Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Podsumowanie

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Streszczenie

Uważa się, że aktywacja mikrogleju, jak również wynaczynienie hematogennych makrofagów i neutrofili, odgrywają kluczową rolę w uszkodzeniach mózgu po udarze. Te subpopulacje komórek szpikowych mogą wykazywać różne fenotypy i funkcje i muszą być rozróżniane i charakteryzowane w celu zbadania ich regulacji i wkładu w uszkodzenie tkanek. Protokół ten zapewnia dwie różne metodologie charakterystyki komórek odpornościowych mózgu: precyzyjne podejście stereologiczne i analizę cytometrii przepływowej. Podejście stereologiczne opiera się na metodzie frakcjonowania optycznego, która oblicza całkowitą liczbę komórek w obszarze zainteresowania (mózg z zawałem) oszacowaną przez systematyczne losowe pobieranie próbek. Drugie podejście do charakterystyki zapewnia prosty sposób izolowania zawiesin leukocytów w mózgu i charakteryzowania ich za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala na scharakteryzowanie mikrogleju, naciekanych monocytów i neutrofili w tkance niedokrwionej. Ponadto szczegółowo opisano model niedokrwienia mózgu u myszy, który wpływa wyłącznie na korę mózgową, generując wysoce powtarzalne zawały o niskim wskaźniku śmiertelności, a także procedurę histologicznego przetwarzania mózgu w celu scharakteryzowania objętości zawału metodą Cavalieriego.

Wprowadzenie

Uważa się, że zmiany morfologiczne, fenotypowe i ekspresji genów mikrogleju, a także wynaczynienie i aktywacja hematogennych makrofagów i neutrofili odgrywają kluczową rolę w patofizjologicznej kaskadzie po urazie mózgu^1-4. Protokół ten zapewnia dwa podejścia do oszacowania liczby różnych podzbiorów komórek szpikowych w niedokrwionym mózgu i przeprowadzenia ich charakterystyki fenotypowej. Ponadto zawiera również opis eksperymentalnego modelu niedokrwienia mózgu u myszy, który składa się z przejściowego lub trwałego podwiązania zarówno dystalnej tętnicy środkowej mózgu (MCA), jak i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), w tym sposobu oceny zawału za pomocą dokładnej metody Cavalieriego przy użyciu oprogramowania stereologicznego.

Pierwszym podejściem do scharakteryzowania podzbiorów komórek szpikowych niedokrwionego mózgu jest metoda stereologiczna oparta na podejściu frakcjonowania optycznego⁵. Jest to najczęściej stosowana sonda stereologiczna w naukach przyrodniczych i zapewnia wysoki stopień precyzji przy niskich współczynnikach błędu^5-7. Jest to najlepszy wybór do oznaczania ilościowego komórek, gdy tkanka jest cięta na sekcje, ponieważ pozwala uniknąć stronniczości w szacowaniu komórek z powodu fragmentacji tkanki na sekcje. Metoda ta jest bardzo skutecznym sposobem charakteryzowania liczby, dynamiki i zmian fenotypowych naciekających subpopulacji neutrofili tkanki niedokrwiennej⁸.

Drugie podejście do charakterystyki opiera się na zmodyfikowanym protokole Campanelli i współpracowników⁹, który zapewnia prosty sposób na wyizolowanie zawiesin leukocytów w mózgu i scharakteryzowanie ich za pomocą cytometrii przepływowej. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik immunohistochemicznych, charakterystyka cytometrii przepływowej pozwala na różnicowanie mikrogleju (CD45^loCD11b⁺) i naciekanych komórek szpikowych (CD45^hiCD11b⁺) na podstawie ich różnych poziomów ekspresji CD45 ^9-13. Ponadto można wyróżnić monocyty prozapalne (CD45^hiCD11b⁺Ly-6G-Ly-6C ^hi), neutrofile (CD45^hiCD11b⁺Ly-6G⁺) i inne podzbiory leukocytów tkanki niedokrwiennej. Podejście to zapewnia wiarygodny i szybki test do oceny zapalenia nerwów w eksperymentalnych modelach niedokrwienia mózgu. Jednak przetwarzanie tkanek może wpływać na stan aktywacji i liczbę różnych populacji komórek znajdujących się w tkance niedokrwiennej, zapewniając półilościową charakterystykę.

Protokół

UWAGA: Wszystkie protokoły eksperymentalne były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Dobrostanu Zwierząt Universidad Complutense (zgodnie z dyrektywami UE 86/609/CEE i 2003/65/CE).

1. Model niedokrwienia mózgu

UWAGA: Model niedokrwienia mózgu w tym artykule zakłada trwałe lub przejściowe zamknięcie zarówno CCA (tętnica szyjna wspólna), jak i MCA (tętnica środkowa mózgu) poprzez podwiązanie szwem nylonowym.

