Artykuł metodologiczny

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52038

⸱

8 października 2014

 ,  , 
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Streszczenie

Mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa umożliwiła analizę parametrów morfologicznych i fizjologicznych komórek mózgowych w nienaruszonej tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W połączeniu z elektrofizjologią jest szeroko stosowany do badania sygnałów wapniowych związanych z aktywnością w małych przedziałach subkomórkowych, takich jak dendryty i kolce dendrytyczne. Oprócz stanów przejściowych wapnia, aktywność synaptyczna indukuje również postsynaptyczne sygnały sodowe, których właściwości są tylko marginalnie poznane. W tym miejscu opisujemy metodę połączonego obrazowania sodowego za pomocą całokomórkowych krosówek i wielofotonowych w mikrodomenach komórkowych neuronów centralnych. Ponadto wprowadzamy zmodyfikowaną procedurę rozmieszczania glutaminianu w klatkach pod wpływem światła ultrafioletowego (UV), która umożliwia niezawodną i ogniskową aktywację receptorów glutaminianu w tkance. W tym celu przeprowadzono zapisy całych komórek na neuronach piramidowych Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) w ostrych wycinkach tkanki hipokampa myszy. Neurony wypełniono wrażliwym na sód barwnikiem fluorescencyjnym SBFI za pomocą pipety łatkowej, a wzbudzenie wielofotonowe SBFI umożliwiło wizualizację dendrytów i sąsiednich kolców. Aby ustalić indukowane promieniowaniem UV ogniskowe rozmieszczanie, przetestowano i zoptymalizowano kilka parametrów, w tym natężenie światła, objętość, na którą wpływa wiązka uwalniająca UV, położenie wiązki, a także stężenie związku w klatce. Nasze wyniki pokazują, że miejscowa perfuzja glutaminianu w klatce (MNI-glutaminianu) i jego ogniskowe odkleinanie UV powodują prądy wewnętrzne i stany przejściowe sodu w dendrytach i kolcach. Przebieg czasowy i amplituda zarówno prądów wewnętrznych, jak i sygnałów sodowych korelują z czasem trwania impulsu odblokowującego. Co więcej, nasze wyniki pokazują, że wewnątrzkomórkowe sygnały sodu są blokowane w obecności blokerów jonotropowych receptorów glutaminianu, co pokazuje, że pośredniczy w nich napływ sodu przez ten szlak. Podsumowując, nasza metoda stanowi wiarygodne narzędzie do badania wewnątrzkomórkowych sygnałów sodowych indukowanych przez ogniskową aktywację receptora w nienaruszonej tkance mózgowej.

Wprowadzenie

Ostatnie ulepszenia w technikach mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia wielofotonowa, umożliwiły badanie parametrów morfologicznych i fizjologicznych komórek mózgowych w nienaruszonej tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W połączeniu z elektrofizjologią, techniki te są obecnie szeroko stosowane do analizy sygnałów elektrycznych związanych z aktywnością neuronów, a także jednoczesnych sygnałów wapniowych w małych przedziałach subkomórkowych, a mianowicie w drobnych dendrytach i kolcach dendrytycznych. Oprócz stanów przejściowych wapnia, aktywność synaptyczna indukuje również sygnały sodowe w dendrytach i kolcach, których właściwości są w dużej mierze niezbadane. Takie sygnały mogą być analizowane za pomocą dwufotonowego obrazowania wewnątrzkomórkowego sodu ([Na+]i), co umożliwia pomiar on-line stanów nieustalonych [Na+]i przez dłuższy czas bez znacznego bielenia barwnika lub fotouszkodzeń1,2.

Do obrazowania [Na+]i dostępnych jest tylko kilka chemicznych barwników wskaźnikowych, np. CoroNa Green lub Asante Natrium Green3,4. Najczęściej stosowaną sondą fluorescencyjną do obrazowania Na+ jest izoftalan benzofuranu wiążący sód (SBFI). Jest to barwnik ratiometryczny, wzbudzony promieniami UV, podobny do dobrze znanego barwnika wrażliwego na wapń fura-2 i jest stosowany do konwencjonalnego obrazowania Na+ w wielu typach komórek (np. 5,6). Istnieją różne możliwości wzbudzenia barwnika i zebrania jego fluorescencji. Jeżeli wymagana jest wysoka rozdzielczość czasowa (tj. duża liczba klatek na sekundę obrazowania) w połączeniu z informacjami przestrzennymi, SBFI może być wzbudzany za pomocą ksenonowej lampy łukowej lub urządzenia z diodą elektroluminescencyjną (LED) dużej mocy, a jego emisja jest wykrywana za pomocą szybkiej kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)7,8. Aby uzyskać maksymalną rozdzielczość przestrzenną w głębi tkanki, metodą z wyboru jest wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa9. Stosunkowo niska sprawność kwantowa SBFI wymaga stosunkowo wysokich stężeń barwnika (0,5 - 2 mM) oraz bezpośredniego ładowania nieprzepuszczalnej dla membrany formy SBFI za pomocą ostrej mikroelektrody10 lub pipety krosowej1.

