzyków, jak i endocytozę, nasze laboratorium koncentruje się na endocytozie pęcherzykowej. Co więcej, technika ta pozwala nam analizować kinetykę pojedynczych zdarzeń endocytarnych. Opisano tu metody preparacji tkanki nadnerczy myszy, hodowlę komórek chromochłonnych, podstawowe techniki przyłączania komórek oraz kolejne przykłady indywidualnych śladów mierzących pojedyncze zdarzenie endocytarne.

Wprowadzenie

Transmisja synaptyczna odbywa się za pośrednictwem egzocytozy pęcherzyków synaptycznych zawierających neuroprzekaźniki, a pęcherzyki te muszą być poddawane miejscowemu recyklingowi endocytarnemu w obrębie zakończenia nerwowego, aby utrzymać komunikację neuronalną w dłuższej perspektywie. Biorąc pod uwagę zasadniczą rolę transmisji synaptycznej w mózgu, zrozumienie maszynerii molekularnej, która składa się na cykl pęcherzyków synaptycznych, jest niezbędną podstawą do lepszego zrozumienia komunikacji komórkowej jako całości. Wśród systemów modeli komórkowych komórka chromochłonna nadnerczy dostarczyła jednych z najbardziej ostatecznych informacji na temat maszynerii molekularnej leżącej u podstaw recyklingu pęcherzyków synaptycznych. Egzocytoza, ostatni etap uwalniania neuroprzekaźników, została dogłębnie zbadana i zbadana za pomocą komórki chromochłonnej nadnerczy^1,2. W rzeczywistości większość graczy molekularnych, które koordynują tworzenie, kierowanie, dokowanie i fuzję granulek wydzielniczych, została zidentyfikowana dzięki zastosowaniu różnych technik w komórkach chromochłonnych¹. Ponadto, stwarzając możliwość umożliwienia jednopęcherzykowego rozwiązania maszynerii białkowej zaangażowanej w egzocytozę, komórka chromochłonna pozostaje potężnym modelem umożliwiającym rozwiązanie problemów fuzji pęcherzyków³.

Pomiary pojemności przyłączonej do komórek zostały po raz pierwszy wykorzystane do rozwiązania fuzji pojedynczych pęcherzyków podczas egzocytozy³. Wykazano, że egzocytoza pęcherzyków o średnicy zaledwie ~60 nm jest wykrywana za pomocą pomiarów admitancji błony komórkowej techniką patch clamp w konfiguracji przyłączonej do komórki^4-7. Admitancja jest definiowana jako miara tego, jak łatwo obwód lub urządzenie pozwoli na przepływ prądu; Jest to odwrotność impedancji. W ten sposób pomiary admitancji pozwalają zrozumieć pojemność membrany. Osiąga się to poprzez włączenie błony pęcherzykowej do błony plazmatycznej; To włączenie ujawnia zmiany w powierzchni⁸. Każdy pęcherzyk perpulujący powoduje stopniowy wzrost pojemności membrany^9,10. Dodatkowo ten pomiar admitancji zapewnia przewodność błony i przewodnictwo porów fuzji podczas zdarzenia egzocytotycznego³. Ponieważ technika ta zapewniła unikalne narzędzie do identyfikacji kinetyki pojedynczych pęcherzyków podczas egzocytozy, nasze laboratorium niedawno zastosowało tę koncepcję do wykrywania endocytozy pojedynczych pęcherzyków^11,12.