1. Przygotowania przedoperacyjne
   1. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie lub za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi. Zdezynfekuj również obszar operacyjny 70% etanolem.
   2. Znieczulij mysz odpowiednimi środkami znieczulającymi. Osiągnij indukcję za pomocą izofluranu 2,5% i utrzymuj za pomocą izofluranu 1,5% w mieszaninie 80% powietrza / 20% tlenu za pomocą parownika. Nałóż sztuczne łzy na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
   3. Umieść mysz na poduszce grzewczej, która jest połączona z urządzeniem sprzężenia zwrotnego z sondą temperatury umieszczoną w odbytnicy i ustaw temperaturę na poziomie fizjologicznym (36.5 ± 0.5 ºC) podczas zabiegu chirurgicznego.
2. Niedrożność tętnicy szyjnej wspólnej przez podwiązanie
   1. Umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej i unieruchom taśmą. Zdezynfekuj skórę 70% etanolem lub jodkiem powidonu i obetnij włosy w górnej części brzusznej.
   2. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj 1 cm nacięcie w linii środkowej wokół brzusznej powierzchni szyi.
   3. Rozerwij wszystkie tkanki miękkie (tkankę gruczołową, w tym gruczoły podszczękowe, podjęzykowe i ślinianki przyuszne) i zidentyfikuj lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA), która jest zlokalizowana po stronie tchawicy. Cofnij mięśnie i odsłoń lewe CCA. Ostrożnie wypreparuj nerw błędny.
   4. Po wypreparowaniu należy zakryć lewe CCA za pomocą podwiązki za pomocą nylonowego szwu 6/0. Podwiązywać za pomocą węzła stałego lub węzła ślizgowego (aby umożliwić reperfuzję, jeśli pożądany jest model przejściowego niedokrwienia mózgu).
   5. Umieść tkankę gruczołową w jej pierwotnym położeniu i zamknij nacięcie na skórze szyi nylonowym szwem 6/0.
      UWAGA: Zwierzęta podejrzane są poddawane tej samej procedurze chirurgicznej, co zwierzęta MCAO, ale CCA nie jest okludowane.
3. Niedrożność dalszej tętnicy środkowej mózgu przez podwiązanie
   1. Ustaw mysz na prawym boku i unieruchom taśmą. Zdezynfekuj skórę głowy 70% etanolem lub jodkiem powidonu i obetnij włosy z głowy myszy (usuń włosy po obcięciu).
   2. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj nacięcie skóry między okiem a uchem. Odsuń skórę i przytrzymaj ją taśmą.
   3. Wykonaj poziome nacięcie na mięśniu skroniowym od prawej do lewej. Następnie wykonaj drugie pionowe nacięcie po prawej stronie mięśnia skroniowego (uważaj, aby nie przeciąć żyły skroniowej). Odsuń mięsień skroniowy od czaszki i przytrzymaj go szwem, aby utrzymać czystą powierzchnię czaszki.
   4. Oczyść powierzchnię czaszki zimnym sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby wykryć dokładne położenie lewej tętnicy środkowej mózgu (MCA) poprzez przezroczystość czaszki. Wykonaj okrągłą kraniotomię (o średnicy 1 mm) z zadziorem ze stali nierdzewnej w płacie czołowym między łukiem jarzmowym a kością łuskową. Ostrożnie usuń czaszkę i odsłoń MCA.
   5. Nałóż niewielką ilość zimnego, sterylnego roztworu soli fizjologicznej na powierzchnię mózgu i usuń opony mózgowe (oponę twardą i pajęczynówkę) za pomocą kleszczy.
   6. Wykonaj podwiązanie lewego MCA w dystalnym tułowiu tuż przed rozwidleniem między czołową i tylną gałęzią MCA. Zatkaj lewy MCA za pomocą ligatury za pomocą nylonowego szwu 9/0. Podwiązywać za pomocą węzła stałego lub węzła ślizgowego (aby umożliwić reperfuzję, jeśli pożądany jest model przejściowego niedokrwienia mózgu). Czas między okluzją CCA i MCA wynosi około 10-20 minut, w zależności od doświadczenia operatora.
   7. Umieść mięsień skroniowy w jego pierwotnej pozycji i zamknij nacięcie na skórze szyi nylonowym szwem 6/0.
   8. Umieść mysz z powrotem w klatce, aby doszła do siebie po znieczuleniu (zwykle 5-10 min) i wstrzyknij myszu buprenorfinę dootrzewnową (IP) (0,3 mg/kg).
      1. Monitoruj mysz przez kilka godzin, aby wykryć dyskomfort (nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek). Ponieważ na ogół obserwuje się utratę wagi po operacji, umieść rozgniecione jedzenie na szalce Petriego, aby ułatwić jedzenie.
   9. Gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje, wróć do towarzystwa innych zwierząt.
   10. Jeśli pożądany jest przejściowy model MCAO, ponownie znieczulij mysz i usuń węzeł ślizgowy z CCA i MCA, aby umożliwić reperfuzję (zwykle między 0,5-2 godzinami (ryc. 1)).
       UWAGA: Zwierzęta podejrzane są poddawane tej samej procedurze chirurgicznej, co zwierzęta MCAO, ale MCA nie jest okludowane.

2. Perfuzja i sekcja tkanki mózgowej

1. 24 lub 48 godzin po MCAO należy pośmiać mysz ze śmiertelną dawką środka znieczulającego (np. pentobarbitalem sodu, IP86 mg/kg lub przedawkowaniem izofluranu).
2. Przeprowadzić perfuzję myszy z buforem fosforanowym 0,1 M, a następnie 4% paraformaldehydem (PFA) w buforze fosforanowym (pH 7,4).
3. Usuń mózg w następujący sposób:
   1. Odetnij głowę zwierzęciu tuż nad rdzeniem kręgowym.
   2. Wykonaj tylno-przednie nacięcie na skórze głowy, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj dwa boczne nacięcia na styku ścian bocznych i podstawy czaszki i usuń mały kawałek kości.
   3. Wykonaj przecięcie przez czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego.
   4. Usuń czaszkę pokrywającą każdą półkulę za pomocą kleszczy, aby odsłonić mózg. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg od czaszki i przenieś go do 4% roztworu PFA.
4. Post-fix przez 3 godziny w 4% roztworze PFA w temperaturze 4 ºC.
5. Usuń roztwór PFA i inkubuj mózg przez 48 godzin w 30% roztworze sacharozy, aby krioprotektorować mózg.
6. Usuń roztwór sacharozy i szybko zamroź mózg w zimnym izopentanie (-40 ºC). Zamrożony mózg przechowywać w temperaturze –80 ºC.
7. Uzyskać koronalne skrawki mózgu (30 μm) za pomocą mikrotomu zamrażającego. Zbierz dziesięć zestawów seryjnych w roztworze kriokonserwantu. Każdy zestaw szeregowy składa się z około 14-16 wycinków koronalnych o odległości międzywarstwowej 300 μm, które odpowiednio próbkują mózg myszy między 1,94 a -2,46 za bregmą.