Korzystając z SBFI, wcześniejsze prace przeprowadzone na ostrych wycinkach tkanki hipokampa gryzoni wykazały związane z aktywnością przejściowe stany sodu w dendrytach i kolcach neuronów piramidowych CA1, które są głównie spowodowane napływem sodu przez jonotropowe receptory NMDA1,2. Do bardziej szczegółowego badania właściwości takich lokalnych sygnałów sodowych dobrze dopasowaną metodą jest specyficzna aktywacja receptorów postsynaptycznych poprzez zastosowanie agonistów receptorów. Aby naśladować aktywność presynaptyczną i uwalnianie przekaźnika, aplikacja powinna być stosunkowo krótka i skoncentrowana, aby umożliwić miejscową stymulację. Okazuje się to jednak dość trudne w nienaruszonej tkance. Miejscowe uciskanie agonistów receptorów za pomocą pipety z cienką końcówką umożliwia bardzo ogniskową aplikację, ale niesie ze sobą potencjalne ryzyko wywołania ruchu interesującej nas struktury (np. takiej jak dendryt lub kolce dendrytyczne), a tym samym utrudnia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Przydatność jonoforezy substancji neuroaktywnych zależy od ich właściwości elektrycznych, a wysokie amplitudy prądu mogą również powodować powstawanie artefaktów komórkowych.

Jednym ze sposobów na obejście tych przeszkód jest zastosowanie związków aktywowanych światłem i ich fotolizy błyskowej. Zasadniczo, do fotoaktywacji substancji w klatkach stosuje się dwie różne zasady: I) Fotoliza błyskowa o szerokim poluwidzenia 11 i II) Ogniskowe odtworzenie w klatkach z wykorzystaniem modułów skanujących w połączeniu z laserami12. Podczas gdy fotoliza błyskowa o szerokim polu widzenia jest wykorzystywana do aktywacji większych obszarów zainteresowania, np. całej komórki, ogniskowe odblokowywanie jest stosowane do specyficznej stymulacji małych przedziałów komórkowych. W niniejszym badaniu demonstrujemy procedurę obrazowania sodowego w całych komórkach w postaci klamry i wielofotonowych w dendrytach i kolcach neuronów centralnych, w połączeniu ze zmodyfikowaną procedurą odcinania glutaminianu wywołanego światłem UV, co umożliwia niezawodną i ogniskową aktywację receptorów glutaminianu w tkance.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Heinricha Heinego w Düsseldorfie w Niemczech, a także z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich (86/609/EWG). Wszystkie eksperymenty zostały zgłoszone do Biura ds. Dobrostanu Zwierząt w placówce opieki i wykorzystania zwierząt Uniwersytetu Heinricha Heinego w Düsseldorfie w Niemczech i przez nie zatwierdzone (numer aktu instytucjonalnego: O52/05). Zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (Tierschutzgesetz, artykuły 4 i 7), nie było wymagane żadne formalne dodatkowe zezwolenie na pobranie tkanki mózgowej po śmierci.

W celu przygotowania skrawków ostrych myszy znieczulono CO2, a następnie szybko poddano dekapitacji (zgodnie z zaleceniami Komisji Europejskiej opublikowanymi w: Euthanasia of experimental animals, Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 1997; ISBN 92–827-9694-9).