Naszym szczególnym zainteresowaniem jest endocytoza za pośrednictwem klatryny (CME), która została uznana za podstawowy składnik utrzymania czystości w wielu komórkach¹³ i jako główny szlak endocytozy pęcherzyków synaptycznych w zakończeniach neuronalnych^14,15. Wiadomo, że CME jest ważny biologicznie, jednak jego kinetyka nie jest dobrze poznana ze względu na ograniczenia techniczne w monitorowaniu pojedynczych zdarzeń endocytarnych. Biorąc pod uwagę podobieństwa w mechanizmach egzocytarnych między komórkami chromochłonnymi a neuronami¹, prawdopodobne jest, że mechanizmy rozszczepienia w komórkach chromochłonnych mogą prawdopodobnie dotyczyć endocytozy pęcherzyków synaptycznych w neuronach. Pomiary pojemności przyłączonej do komórki zostały wykorzystane do monitorowania poszczególnych zdarzeń endocytarnych i analizy kinetyki rozszczepienia, których większość metod nie jest w stanie rozwiązać. W naszych nagraniach z ogniwami fala sinusoidalna o częstotliwości 20 kHz jest nakładana na potencjał podtrzymujący, a prąd wyjściowy jest rozdzielany na przewodność membranową w jednym kanale i pojemność membrany w drugim kanale z dwufazowego wzmacniacza lock-in^16-18. Na podstawie zmian przewodnictwa i pojemności błony można obliczyć kinetykę porów rozszczepienia, które prawdopodobnie odpowiadają szyjce błony rurkowej, która łączy pęcherzyk internalizujący z błoną plazmatyczną przed ściśnięciem pęcherzyka. Reasumując, technika ta daje nam możliwość zbadania mechanizmów regulacyjnych rozszczepienia pęcherzyków podczas CME.

Protokół

UWAGA: Cała procedura została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Illinois w Chicago.

1. Roztwory i preparaty pożywek hodowlanych

1. Wszystkie roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Pożywkę hodowlaną należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
2. Przygotować 100 ml pożywki hodowlanej, mieszając 1 ml roztworu pen-strep i 1 ml ITSX (suplementacja insuliną-transferyną-selenem) ze 100 ml z DMEM.
3. Przygotować roztwór enzymatyczny, mieszając 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM CaCl₂ i 2,5 ml 50 mM EDTA.
4. Przygotować roztwór inaktywacyjny, mieszając 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg albuminy i 625 mg inhibitora trypsyny.
5. Przygotuj roztwór Locke'a zawierający 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM glukozy. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH.
6. Przygotować roztwór poli-d-lizyny (PDL) o stężeniu 50 mg/ml. Do pokrycia szkiełek nakrywkowych użyć końcowego stężenia 1 mg/ml.
7. Przygotuj zewnątrzkomórkowy roztwór 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES-NaOH i 10 mM glukozy. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH o osmolarności ~310 nmol/kg.
8. Przygotować roztwór pipet o stężeniu 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH o osmolności ~290 nmol/kg.

2. Izolacja nadnerczy

1. Autoklawuj parę dużych i małych nożyczek preparacyjnych i dwie pary kleszczy. Podczas całego procesu noś rękawiczki i umieść tacę preparacyjną na wiaderku z lodem.
2. Użyj myszy pobranych w dniu 0-3. Eutanazja zwierząt za pomocą zbiornika CO₂ pod ciśnieniem, a następnie dekapitacja.
3. Użyj mniejszego zestawu nożyczek, aby przyciąć tył szczeniaka wzdłuż kręgosłupa od odcinka szyjnego do ogonowego. Pamiętaj, aby ciąć powierzchownie pod skórą i nie przebijać się w jamie ciała.
4. Następnie oderwij skórę od kręgosłupa, aby mięśnie były odsłonięte, aby mieć wyraźny widok na kręgosłup. Stąd wykonaj cięcie poprzeczne w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego, a następnie wykonaj dwa równoległe cięcia wzdłuż boków kręgosłupa.
5. Z jedną parą kleszczy trzymających główne ciało zwierzęcia, użyj drugiej pary kleszczy, aby chwycić kręgosłup i oderwać kręgosłup, aż nerki zostaną odsłonięte.
6. W tym momencie wyobraź sobie nadnercza na szczycie nerek. Następnie ostrożnie umieść dwa gruczoły każdego zwierzęcia w stożkowej probówce wypełnionej roztworem Locke'a.
   UWAGA: Czasami gruczoły przyklejają się do kleszczy. W takim przypadku delikatnie użyj innej pary kleszczy, aby pomóc w usunięciu gruczołów z kleszczy do roztworu Locke'a. Gruczoły mogą być utrzymywane w tym stanie do 2 godzin.