3. Barwienie Nissl i szacowanie objętości zawału

1. Barwienie Nissl przez fiolet krezylowy
   1. Zamontuj skrawki mózgu w szkiełku mikroskopowym superfrost. Do oznaczania objętości zawału metodą Cavalieriego w skrawkach barwionych Nisslem należy użyć frakcji do pobierania próbek w skali 1/20 (1/2 skrawków jednego z dziesięciu zestawów seryjnych zebranych w kroku 2.7; w przybliżeniu stosuje się łączną liczbę 7-8 odcinków o odległości międzywarstwowej 600 μm). Należy uważać, aby zachować prawidłową orientację przednio-tylną (obszar zawału znajduje się po prawej stronie).
   2. Wykonaj konwencjonalne barwienie Nissl w następujący sposób:
      1. Pozostaw sekcje montowane na suwaku do wyschnięcia na kilka godzin.
      2. Ponownie nawodnić sekcje montowane na szkiełku i zabarwić 0,1% roztworem fioletu krezylowego przez 5 minut.
      3. Odwodnić za pomocą stopniowanej serii EtOH (70%, 90% i 100%; 5 minut na zmianę). Oczyść sekcje montowane na suwaku ksylenem, dodaj materiał montażowy z plastyfikatorem ksylenowym (DPX) i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
2. Wykorzystanie oprogramowania stereologicznego do oszacowania objętości zawału metodą Cavalieriego w odcinkach szeregowych barwionych Nisslem
   1. Użyj parametrów pokazanych w Tabeli 1, aby określić ilościowo objętość zawału metodą Cavalieriego¹⁴ i systemu stereologicznego, który składa się z mikroskopu wyposażonego w kamerę, zmotoryzowanego stolika komputerowego XYZ i oprogramowania stereologicznego (główne wskazówki podane poniżej dotyczą komputerów PC, ale wskazówki mogą się różnić dla innych systemów operacyjnych).
   2. Włącz komputer, mikroskop, kontroler sceny i kamerę w odpowiedniej kolejności. Uruchom oprogramowanie stereologiczne.
   3. Przesuń obiektyw 10X na miejsce i wybierz 10X z menu rozwijanego obiektywu.
   4. Poruszaj się po pierwszej sekcji poplamionej Nisslem i znajdź odpowiedni punkt odniesienia. Kliknij myszką, aby ustalić punkt odniesienia (aby się poruszać, należy aktywować przycisk joy free).
   5. Oszacuj "grubość zamontowanego przekroju" (rzeczywista grubość przekroju z uwzględnieniem skurczu). Naciśnij przycisk "Miernik pozycji ostrości" i oblicz grubość od dołu do góry sekcji.
   6. Utwórz narzędzie do konturowania dla obszarów przeciwprądowych i mięśniowych oraz obszaru zawału.
      1. Kliknij menu "Wyświetlacz" i wybierz "Ustawienia wyświetlania". Spowoduje to otwarcie okna dialogowego Ustawienia wyświetlania.
      2. Wybierz zakładkę "Kontury" i kliknij przycisk "dodaj typ konturu".
      3. Utwórz kontur dla każdego obszaru, aby określić ilościowo i uwidocznić go w menu konturu w dół. Kliknij przycisk OK.
   7. Utwórz narzędzie Marker dla półkul przeciwskrzydłowych i mięśniowych oraz obszaru zawału.
      1. Kliknij menu "Wyświetlacz" i wybierz "Ustawienia wyświetlania", aby otworzyć okno dialogowe Ustawienia wyświetlania.
      2. Wybierz zakładkę "Znaczniki" i zmień nazwę znaczników, klikając dwukrotnie na dostępne znaczniki. Uwidocznij je na pasku znaczników. Kliknij przycisk OK.
   8. Aktywuj menedżera sekcji.
      1. Kliknij menu "Narzędzia/Menedżer sekcji szeregowych". Dodaj nową sekcję za pomocą przycisku "nowa sekcja". Ten przycisk otwiera okno dialogowe "Ustawienia sekcji szeregowej".
      2. Ustaw "Wyprzedzenie bloku" na 30 μm. Ustaw "grubość zamontowanego przekroju" z wartością oszacowaną w kroku 3.2.5.
      3. Ustaw "Interwał oceny" na 20. Użyj frakcji próbkowania 1/20 plasterka.
      4. Ustaw "numer sekcji początkowej" na 1. Ustaw wartość "Osi Z dla górnej części pierwszej sekcji" na 0. Kliknij przycisk OK.
   9. Narysuj kontur, aby obrysować przeciwległą półkulę.
      1. Wybierz narzędzie Półkula przeciwdziałająca (utworzone wcześniej w kroku 3.2.6) z menu konturu w dół.
      2. Narysuj kontur, aby obrysować przeciwległą półkulę.
      3. Aby zakończyć śledzenie półkuli przeciwstawnej, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "zamknij kontur
      ".
   10. Oszacuj kontur półkuli przeciwstawnej za pomocą Cavalieri.
       1. Kliknij w menu "Sondy" i wybierz Estymator Cavalieri. Ustaw "Odstępy siatki" na 100 μm. Ustaw "Obrót siatki" na 0. Ustaw "Postęp bloku" na 30 μm. Kliknij OK.
       2. Wybierz przycisk "Półkula przeciwdziałająca" z paska znaczników. Kliknij prawym przyciskiem myszy wewnątrz konturu półkuli przeciwstawnej.
       3. Wybierz "Tryb malowania markerów Cavalieri". Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy wewnątrz konturu półkuli przeciwprądowej i wybierz "Markery malarskie w konturze".
       4. Dezaktywuj Kalkulator Cavalieri, klikając na sondy i Estymator Cavalieri i dezaktywuj przycisk znacznika przeciwstawnego na pasku znaczników.
   11. Powtórzyć tę samą procedurę dla półkuli mięśniowej i obszaru zawału (kroki 3.2.7 i 3.2.8). Zapisz dane po oszacowaniu powierzchni każdej sekcji.
   12. Oblicz obszary przeciwległe, izylesionowe i zawałowe w pozostałej części sekcji zabarwionej Nisslem.
       1. Utwórz nową sekcję, jak w kroku 3.2.6. Nie modyfikuj wartości wprowadzonych w oknie dialogowym "Ustawienia sekcji szeregowej". Kliknij przycisk OK.
       2. Powtórz kroki 3.2.7-3.2.8 w nowej sekcji.
   13. Eksportuj wyniki kwantyfikacji do pliku arkusza kalkulacyjnego.
       1. Kliknij "Sondy" w menu Stereo Investigator. Wybierz opcję "Wyświetl listę uruchomień sondy". Spowoduje to otwarcie okna dialogowego "Poprzednie przebiegi stereologiczne".
       2. Zaznacz wszystkie sekcje, klikając na nie. Naciśnij przycisk "View wyniki". Spowoduje to otwarcie "Wyników estymatora Cavalieri", w którym wyświetlany jest szacowany obszar i objętość dla każdego regionu.
       3. Aby wyeksportować wyniki do pliku arkusza kalkulacyjnego, kliknij przycisk "Kopiuj wszystkie wyniki do schowka" i wklej je do pliku Excela z głównymi wynikami uzyskanymi z każdego regionu (Tabela 2).
   14. Wyrazić objętość zawału w mm³ lub jako % półkuli przebytej (%IH) przy użyciu wzoru¹⁵ %IH = InfVol/ContrVol*100, gdzie

InfVol (objętość tkanki po zawale) = ΣInfArea_i,
ContrVol (objętość półkuli przeciwstawnej) = ΣContrArea_i