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do sekcji zawierający (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 oraz 20 glukozy, napowietrzony mieszaniną 95% O2 i 5% CO2, aby uzyskać pH 7,4.
  2. Przygotować ACSF do eksperymentów zawierający (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 oraz 20 glukozy, napowietrzony mieszaniną 95% O2 i 5% CO2, aby uzyskać pH 7,4.
  3. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy (ICS) zawierający (w mM): 150 KMeSO3, 12,5 kwasu hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowego (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, 1,25 kwasu etylenoglikolotetraoctowego (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP. Dostosować pH do 7,3. Alikwoty o objętości 1 ml przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Rozpuścić sól benzofuranizofatalanu wiążącego sód (SBFI) w wodzie dwukrotnie destylowanej i przygotować alikwoty po 5 µl roztworu zapasu o stężeniu 10 mM.
  5. Rozmrozić ICS i dodać roztwór zapasu SBFI do końcowego stężenia 1 mM. Wymieszać w wstrząsarze typu vortex i poddać mikrofiltracji (0,22 µm). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia w eksperymencie. Nie zamrażać ponownie i zużyć w ciągu jednego dnia.
  6. Przygotować roztwór zapasu glutaminianu MNI o stężeniu 50 mM, rozpuszczając związek w wodzie dwukrotnie destylowanej. Rozcieńczyć roztwór zapasu glutaminianu MNI do końcowego stężenia 5 mM w zwykłym ACSF. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia w eksperymencie. Nie zamrażać ponownie i zużyć w ciągu jednego dnia. Alikwoty, które nie zostaną użyte natychmiast w eksperymencie, przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Disekcja tkanki

UWAGA: Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa mózgu gryzoni zostało szczegółowo opisane wcześniej13,14. W skrócie, w niniejszym badaniu zastosowano następujący protokół.

  1. Po dekapitacji szybko wyjmij mózg z czaszki.
  2. Mózg natychmiast umieść w szalce Petriego z lodowatym roztworem ACSF do sekcji i wyodrębnij półkulę, wykonując cięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej.
  3. Wykonaj drugie cięcie w pożądanej orientacji, aby uzyskać powierzchnię blokującą, a następnie przymocuj fragment do stołu tnącego wibratomu za pomocą superglue.
  4. Wyjmij z zamrażarki komorę tnącą oraz element chłodzący wibratomu (oba przechowywane w temperaturze -20 °C) i umieść stół tnący z sekcją mózgu w komorze. Następnie włóż element chłodzący do komory i zanurz tkankę w lodowatym roztworze ACSF do sekcji. W celu stabilizacji preparatu można zablokować blok tkanki żelem agarem.
  5. Za pomocą wibratomu wykonaj parasagittalne skrawki hipokampa o grubości 250 µm. Upewnij się, że wszystkie płyny ACSF są stale napowietrzane.
  6. Po pocięciu utrzymuj tkankę na siatce w zlewce z normalnym roztworem ACSF i inkubuj w temperaturze 34 °C przez 30 min. Następnie przechowuj w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie sprzętu