3. Trawienie tkankowe

1. W międzyczasie bąbelkować roztwór enzymu 5% CO₂ + 95% O₂ przez 15 minut przed użyciem. Upewnij się, że zrównoważony roztwór zmieni kolor z jasnoróżowego na różowawy/pomarańczowy.
2. Dodać papainę do świeżo bąbelkowanego roztworu enzymu o końcowym stężeniu 20-25 jednostek/ml. Inkubować każdą parę gruczołów od każdego zwierzęcia przez 40-60 minut w temperaturze 37 °C w roztworze enzymu z papainą.
3. Dodać 75% roztworu inaktywacyjnego do każdej probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 10 minut. Ta inkubacja dezaktywuje aktywność enzymatyczną papainy.
4. Po 10 minutowej inkubacji z roztworem inaktywacyjnym delikatnie przenieś gruczoły do nowo oznakowanej probówki, a następnie przemyj gruczoły 3x pożywką hodowlaną.

4. Dysocjacja komórek i posiewanie

1. Po umyciu umieść oba gruczoły w 200 μl pożywki hodowlanej, a następnie delikatnie miareczkuj gruczoły w górę i w dół przez końcówkę pipety za pomocą pipety pipetą o pojemności 200 μl, aż w roztworze nie będzie już dużego kawałka tkanki.
   UWAGA: Podczas miareczkowania utrzymuj gruczoły na dnie probówki z siłą skierowaną w dół od końcówki pipety o pojemności 200 μl i delikatnie i powoli dotykaj tkanki. Upewnij się, że używasz powolnych, ciągłych pociągnięć, nigdy nie pipetując szybko ani gwałtownie.
2. Dodać dodatkowe 250 μl pożywki hodowlanej, aby zwiększyć całkowitą objętość pożywki do 450 μl.
3. Umieścić 60 μl tego roztworu zawierającego komórki na każdym z siedmiu 12 mm wstępnie powlekanych szkiełek nakrywkowych PDL, które umieszcza się w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 mm.
4. Po platerowaniu należy umieścić naczynie w inkubatorze ustawionym na 37 °C i utrzymywanym przy stałym przepływie/dopływie 5% CO_{2 przez} 30 minut, aby zapewnić środowisko dla żywotności komórek. Po inkubacji delikatnie dodaj 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do szalki hodowlanej i włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 24 godziny przed zapisami z komórkami.
   UWAGA: Zazwyczaj ogniwa mogą być używane do zapisów elektrofizjologicznych przez okres do 4 dni.

5. Identyfikacja komórek i tworzenie pieczęci gigaomowej

1. Umieścić 12 mm szkiełko nakrywkowe w roztworze zewnątrzkomórkowym. Ponieważ całe nadnercza są wykorzystywane do przygotowania komórek, wymieszaj komórki chromochłonne (zwykle bardzo jasne z brązowawo-beżowym zabarwieniem i prawie idealną okrągłą formą (ryc. 1) w hodowli z komórkami korowymi (mniejszymi i ciemniejszymi niż komórki chromofilinowe).
2. Wyciągnij pipety z plastrami w czterech etapach za pomocą programowalnego ściągacza P-97. Zanurz końcówkę pipety w stopionym wosku, co pomoże zmniejszyć pojemność szkła, a następnie wypoleruj końcówkę, aby "zdmuchnąć" ten wosk z wnętrza końcówki pipety.
   UWAGA: Po napełnieniu roztworem do pipet krosowych, pipety krosowe mają zwykle rezystancję ~2 MΩ.
3. Zbliżyć pipetę z plastrem do komórki w odległości kilku mikronów. Aby uzyskać konfigurację z podłączoną komórką, należy zwrócić uwagę na jakiekolwiek niewielkie odkształcenia komórek podczas zbliżania pipety z plastrem do ogniwa. Zastosuj delikatne ssanie, aż do uzyskania uszczelnienia GΩ.