4. Stereologiczna kwantyfikacja naciekanych neutrofili po niedokrwieniu mózgu za pomocą frakcjonatora optycznego

1. Barwienie odcinków mózgu:
   1. Do oszacowania całkowitej liczby naciekających neutrofili po MCAO za pomocą frakcjonatora optycznego¹⁶ należy użyć frakcji do pobierania próbek 1/10 warstwy. Barwienie immunologiczne neutrofili przy użyciu konwencjonalnych technik immunofluorescencji z szczurzym przeciwciałem anty-Ly6G (1A8) i prawym przeciwciałem drugorzędowym na swobodnie pływających odcinkach. Ponadto barwienie przeciwstawne za pomocą urządzenia do produkcji jądrowej, takiego jak DAPI lub TOPRO, chociaż nie jest konieczne do identyfikacji neutrofili, może ułatwić wykrycie obszaru zawału.
   2. Zamontuj skrawki mózgu w szkiełku mikroskopowym superfrost z obszarem zawału umieszczonym po prawej stronie.
2. Kwantyfikacja naciekanych leukocytów w niedokrwionym mózgu za pomocą frakcjonatora optycznego
   1. Parametry przedstawione w Tabeli 3 należy wykorzystać do ilościowego określenia naciekanych leukocytów w niedokrwionym mózgu za pomocą optycznego frakcjonatora z systemem stereologii. Powtórz kroki 3.2.1-3.2.5 z sekcji 3.
   2. Utwórz narzędzie do konturowania obszaru po zawale, tak jak zostało to opisane w kroku 3.2.6 w sekcji 3.
   3. Utworzyć narzędzie do oznaczania neutrofili, jak to zostało opisane w kroku 3.2.7 w sekcji 3.
   4. Aktywuj menedżera sekcji i utwórz nową sekcję, jak w kroku 3.2.8. W takim przypadku ustaw "Interwał oceny" na 10 (do oszacowania liczby neutrofili używana jest frakcja próbkowania 1/10 wycinka).
   5. Wybierz narzędzie do konturowania "Obszar zawału" (utworzone wcześniej w kroku 4.2.1) z menu konturu w dół. Narysuj kontur, aby obrysować obszar zawału przy obiektywie 10X. Zmień cel na 100X, aby przeprowadzić kwantyfikację neutrofili (nie zapomnij wybrać 100X z rozwijanego menu obiektywu).
   6. Kliknij menu "Sondy" i wybierz "Frakcjonator optyczny". Ustaw "Rozmieszczenie XY ramek zliczania" na 230 zarówno dla rozmiaru siatki X, jak i Y. Ustaw "Obrót siatki" na 0. Ustaw "Postęp bloku" na 30 μm. Kliknij OK.
   7. Wybierz przycisk "neutrofile" na pasku znaczników. Zaznacz barwione neutrofile w obszarze zawału. Po zakończeniu dezaktywuj sondę frakcjonowania optycznego, klikając "Sondy" i "Frakcjonator optyczny". Wyłącz przycisk neutrofili z paska znaczników.
   8. Powtórzyć tę samą procedurę dla każdej sekcji (4.2.4-4.2.9).
   9. Eksportuj wyniki kwantyfikacji do pliku arkusza kalkulacyjnego.
      1. Kliknij "Sondy" w menu Stereo Investigator. Wybierz opcję "Wyświetl listę uruchomień sondy", aby otworzyć okno dialogowe "Poprzednie uruchomienia stereologiczne".
      2. Zaznacz wszystkie sekcje, klikając na nie. Naciśnij przycisk "View Results", aby otworzyć "Wyniki frakcjonatora optycznego", w którym wyświetlana jest szacowana liczba neutrofili.
      3. Wyeksportuj wyniki do pliku arkusza kalkulacyjnego, klikając przycisk "Kopiuj wszystkie wyniki do schowka" i wklej do pliku arkusza kalkulacyjnego.

5. Dysocjacja mózgu i analiza cytometrii przepływowej

UWAGA: Charakterystyka subpopulacji szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej na świeżej tkance mózgowej może być wykorzystana jako alternatywa dla poprzedniej charakterystyki neutrofili wykonywanej na stałych i immunologicznie wycinkach mózgu.

1. Dysocjacja mózgu i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki
   1. Przygotować 10 ml/zwierzę roztworu RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-Percoll zawierającego 8 ml RPMI, 1 ml 30% Percollu i 1 ml 10x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
   2. Usuń mózg myszy po MCAO, jak opisano w kroku 2.3.
   3. Pod mikroskopem wypreparuj obszary rdzenia i okołozawałowe kory ipsilateralnej z niedokrwiennej mózgu myszy (lub podobnego obszaru dla pozorowanych i naiwnych zwierząt) z mózgu. Zważ tkankę mózgową i umieść ją w 5 ml lodowatego RPMI-Percoll (krok wagowy można wykonać w celu normalizacji między grupami eksperymentalnymi).
   4. Zdysocjuj tkankę w zawiesinie pojedynczej komórki za pomocą młynka do tkanek typu Potter-Elvehjem z tłuczkami teflonowymi.
   5. Przenieść zawiesiny komórek do probówki ultrawirówki o pojemności 50 ml i dodać do próbek 5 ml roztworu RPMI-Percoll.
   6. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 7 800 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Po odwirowaniu upewnij się, że na górze roztworu pojawia się biała warstwa odpowiadająca mielinie.
   7. Ostrożnie usuń warstwę mieliny i przefiltruj całe zawiesiny komórek, w tym komórki granulowane, przez sitko z nylonowej siatki o średnicy 40 μm.
   8. Dodaj 10 ml RPMI na sitko, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przefiltrowane i umieść roztwór w probówce o pojemności 50 ml. Dodać 30 ml RPMI i odwirować 50 ml zawiesiny komórek przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad leukocytów w 1 ml PBS. Dodać 4 ml buforu do lizy (150 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ i 0,1 mM EDTA) i inkubować komórki przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej w celu lizy erytrocytów z zawiesiny komórkowej. Odwirować roztwór o stężeniu 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
2. Barwienie komórek i cytometria przepływowa
   1. Przygotować koktajl do znakowania do cytometrii przepływowej, zawierający 200 μl PBS-BSA (1%) 1:100 Fc-Block, 1:40 anty-CD45-PercP szczur, 1:40 anty-Ly6G-APC, 1:40 anty CD11b-FITC szczura i 1:40 anty-Ly-6C-PE szczura na próbkę.
   2. Ponownie zawiesić komórki w koktajlu etykietującym i inkubować próbki przez 45 minut w lodzie.
   3. Przemyć koktajl do etykietowania 1 ml zimnego PBS i odwirować komórki przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad za pomocą 100 μl FACS Flow i uzyskać całą zawiesinę komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
   4. Użyj oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, aby scharakteryzować i określić ilościowo populacje komórek.
      1. Główne podzbiory leukocytów odpowiadające koktajlowi znakującemu przygotowanemu w tym protokole można scharakteryzować w następujący sposób: CD45^loCD11b⁺: rezydentne komórki mikrogleju; CD45^hiCD11b⁺Ly-6G⁺: neutrofile; CD45^hiCD11b⁺Ly-6G-Ly-6C^hi: prozapalne monocyty.