Schemat układu mikroskopii laserowej do wzbudzenia optycznego i analizy spektralnej ze zintegrowanymi PMT.
Rycina 1. Schemat przedstawiający drogi światła i kontrolę eksperymentalną aparatury składającej się z obrazowania wielofotonowego, laserowej skaningowej fotolizy błyskowej w UV oraz elektrofizjologii. Wiązka wielofotonowa (czerwona) jest generowana przez impulsowy, strojony laser podczerwony (IR) (TiSa). Przechodzi ona przez migawkę mechaniczną, ogniwo Pockelsa oraz detektor IR (wykrywanie natężenia wiązki), co umożliwia kontrolę mocy lasera i czasu jego podawania. Opcjonalna dioda laserowa z możliwością przełączania (flip-in/flip-out) jest wykorzystywana do podstawowego wyrównania wiązki laserowej. Rozszerzacz wiązki może być stosowany w połączeniu z obiektywami o niezwykle szerokiej tylnej płaszczyźnie ogniskowej. Zdalnie sterowane koło filtrów ND może być używane dodatkowo lub zamiast ogniwa Pockelsa do kontroli mocy wiązki laserowej. Po przejściu przez głowicę skanującą, impulsowe światło IR jest kierowane do preparatu. Emitowane światło fluorescencyjne (jasnozielone) jest zbierane przez zewnętrzne lub wewnętrzne detektory fotopowielacze (PMT). Detektory zewnętrzne są w pełni zsynchronizowane z wewnętrznymi PMT za pomocą przełącznika wysokiej częstotliwości (kontroler PMT). Wiązka do uwalniania (jasnoniebieska) jest generowana przez stałociałości laser UV (laser DPSS UV). Jest ona następnie kierowana za pomocą światłowodu do jednostki skanującej sterowanej galwanometrycznie, znajdującej się w górnej tylnej części kondensora epifluorescencyjnego. Precyzyjne pozycjonowanie (aberracja chromatyczna między wiązką obrazującą a wiązką uwalniającą) punktu lub obszaru uwalniania jest możliwe dzięki eksportowi obrazu z oprogramowania do obrazowania. Zarządzanie czasem w celu synchronizacji obrazowania, elektrofizjologii i fotolizy błyskowej jest sterowane elektronicznie. Detektor do oświetlenia przechodzącego (TL-PMT) jest niezbędny do dokumentacji rozmieszczenia pipet w tkance. Jednostki sterujące i oprogramowanie systemu obrazowania, który został zmodyfikowany, służą do sterowania i synchronizacji wszystkich pozostałych urządzeń niezbędnych do pracy systemu. Komponenty systemu oznaczone jako „custom” zostały zaprojektowane i zbudowane/zaadaptowane przez autorów. Niektóre komponenty zostały dostosowane do wymagań niestandardowego systemu wielofotonowego i są oznaczone jako „modified”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Włącz komponenty systemu wielofotonowego. Przetestuj i wyreguluj wyrównanie wiązki lasera podczerwonego.
    1. Kontroluj pozycjonowanie wiązki, wprowadzając pryzmat centrujący zamiast obiektywu. Jeśli wiązka jest przesunięta, wyreguluj ją za pomocą luster w peryskopie. Należy pamiętać, że płaszczyzna centrująca pryzmatu musi znajdować się na tym samym poziomie co tylna płaszczyzna ogniskowa obiektywu podczas obrazowania.
    2. Włącz spektrometr i sprawdź charakterystyki wielofotonowe wiązki.
    3. Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania na następujące wartości: wybierz rozmiar ramki 512 x 512 pikseli dla obrazów ogólnych komórki (mniejsze pola wycięcia z powiększeniem 2,5 odpowiednio dla wysokiej częstotliwości klatek i wysokiej rozdzielczości przestrzennej). Ustaw prędkość obrazowania na tryb szybki (fast mode), a tryb skanowania na XYT. Krok w osi Z powinien wynosić 1 µm dla stosów ogólnych i 0,2 µm dla stosów szczegółowych, aby spełnić wymagania dotyczące próbkowania przestrzennego dla późniejszej dekonwolucji.
  2. Wyreguluj intensywność wiązki lasera wielofotonowego (790 nm), zmieniając ustawienia ogniwa Pockelsa (końcowa moc pod obiektywem: ≈ 14 - 16 µW) oraz fotopowielaczy (PMTs).
  3. Włącz i skalibruj system uwalniania (uncaging), umieszczając preparas fluorescencyjny pod soczewką obiektywu.
    1. Używając okularów, wyreguluj ostrość optyki UV i ogranicz przestrzennie plamkę lasera UV do średnicy maksymalnie 2 µm, korzystając z jednostki ogniskującej w głowicy skanującej UGA.
    2. Uruchom procedurę kalibracyjną oprogramowania sterującego jednostką uwalniania.
      1. Ustaw laser UV w kilku punktach w zakresie jego skanowania, podczas gdy fluorescencja jest rejestrowana kamerą CCD. Klikając w plamkę lasera UV w każdym punkcie, wyreguluj pozycjonowanie galwanicznych luster skanujących tak, aby odpowiadały one określonym współrzędnym w oprogramowaniu.

Schemat mikroskopii konfokalnej pokazujący wzbudzenie i emisję NIR, światłowód, lustra dichroiczne.
Rysunek 2. Szczegółowy schemat przedstawiający charakterystykęścieżek wiązki wzbudzania, emisji i fotouwalniania (uncaging). Wiązka wzbudzania IR (czerwona) przechodzi przez dichroiczne lustro łączące wiązki na poziomie wieżyczkowania filtrów w kondensorze epi-fluorescencyjnym mikroskopu oraz przez obiektyw, aby dotrzeć do preparatu. Wiązka fotouwalniająca (niebieska) jest dostarczana za pomocą kwarcowego światłowodu optycznego do jednostki kolimacji i ogniskowania wiązki, a następnie kierowana do luster skanujących w jednostce skanującej, przechodzi przez lustro dichroiczne do dichroicznego lustra łączącego wiązki. W tym miejscu zostaje ona połączona ze skanującą wiązką wzbudzania. Światło emitowane z preparatu podąża ścieżką skanującej wiązki wzbudzania w przeciwnym kierunku w stronę głowicy skanującej obrazu. Kamera służy do wizualnej kontroli pipety patch oraz do pozycjonowania wiązki fotouwalniającej w połączeniu z konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym (nie pokazano). Zielona ścieżka światła reprezentuje opcjonalne oświetlenie epi-fluorescencyjne, które może być przydatne w innych zastosowaniach.