6. Zapisy pojemnościowe podłączone do komórek

1. Po ujawnieniu uszczelki GΩ należy dokonać nagrań podłączonych do ogniw za pomocą wzmacniacza patch-clamp EPC-7 plus i dwufazowego analogowego wzmacniacza typu lock-in (patrz załączona tabela wyposażenia). Zastosuj falę sinusoidalną o amplitudzie 50 mV (r.m.s.) i częstotliwości 20 kHz ze wzmacniacza lock-in.
2. Ustaw filtr wyjściowy wzmacniacza lock-in na stałą czasową 1 ms i 24 db. Ustaw fazę wzmacniacza typu lock-in w taki sposób, aby przejściowe zmiany pojemności wywołane delikatnymi impulsami ssania pojawiały się tylko w ścieżce pojemności łatki (Im) bez projekcji na ścieżkę przewodności łaty (Re) (ilustracja 2).
   UWAGA: Szczegółowe informacje na temat kalibracji systemu znajdują się w numerze referencyjnym 19.
3. Zidentyfikuj typowe zmiany pojemności za pomocą kroków "w dół" (Rysunek 3).
   UWAGA: Solidne nagranie będzie postrzegane jako podobieństwo typu "schody" z wieloma stopniami w dół, co wskazuje na internalizację pojedynczych pęcherzyków. Proces łatania służy jako stymulacja mechaniczna, ponieważ prąd czynnościowy może być zwykle rejestrowany z większości komórek.
4. Nazwij pliki jako osobne foldery, w tym datę: mm/dd/rok i każde nagranie dołączone do komórki jako osobną indywidualną numerację (xx) w tym pliku.

Wyniki

Żywotność ogniwa i jakość gigaomowej uszczelki są kluczowe przy określaniu jakości nagrań pojemności dołączonej do ogniwa. Dlatego tak ważne jest, aby przed zapisami elektrofizjologicznymi uzyskać skuteczną i wydajną hodowlę komórkową, a typowe żywotne komórki przedstawiono na rysunku 1. Praktyka i czas będą pomocne w osiągnięciu gigaomowej uszczelki o wysokiej jakości. Jeśli można wyraźnie zobaczyć deformację komórek, gdy pipeta z plastrem zbliża się do celi, jak opisano w kroku 5.3 protokołu, istnieje ...

Dyskusja

Pomiary pojemności przyłączonej do komórki wymagają kilku krytycznych kroków, aby skutecznie uzyskać nagrania o wysokiej jakości: 1) żywotne i zdrowe komórki przygotowane z nadnerczy; 2) Powłoka PDL szkiełek nakrywkowych; 3) tworzenie uszczelnień gigaomowych; 4) poziom hałasu systemu; oraz 5) korekcja fazy.

W przypadku chirurgii zwierząt modyfikacje, które można potencjalnie wprowadzić, polegają na dostosowaniu podejścia chirurgicznego tak, aby jak najlepiej odpowiadało zręczności i zapobiegał...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Przechowywać z dala od UV
Dulbecco' s Zmodyfikowane szkło osłonowe Eagle Medium	Life Technologies
	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicylina Streptomycyna	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Rozmrażaj tylko na ICE!
Papaina	Worthington	39S11614
EPC-7 plus wzmacniacz krosowy	Płytka
BNC-2090	Oprogramowanie do
Igor	Ściągacz do pipet Wavemetrics
P-97	Sutter Instruments Microforge
	Instrumenty naukowe
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Sutter Instruments	B150-110-10	Średnica zewnętrzna: 1,5 mm Średnica wewnętrzna: 1,10 mm Długość: 10 cm