Wyniki

Model niedokrwienia mózgu pokazany tutaj generuje zawały widoczne wyłącznie w korze mózgowej, nie wpływając na tkankę prążkowia, ponieważ gałęzie soczewkowo-triatalne MCA, które nawadniają prążkowie, nie są zasłonięte (Rysunek 1). Poprzez barwienie Nissl uszkodzony obszar można zidentyfikować jako hipochromiczny obszar korowy (ryc. 2). Model ten charakteryzuje się wysoce powtarzalnymi objętościami zawału po 24 godzinach od MCAO (%IH 15,89 ± 0,28) oszacowanymi metodą Cavalieriego w skrawkach barwionych Nisslem (ryc. 2). Oszacowanie objętości zawału metodą Cavalieriego jest dokładnym podejściem z niskim błędem, który znajduje odzwierciedlenie we współczynniku błędu (CE) Gundersena w półkulach przeciwstawnych i ipsilesionalnych, a także w obszarze zawału (tabela 2). Objętość uszkodzonej tkanki może być wyrażona w^mm3, ale także jako % IH, korzystając ze wzoru podanego w sekcji 3.2.13. Ponadto oszacowanie całkowitej objętości obszarów mięśniowych i przeciwprądowych pozwala na obliczenie wskaźnika obrzęku w celu skorygowania objętości zawału i uniknięcia przeszacowania uszkodzonej tkanki (tabela 2).

Biorąc pod uwagę przetwarzanie sekcji tkanki mózgowej, można to wykorzystać do przeprowadzenia dokładnego oszacowania całkowitej liczby subpopulacji komórek, takich jak infiltrowane neutrofile, w obszarze niedokrwiennym, przy użyciu metody frakcjonowania optycznego (Rysunek 3 i Tabela 4) z parametrami pokazanymi w Tabeli 3. Protokół ten szacuje całkowitą liczbę neutrofili (komórek Ly6G-dodatnich) w obszarze zawału wynoszących 23 328 ± 3 623 po 24 godzinach i 82 856 ± 8 143 po 48 godzinach u myszy po pMCAO (Figura 3D). Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, naciek neutrofili jest bezpośrednio skorelowany z rozmiarem zawału (ryc. 3E). Oszacowanie liczby neutrofili metodą frakcjonowania optycznego jest dokładnym podejściem z niskim błędem, który znajduje odzwierciedlenie w CE Gundersena (Tabela 4).

Protokół charakterystyki izolacji leukocytów i cytometrii przepływowej pozwala na izolację 47 922 ± 23 174 komórek szpikowych z kory półkuli ipsilesionalnej myszy niedokrwiennych. Stanowi to 10-30% wszystkich zdarzeń znalezionych w zawiesinie komórki. Zdecydowana większość zdarzeń zarejestrowanych przy użyciu tego protokołu charakteryzuje się niskim parametrem FSC, związanym ze szczątkami komórkowymi (rysunek 4). Barwienie CD11b pokazuje, że komórki CD11b ⁺ mają wyższą wartość FSC (Figura 4), co sugeruje, że szczątki komórek nie są znakowane tym markerem i, jak wskazano wcześniej, że można je wykluczyć z dalszej analizy, ustawiając próg FSC na 200⁹. Zmienna ilość szczątków komórkowych uzyskanych tą metodą sugeruje, że mogą to wyjaśniać różnice w przetwarzaniu próbki (czas, konserwacja tkanki, temperatura próbki, skuteczne usuwanie mieliny itp.). Ponadto konieczne jest również użycie filtrów siatkowych, aby uniknąć obecności klamer komórkowych w próbkach; Ten krok należy wykonać przed barwieniem komórek. Korzystając ze strategii bramkowania pokazanej na rysunku 5, która opiera się na ekspresji CD11b i CD45, możemy rozróżnić między rezydentnymi i naciekającymi komórkami szpikowymi w tkance niedokrwiennej. Ta populacja CD11b ⁺ zwiększa się w półkuli niedokrwiennej w porównaniu z grupą naiwną i pozorowaną, w której komórki te są głównie związane z niską ekspresją CD45, co wskazuje, że mikroglej proliferuje po niedokrwieniu (Figura 4, Figura 5 i Tabela 5). Różnica ta jest prawdopodobnie spowodowana infiltracją komórek z peryferii, o czym świadczy pojawienie się subpopulacji^{komórek hi} CD11b ⁺ CD45 w niedokrwionym mózgu (Figura 4, Figura 5 i Tabela 5), która jest niska w mózgach naiwnych i pozorowanych. Udział nacieków w populacji komórek CD11b⁺ w niedokrwieniu mózgu jest procesem bardzo dynamicznym⁴. W modelu MCAO według ligatury może się wahać od 30% do 60% wszystkich komórek CD11b⁺, w zależności od wielkości zmiany i czasu, w którym dokonano charakterystyki. Neutrofile, scharakteryzowane jako komórki Ly-6G ⁺, są najliczniejszą infiltrowaną populacją komórek stwierdzoną po 24 godzinach od MCAO w niedokrwionym mózgu myszy przy użyciu tego modelu niedokrwienia mózgu, ponieważ stanowią 70-80%^hi CD11b ⁺ CD45. Reszta komórek to w większości subpopulacja monocytów prozapalnych CD11b⁺CD45^hiLy-6G-Ly-6C^. W tym modelu populacja ta wzrośnie liczebnie w niedokrwiennych obszarach mózgu od 24 do 48 godzin po MCAO.