      1. Użyj systemu fotolizy impulsowej w trybie punktowym, aby uzyskać precyzyjne aplikacje ogniskowe. Upewnij się, że regulacja ogniska wiązki uwalniającej (średnia moc pod obiektywem: 0.55 mW) pozwala uzyskać plamkę o średnicy 1.5 µm (rozmiar w osi xy), co należy zweryfikować na preparacie fluorescencyjnym umieszczonym na poziomie z odpowiadającym poziomowi skrawka tkanki (nie pokazano).
    2. Precyzyjne pozycjonowanie punktu uwalniania osiąga się poprzez import obrazu z systemu obrazowania za pomocą połączenia sieciowego między komputerem sterującym uwalnianiem a komputerem obrazującym.
      1. Używając oprogramowania do przechwytywania ekranu, stale odczytuj klatki z oprogramowania obrazującego (zamiast sygnału z kamery) i dostosuj ramy obrazowania oraz uwalniania w sposób spójny. Eksportuj co 10th klatkę z oprogramowania obrazującego jako obraz referencyjny do jednostki fotolizy, aby zapewnić prawidłową kalibrację przez cały czas trwania eksperymentu.

Interfejs oprogramowania do mikroskopii skaningowej laserowej do analizy obrazowania neuronalnego, schemat szlaków neuronowych.
Rycina 3. Dostosowanie punktu fotouwalniania: Aby precyzyjnie ustawić punkt fotouwalniania, zrzut ekranu z oprogramowania do obrazowania (żółta ramka) jest importowany do oprogramowania do fotouwalniania (zielona ramka). Obraz po lewej stronie w żółtej ramce przedstawia obraz zakodowany w systemie Hi-Lo (niebieski: piksele czarne, czerwony: piksele nasycone) całej komórki piramidalnej CA1. Na obraz nałożona jest siatka kalibracyjna oprogramowania do fotouwalniania (zielone „X”). Po prawej stronie pokazano powiększoną część komórki z naniesionym punktem fotouwalniania (czerwony krzyżyk). Żółta plama to automatycznie nałożony obraz wiązki fotouwalniającej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Włącz mikromanipulatory, komponenty do elektrofizjologii oraz urządzenie do aplikacji ciśnieniowej w celu dostarczenia związku klatkowego (caged compound) do docelowego regionu.
  2. Zainstaluj urządzenie do ogniskowej aplikacji ciśnieniowej do lokalnej perfuzji związków klatkowych. Pozwoli to na znaczne obniżenie kosztów w porównaniu do perfuzji kąpielowej tych substancji. Dostosuj ciśnienie utrzymujące do aktualnego ciśnienia atmosferycznego, aby zapobiec zasysaniu ACSF do pipety aplikacyjnej lub wyciekowi substancji klatkowych z pipety.
    UWAGA: Urządzenie do aplikacji ciśnieniowej posiada bardzo precyzyjny i ultraszybki mikrozawór w uchwycie pipety. Pozwala to na zastosowanie minimalnego ciśnienia aplikacji, co redukuje artefakty ruchowe do minimum podczas lokalnej perfuzji związkiem klatkowym.
  3. Wyciągnij pipety do techniki whole-cell patch-clamp oraz lokalnej perfuzji, używając kapilar z borokrzemowego szkła polerowanego ogniowo. Pipety powinny mieć średnicę końcówki ok. 1 µm i rezystancję R ≈ 3 MΩ (wartości określone przy użyciu ICS na bazie K-MeSO3).
  4. Umieść skibek w kąpieli eksperymentalnej i przymocuj go siatką (platynowa ramka o grubości 250 µM, rozpięta chirurgicznymi nićmi o średnicy 40 µm) (Rysunek 4A, B). Do przenoszenia skibka użyj odwróconej, z odłamaną końcówką i polerowanej ogniowo pipety Pasteura (gruszka ssąca po stronie odłamanej końcówki). Unikaj zginania i jakiejkolwiek innej gwałtownej manipulacji skibkiem.