Rycina 1: Zabieg chirurgiczny podwiązania MCA. (A) Po wycofaniu mięśnia skroniowego wykonuje się małą kraniotomię w czaszce myszy. MCA jest podwiązane węzłem lub węzłem ślizgowym za pomocą szwu 9/0. (B) Reprezentatywne obrazy zmiany korowej wygenerowane przez model MCAO. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Kwantyfikacja objętości zawału przez Cavalieri. (A) Reprezentatywne obrazy wycinków mózgu zabarwionych Nisslem 24 godziny po trwałym podwiązaniu MCA. Duże powiększenie pokazuje obszar hipokromatyczny po barwieniu Nissl, który identyfikuje uszkodzony obszar (rdzeń) po MCAO. Pokazany jest również obszar okołozawałowy (P.I). (B) Kwantyfikacja objętości zawału reprezentowanej jako % półkuli zawału (% IH) przy użyciu metody Cavalieriego w seryjnych odcinkach barwionych Nisslem, 24 godziny po MCAO (n = 50 myszy).

Rycina 3: Stereologiczna kwantyfikacja neutrofili w obszarze zawału 24 i 48 godzin po podwiązaniu, przy użyciu metody frakcjonowania optycznego. (A) Reprezentatywny obraz naciekających neutrofili (komórek Ly6G-dodatnich) w obszarze niedokrwiennym po 24 godzinach od MCAO. Rozgraniczenie pokazuje obszar zawału. (B, C) Przykłady dysektora optycznego do oznaczania ilościowego neutrofili za pomocą frakcjonatora optycznego. (D) Kwantyfikacja całkowitej liczby neutrofili w regionie zawału po 24 i 48 godzinach (n = 4 myszy). (E) Korelacja liczby neutrofili z wielkością zawału po 24 i 48 godzinach od podwiązania MCA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Reprezentatywna analiza rozproszenia kropkowego leukocytów mózgu uzyskanych z półkul naiwnych, pozorowanych i niedokrwiennych (24 godziny po MCAO) na podstawie parametrów fizycznych (SSC i FSC). Populacja zdarzeń wykazujących ekspresję CD11b (kolor czerwony) została zidentyfikowana we wszystkich grupach. Populacja ta została ogrodzona i scharakteryzowana zgodnie z ekspresją CD45. Komórki wyrażające niskie poziomy CD45 (zielone) były obecne w niedokrwiennej i nieniedokrwiennej korze mózgowej i odpowiadały komórkom mikrogleju. Natomiast komórki wyrażające wysoki poziom CD45 (żółty) stwierdzono tylko w półkuli niedokrwiennej i w mniejszym stopniu w grupie pozorowanej. Dalsza analiza populacji^hi CD11b⁺CD45 wskazuje, że neutrofile (komórki Ly-6G⁺, niebieskie) i monocyty prozapalne^{(komórki hi} Ly-6C, kolor pomarańczowy) są głównymi subpopulacjami komórek występującymi w naciekach mózgu 24 godziny po udarze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Strategie bramkowania w celu odróżnienia rezydentnych od naciekanych komórek szpikowych w tkance niedokrwiennej. Komórki CD11b ⁺ zostały najpierw bramkowane zgodnie z intensywnością fluorescencji izotypu (A). Reprezentatywny wykres punktowy zawiesin komórkowych niedokrwionego mózgu jest pokazany w prawym górnym rogu panelu. Ponadto przedstawiono typowe wartości całkowitej liczby zdarzeń oraz liczby zdarzeń CD11b⁺ uzyskanych przy użyciu tej techniki (liczba komórek/niedokrwienna półkula mózgu; (A) Analiza intensywności fluorescencji CD45 komórek CD11b ⁺ pokazano w panelu B. Reprezentatywna analiza wykresu punktowego ekspresji CD45 i CD11b bramkowanej subpopulacji CD11b⁺ jest pokazana w prawym górnym rogu panelu. Ponadto pokazano typową liczbę komórek CD45^lo CD45^hi nabytych na niedokrwioną półkulę mózgu przy użyciu tej techniki (B).

wzrost

Parametry używane w metodzie Cavalieriego
Grubość przekroju (t)	30 μm
cel	10-krotny
Frakcja próbkowania plastrów (ssf)	1/20
Odległość między sekcjami	600 μm
Odstępy siatki	100 μm

Tabela 1: Parametry używane do stereologicznej kwantyfikacji tkanki po zawale.

choroby osób osób osób osób osób osób osób osób pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Wyniki	Przeciwstawne	Ipsilesional (Język angielski)	Zawał
Powierzchnia (μm²)	151 460 000	155 060 000	22 600 000
Objętość (μm³)	90 876 000 000	93 036 000 000	13 560 000 000
Objętość skorygowana dla Nadmierna projekcja (μm³)	89 957 100 000	92 046 300 000	13 416 600 000
Współczynnik błędu (Gundersen), m=0	0,068	0,077	0,067
Współczynnik błędu (Gundersen), m=1	0,015	0,017	0,015
Współczynnik błędu (Gundersen), alfa(q)	0,068	0,077	0,067
% Półkula z zawałem		14.90
Obrzęk mózgu (Ips Vol/Cont Vol)		1.02

Tabela 2: Reprezentatywne przykłady objętości przeciwstawnych, mięśniowych i zawałowych metodą Cavalieriego przy użyciu oprogramowania Stereo Investigator.

Parametry używane dla frakcjonatora optycznego
Grubość przekroju (tsf)	30 μm
cel	100-krotny
Frakcja próbkowania plastrów (ssf)	1/10
Zliczanie wysokości ramy	40 μm
Zliczanie szerokości ramki	40 μm
Rozmiar siatki X	230 μm
Rozmiar siatki X	230 μm
Straż	2 μm
Wysokość dysektora optycznego	14 μm

Tabela 3: Parametry używane do stereologicznego oznaczania naciekanych neutrofili po niedokrwieniu mózgu za pomocą optycznej sondy frakcjonującej za pomocą oprogramowania Stereo Investigator.

zł pkt.

Szacowanie neutrofili za pomocą frakcjonatora optycznego
Liczba miejsc pobierania próbek	Z numerem 430
Współczynnik kształtu	Lokal 6,24
Łączna liczba znaczników zliczonych	Rozdział 166
Szacowana liczba neutrofili za pomocą frakcjonatora optycznego	117 608,03
Współczynnik błędu (Gundersen), m=0	0,22
Współczynnik błędu (Gundersena), m=1	0,09

Tabela 4: Reprezentatywny przykład szacowanej liczby infiltrowanych neutrofili po niedokrwieniu mózgu za pomocą sondy Optical Fractionator przy użyciu oprogramowania Stereo Investigator.

.

	Zobacz materiał CD11b+	Neutrofile	Monocytów	Mikroglej
naiwny	25 863 ± 4 575,8	od 473 ± 75,8	525 ± 191,4	19 012 ± 1 523
Udawanie 24 godziny	24 563 ± 5 263	873 ± 192,5	1 124 ± 391,5	23 734 ± 2 910
pMCAO 24 godz	47 922 ± 23 174	4 874 ± 748,7	4 826 ± 1 345	35 395 ± 10 833

Tabela 5: Reprezentatywne wyniki szacowanych komórek szpikowych po niedokrwieniu mózgu metodą cytometrii przepływowej.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj model niedokrwienia mózgu daje wysoce powtarzalne objętości zawału określone 24-48 godzin i 7 dni po podwiązaniu MCA różnymi podejściami^8,15,17. Ten model MCAO ma niski wskaźnik śmiertelności (mniej niż 1%) w porównaniu z innymi, minimalizując liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach. Kluczowym krokiem do uzyskania tak niskiego wskaźnika śmiertelności jest utrzymanie odpowiednich warunków aseptycznych, aby uniknąć infekcji, które mogłyby pogorszyć przeżycie po indukcji udaru. Ten model MCAO może być używany nie tylko jako stały model MCAO, który jest uważany za model klinicznie istotny dla badań translacyjnych¹⁸, ale także jako model przejściowy przez przejściowe podwiązanie CCA i MCA z węzłem ślizgowym i reperfuzją tylną w pożądanym czasie¹⁹. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana u myszy i szczurów^17,20. Wszystkie te dowody wskazują, że MCAO przez podwiązanie jest wysoce wszechstronnym modelem niedokrwienia mózgu o wielu zastosowaniach. Krytycznym etapem tej techniki jest to, że wymaga ona inwazyjnej operacji pod mikroskopem stereoskopowym; kraniotomia powinna być wykonana bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić kości jarzmowej, a także MCA. Jednak wykorzystanie zwierząt pozorowanych (które są poddawane zabiegowi chirurgicznemu, ale nie wykonuje się podwiązania CCA i MCA) stanowi użyteczne narzędzie do rozróżniania efektów zależnych od zabiegu chirurgicznego. Zakres uszkodzenia mózgu po zastosowaniu tej techniki można określić ilościowo za pomocą kilku metod. Nasz protokół sekcji mózgu, barwienia Nissl i późniejszego oszacowania objętości przez Cavalieri pozwala na dokładne ilościowe określenie uszkodzonego obszaru i minimalizuje liczbę myszy wykorzystywanych w tego typu badaniach, ponieważ seryjne sekcje mózgu mogą być również wykorzystywane do różnych analiz immunohistochemicznych. Aby uzyskać lepsze wyniki tej metodyki, kluczowe znaczenie ma wybór odpowiednich parametrów stosowanych w oprogramowaniu do stereologii (tabela 1), które będą niezbędne do oszacowania objętości różnych obszarów za pomocą wzoru: V = 1/ssf*a_f*t*ΣP_i (Ssf jest frakcją próbkowania warstwy, t jest średnią grubością odcinków, a_f to obszar odstępu siatki, a ∑P to liczba punktów uderzających w strukturę).

Dystalne MCAO przez podwiązanie może być przydatne do scharakteryzowania naciekających subpopulacji leukocytów i komórek odpornościowych^8,13 , które uczestniczą w procesie zapalnym po urazie mózgu^1-4. W tym miejscu proponujemy dwie różne metodologie charakterystyki komórek odpornościowych mózgu, precyzyjne podejście stereologiczne i analizę cytometrii przepływowej w celu lepszego scharakteryzowania subpopulacji wielu leukocytów.

Korzystając z seryjnego podziału mózgu, ilościowe określenie całkowitej liczby neutrofili można osiągnąć za pomocą metody frakcjonowania optycznego¹⁶, która szacuje całkowitą liczbę komórek na podstawie liczby komórek pobranych za pomocą systematycznego zestawu losowo próbkowanych (SRS) bezstronnych wirtualnych przestrzeni zliczających obejmujących cały obszar zainteresowania, w naszym przypadku obszar zawału, z jednakową odległością między bezstronnymi wirtualnymi przestrzeniami zliczającymi w kierunkach X, Y i Z. Metoda ta zapewnia dokładne narzędzie do oszacowania całkowitej liczby neutrofili w niedokrwionym mózgu w różnych momentach po podwiązaniu. Chociaż nie wykazano tego w tym badaniu, protokół ten może być również stosowany do szacowania różnych subpopulacji neutrofili po niedokrwieniu²¹ oraz do dokładnej kwantyfikacji dowolnej innej populacji komórek znajdujących się w niedokrwionym mózgu, takich jak inne naciekane leukocyty (monocyty / makrofagi), a także do szacowania neuronów, które przeżyły, a nawet do kwantyfikacji neurogenezy po udarze. Najważniejszym krokiem do dokładnego oszacowania w pożądanym obszarze jest wybór odpowiednich parametrów, takich jak te przedstawione w Tabeli 3 dla kwantyfikacji neutrofili w obszarze niedokrwiennym. Parametry te zostaną wykorzystane w oprogramowaniu stereologicznym do obliczenia całkowitej dodatniej liczby komórek (N) przy użyciu równania N = ΣQ- x 1/ssf x 1/asf x 1/tsf (ΣQ- to całkowita liczba komórek zliczonych za pomocą frakcjonatora, ssf to frakcja próbkowania sekcji, asf to powierzchnia frakcji próbkowania, a tsf to grubość frakcji próbkowania)⁵. Chociaż metodologia ta jest wolniejsza niż inne techniki kwantyfikacji (na przykład analiza markerów neutrofili w mg tkanki, densytometria reprezentatywnych obrazów lub liczba neutrofili w polu), ma tę zaletę, że jest bezstronną i solidną techniką, która zapewnia precyzyjną kwantyfikację liczby komórek.