Konfiguracja komory perfuzyjnej; metoda patch-pipet; pomiar elektrofizjologiczny; schemat; zastosowanie badawcze.
Rysunek 4. Elementy kąpieli eksperymentalnej i rozmieszczenie kąpieli na stole mikroskopu. (A) Kąpiel eksperymentalna składa się z samej komory kąpieli (niebieski kwadrat), która jest otoczona magnetycznym metalowym pierścieniem. Tubing zapewnia ciągłą perfuzję kąpieli roztworem soli (ACSF). Do komory kąpieli wkłada się siatkę służącą do przytrzymania i unieruchomienia skrawka. (B) Ostry skrawka tkanki umieszczony wewnątrz komory kąpieli. Skrawka jest unieruchomiony przez nici siatki. (C) Pozycjonowanie i geometria kąpieli eksperymentalnej na stole mikroskopu podczas przeprowadzania doświadczeń.

  1. Umieścić komorę na stole mikroskopu i rozpocząć stałą perfuzję skrawka roztworem ACSF.

4. Metoda patch-clamp w konfiguracji whole-cell

  1. Napełnić pipetę do patch-clampu roztworem ICS zawierającym SBFI, a pipetę do perfuzji lokalnej związkiem w klatce (caged compound). Przymocować pipety do odpowiednich mikromanipulatorów. Umieścić elektrodę odniesienia w kąpieli. Należy upewnić się, że jest się stale uziemionym, aby uniknąć uszkodzenia wzmacniacza głowicowego (por. Rycina 4C).
  2. Opuścić obie pipety do kąpieli i umieścić je nad obszarem CA1 hipokampa. Przyłożyć delikatne ciśnienie do pipety do patch-clampu (+40 mbar), aby zapobiec rozcieńczeniu ICS przez ACSF.
  3. Skompensować potencjał przesunięcia (offset potential) pipety do patch-clampu za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii.
  4. Zbliżyć pipetę do patch-clampu do komórki piramidalnej CA1, wykorzystując mikroskopię wideo IR-DIC. Stosować delikatne ssanie, aż do uzyskania giga-uszczelnienia (Giga-seal). Wybrać komórkę, której soma znajduje się 30–70 µm poniżej powierzchni skrawka, aby z jednej strony zapewnić nienaruszoną morfologię komórki, a z drugiej niskie rozproszenie i tłumienie wiązki odklatkowania (uncaging beam).
  5. Skompensować szybką pojemność. Przebić membranę i otworzyć komórkę, aby uzyskać konfigurację whole-cell.
  6. Skompensować wolną pojemność oraz rezystancję szeregową.
  7. Pozostawić komórkę do dializy z SBFI-ICS przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowania.

5. Obrazowanie i stymulacja wielofotonowa

Schemat osi czasu obrazowania wielofotonowego i elektrofizjologii; perfuzja lokalna, aplikacja związku.
Rycina 5. Protokół eksperymentalny. Aby zainicjować eksperyment, impuls wyzwalający (oznaczony czerwonym znakiem (ᴨ) i czerwoną linią) jest ustawiany tak, aby jednocześnie rozpocząć obrazowanie (niebieski), elektrofizjologię (zielony) oraz podawanie związku w klatce (żółty) w punkcie czasowym 0 sec. Podczas tego pierwszego okresu wiązka obrazująca powinna być całkowicie ściemniona (jasnoniebieski). Po 4,5 sec (linia przerywana) lokalna perfuzja związku w klatce zostaje zakończona, a wiązka obrazująca powinna zostać ustawiona na intensywność roboczą do akwizycji danych (niebieski). 1,5 sec później (punkt czasowy 6 sec) podawany jest drugi impuls wyzwalający (oznaczony czerwonym znakiem (ᴨ) i czerwoną linią), który inicjuje jednostkę błysku UV (czas trwania błysku: 300 msec; oznaczony żółtym błyskiem) i ustawia markery w protokole elektrofizjologicznym i obrazowaniu.