Metoda izolacji leukocytów w mózgu pozwala na jednoczesną identyfikację i kwantyfikację kilku podtypów komórek odpornościowych bez konieczności wypaczania systemu poprzez barwienie in vivo lub manipulacje genetyczne. Późniejsze sortowanie komórek ze scharakteryzowanych populacji szpiku lub ich separacja immunomagnetyczna może być wykorzystana do wielu dalszych zastosowań, takich jak dalsze badania nad ekspresją genów lub białek. Dokładna charakterystyka neutrofili, monocytów i mikrogleju uzyskana tą metodą zapewnia wysoką specyficzność w odniesieniu do istniejących metod, takich jak badania immunohistochemiczne, co pozwala przypisać określone funkcje różnym komórkom szpikowym, które pośredniczą w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej mózgu. Ponadto można go dalej rozszerzyć, aby scharakteryzować inne populacje mózgu z odpowiednią etykietą, takie jak makrofagi urodzone we krwi (CD11b ⁺ CD45^hiCD68 ⁺), i może być stosowany do badania innych patologii lub urazów OUN. Dlatego technika ta stanowi niezbędne narzędzie do badania niejednorodności reakcji zapalnej w mózgu. Głównym ograniczeniem tej techniki jest przygotowanie zawiesin leukocytów ze świeżej tkanki mózgowej, które mogą zmienić stan aktywacji komórek lub ich zmianę antygenu. Chociaż technika ta pozwala na bardziej szczegółową charakterystykę jakościową w porównaniu z badaniami immunohistochemicznymi, zapewnia mniej dokładną kwantyfikację opartą na izolacji komórek. Mimo to skuteczność naszego protokołu izolacji komórek jest podobna do innych opublikowanych metodologii⁹ i może być skutecznie wykorzystana do wykrywania różnic w liczbie komórek odpornościowych mózgu między grupą kontrolną a grupą MCAO, a nawet między grupami MCAO poddanymi różnym zabiegom⁸.

Krytycznymi etapami tego protokołu są rozwarstwienie tkanki, procedura rozerwania tkanki i usunięcie mieliny. Jeśli chodzi o pobieranie tkanek, można uwzględnić etap normalizacji (poprzez zważenie pobranej tkanki), aby uniknąć zmienności spowodowanej różnymi wydajnościami sekcji. Ponadto normalizacja między różnymi grupami MCAO może również wystąpić poprzez objętość zawału (wcześniej określaną przez rezonans magnetyczny). Innym sposobem rozwiązania tego problemu jest użycie całej półkuli ipsilateralnej zarówno grupy niedokrwiennej, jak i kontrolnej, a nawet użycie przeciwległej półkuli myszy niedokrwionej jako kontroli, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt. Chociaż takie podejście pozwala uniknąć różnic między każdą sekcją, ma główną wadę; Współczynnik rozcieńczenia dodaje się poprzez zwiększenie całkowitej liczby komórek, ale nie liczby komórek szpikowych, które znajdują się wyłącznie w obszarach rdzenia i okołozawałowych kory ipsilateralnej. Jeśli chodzi o rozerwanie tkanek, protokół ten ilustruje etapy mechanicznego rozerwania komórek mózgowych, unikając zabiegów enzymatycznych i zapobiegając powierzchniowej zmianie antygenu^9,22, co jest istotną kwestią dla dalszej analizy jakościowej i ilościowej subpopulacji komórek zapalnych. Oprócz przygotowania zawiesiny komórkowej, która jest przedmiotem zainteresowania, usunięcie mieliny z próbek mózgu jest wysoce zalecanym krokiem w celu uniknięcia zakłóceń w dalszych zastosowaniach, takich jak immunomagnetyczna separacja komórek lub cytometria przepływowa^23,24. Można to osiągnąć za pomocą różnych metod, takich jak gradienty sacharozy lub Percollu lub kulki antymielinowe. Tutaj, a także w oparciu o wcześniejsze badania, które porównują różne metody izolacji zawiesiny komórek mózgowych, zakłócenia mechaniczne w połączeniu z użyciem Percollu do usuwania mieliny są stosowane w celu poprawy wydajności^{i żywotności komórek}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Photonic Led F1	WPI	571329-8	Regulator
temperatury sprzętu	Panlab	HB 101/2	Sprzęt
Volvere GX	NSK	Ne22L	Sprzęt
Mikroskop	WPI	PZMIII-BS	Sprzęt
Frezy ze stali nierdzewnej	FST	19007-14	Kleszcze do materiałów chirurgicznych
Dumont #5/45	FST	11251-35	Materiał chirurgiczny
Kleszcze Dumont #5SF	FST	11252-30	Materiał chirurgiczny
Szew 6/0	LorcaMarin	55108	Materiał chirurgiczny
Szew 9/0	LorcaMarin	61966	Materiał chirurgiczny
Nikon Eclipse	Nikon	TE300	Sprzęt
Isoflurane	Esteve	571329-8	Chemiczny
Pentobarbital sodu	Wetochinol	570681	Chemiczny
mikrotom	zamrażania Leica Microsystems GmbH	SM2000R	Sprzęt
Prowadnice Superfrost	Thermo Scientific	2014-07	Materiał laboratoryjny
Octan fioletu kresylowego	Sigma	C5042	Mikroskop chemiczny
nbsp;	Nikon	Nikon Eclipse TE300	Sprzęt
XYZ zmotoryzowany stolik komputerowy i kontroler	Ludl electronics Produkty		Sprzęt
Stereo Investigator System	Microbrightfield	Wersja oprogramowania 7.003
Oprogramowanie 5 ml Młynek do tkanek, Potter-Elv z tłuczkiem teflonowym	Thomas Scientific	0913X70	Materiał laboratoryjny
Polipropylen 50 ml Dąb Ridge Probówka wirówkowa	Nalgene	3119-0050	Materiał laboratoryjny
Percoll	Sigma	p1644-100	Chemiczny
RPMI 1640	Lonza	BE12-702F	Chemiczny
Ultrawirówka Beckman Wyposażenie	redlic
Wirnik ultrawirówki Beckman Coulter 45 Ti	Wyposażenie redlic
Sterylne sitko komórkowe, 40 mikronów	BD	BD 352340	Materiał laboratoryjny
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A3733-500G	Reagment
FcR Odczynnik blokujący, mysz	Miltenyi	130-092-575	Przeciwciało
CD11b-FITC, ludzkie i mysie	Miltenyi	130-098-085	Przeciwciało
CD45-PE, mysz	Miltenyi	130-102-596	Przeciwciało
Anti-Ly-6G-APC, mysz	Przeciwciało Miltenyi	130-102-936
Przeciwciało przeciw myszom Ly-6C Biolegend 128012 PerCP/Cy5.5
BD FACS Flow	BD	342003	Reagment
BD FACSCalibur; 4-kolorowe	342975		oprogramowanie BD
Cell Quest Pro Oprogramowanie	BD
FlowJo	Treestar inc.		oprogramowanie