  1. Do ACSF należy dodać tetrodotoksynę (TTX, 500 nM), aby zapobiec aktywacji napięciowo zależnych kanałów sodowych i generowaniu potencjałów czynnościowych.
  2. Należy zwizualizować morfologię komórkową przy użyciu wzbudzenia wielofotonowego i wynikającej z tego fluorescencji SBFI, a następnie wybrać kolczastą dendrytę do eksperymentu. Należy powiększyć obraz, aby uzyskać wyższą rozdzielczość, i zaznaczyć obszar dendryty ramką wycinania.
  3. Standardową pipetę do patch-clampu należy napełnić 10 µl ACSF zawierającego klatkowany glutaminian. Pipetę należy podłączyć do systemu aplikacji ciśnieniowej i przymocować do mikromanipulatora.
  4. Pipetę z klatkowanym związkiem należy umieścić w pobliżu dendryty (~30 µm). Należy ustawić pipetę w taki sposób, aby umożliwić efektywną lokalną perfuzję wybranej dendryty. Następnie należy dostroić laser do uwalniania z klatki (uncaging): plamka uwalniania powinna znajdować się blisko (~1 - 2 µm) badanej struktury.
  5. Za pomocą oprogramowania do obrazowania należy wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) na wybranej dendrycie i sąsiadujących kolcach.
  6. Należy zbliżyć się do obszaru zainteresowania i punktowo wstrzyknąć klatkowany związek przez kilka sekund przy niskim ciśnieniu (<3 PSI). Za pomocą sygnału wyzwalającego należy rozpocząć rejestrację patch-clamp oraz fluorescencji (przy wielofotonowym wzbudzeniu 790 nm).
    UWAGA: Podczas lokalnej perfuzji klatkowanego związku wiązka wzbudzenia jest całkowicie wygaszona, aby zapobiec fotobieleniu.
  7. Należy przerwać lokalną perfuzję klatkowanego związku. Należy zwiększyć intensywność lasera dwufotonowego, aby umożliwić efektywne wzbudzenie SBFI, a następnie zastosować błysk UV w celu zainicjowania uwalniania z klatki (czas trwania uwalniania 300 msec).
  8. Należy monitorować zmiany fluorescencji SBFI. Rejestrację należy zakończyć po powrocie fluorescencji SBFI do poziomu bazowego.

6. Farmakologia

  1. Aby zbadać udział jonotropowych receptorów glutaminianu w generowaniu prądów i/lub sygnałów sodowych wywołanych fotolizą klatkowanego glutaminianu za pomocą błysku UV, należy zastosować blokery receptorów.
    1. Przełączyć na ACSF zawierający bloker receptora AMPA cyjano-nitrochinoksalinodion (CNQX, 10 µM) oraz bloker receptora NMDA aminofosfonopentanian (APV, 50 µM) oprócz TTX (patrz wyżej) i perfundować skrawek przez co najmniej 10 min.
    2. Powtórzyć procedurę stymulacji (patrz 5.4 i 5.5.).
  2. Odwracalność działania inhibitorów
    1. Przełączyć z powrotem na normalny ACSF zawierający tylko TTX.
    2. Perfundować skrawek przez 20 min.
    3. Powtórzyć procedurę stymulacji (patrz 5.4 i 5.5.).

7. Morfologia

  1. Nagrać stos XYZ dla obszaru ramki (clip box) wyznaczonego do przeprowadzonych pomiarów. Należy upewnić się, że stos ten posiada nadmiarową próbkowanie przestrzenną (co najmniej 0,2 µm na piksel), aby umożliwić optymalną dekonwolucję obrazu oraz zwiększyć jego jakość i rozdzielczość.
  2. Nagrać stos XYZ całej komórki w celu oceny morfologii komórki.
  3. Uruchomić algorytm dekonwolucji.

Wyniki

W niniejszym badaniu przedstawiamy procedurę wielofotonowej mikroskopii dynamiki sodu w komórkach z wykorzystaniem zależnego od sodu barwnika fluorescencyjnego SBFI w neuronach piramidalnych obszaru CA1 w ostrych skrawkach tkanki hipokampa myszy. Ponadto pokazujemy, jak połączyć tę technikę obrazowania z uwolnieniem związków neuroaktywnych za pomocą skanującego lasera (np. klatkowanego glutaminianu) oraz jego precyzyjnym nakierowaniem na mikrodomeny komórkowe.

Wprowadzenie SBFI do neuronów za pomocą pipety patch-clamp umożliwiło wizualizację całej komórki, w tym cienkich dendrytów i sąsiadujących kolców, dzięki zastosowaniu wzbudzenia wielofotonowego (Rycina 6A, B, D oraz Rycina 7A).

Analiza sygnałów neuronalnych; dynamika sodu; wykresy elektrofizjologiczne; stymulacja MNI-glutaminianem.
Rycina 6. Sygnały sodowe i prądy synaptyczne indukowane błyskawiczną fotolizą klatkowanego glutaminianu. (A) Obraz maksymalnej projekcji neuronu piramidowego obszaru CA1, do którego wprowadzono SBFI za pomocą pipety patch (PP). Ramka wskazuje obszar powiększony na B. LP oznacza pozycję i orientację pipety do lokalnej perfuzji klatkowanego glutaminianu. (B) Maksymalna projekcja o dużym powiększeniu stosu przekrojów optycznych dendrytu z przyległymi kolcami dendrytycznymi. Stosy przekrojów optycznych poddano wyrównaniu w osi z oraz dekonwolucji. Czerwony krzyżyk wskazuje docelowy obszar wiązki odklatkowującej. Pomarańczowa linia przerywana wyznacza obszar zainteresowania, z którego rejestrowano emisję fluorescencji. Ramka wskazuje obszar powiększony na D. (C) Lewo: Sygnał sodowy (górny rząd) i somatyczny prąd wewnątrzkomórkowy (dolny rząd) indukowane błyskawiczną fotolizą klatkowanego glutaminianu (oznaczoną żółtym błyskiem). Czerwona linia reprezentuje dopasowanie do danych eksperymentalnych. Szary obszar reprezentuje okres, w którym błysk odklatkowujący (300 msec) blokował obrazowanie fluorescencji SBFI. Prawo: Bez uprzedniej perfuzji klatkowanym glutaminianem ten sam błysk UV nie wywołał ani zmiany emisji SBFI, ani prądu wewnątrzkomórkowego. (D) Lewo: Obraz o dużym powiększeniu dendrytu i przyległych kolców, zgodnie z wyznaczeniem w B. Obok ten sam obraz z odwróconymi wartościami szarości. Linie przerywane wskazują obszary zainteresowania, w których rejestrowano emisję fluorescencji. Czerwony krzyżyk wskazuje lokalizację wiązki odklatkowującej. Prawo: Przejściowe zmiany poziomu sodu indukowane fotolizą klatkowanego glutaminianu błyskiem UV. Ślad niebieski: sygnały sodowe w dendrycie; ślad czerwony: uśredniona odpowiedź z trzech kolców sąsiadujących z miejscem odklatkowania; ślad zielony: uśredniona odpowiedź z trzech oddalonych kolców. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Po lokalnej perfuzji klatkowanym glutaminianem, zastosowanie błysku UV w pobliżu dendrytu spowodowało przejściowy spadek emisji fluorescencji SBFI, odzwierciedlający wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia sodu (Rysunek 6C, D i Rysunek 7B). Jednocześnie w somie zarejestrowano prąd wewnątrzpochodny (Rysunek 6C i Rysunek 7B). Wydłużenie czasu trwania błysku UV doprowadziło do wzrostu amplitud zarówno wywołanych prądów wewnątrzpochodnych, jak i sygnałów sodowych (dane nie pokazano), co wskazuje, że system znajdował się w pełni w zakresie swojej dynamiki i że ani proces uwalniania z klatki, ani odpowiedzi komórkowe nie uległy nasyceniu. Zastosowanie błysku UV o identycznym lub dłuższym czasie trwania w preparatach, które nie zostały uprzednio poddane perfuzji klatkowanym glutaminianem, nigdy nie wywołało zmian w fluorescencji SBFI ani prądów wewnątrzpochodnych, co wskazuje, że sygnały te wynikają z uwalniania glutaminianu z klatki (Rysunek 6C). Ponadto wyniki te pokazują, że w naszych warunkach eksperymentalnych nie obserwuje się współzależności między komponentami obrazowania a komponentami uwalniania z klatki. Sygnały sodowe można było wykryć również w kolcach dendrytycznych (Rysunek 6D). Chociaż nie podejmowaliśmy prób stymulacji pojedynczego kolca wyłącznie za pomocą uwalniania glutaminianu z klatki, amplitudy szczytowe miały tendencję do bycia nieco wyższymi w kolcach znajdujących się blisko miejsca uwalniania, podczas gdy kolce położone dalej wykazywały niemal identyczne zmiany fluorescencji jak dendryt macierzysty (Rysunek 6D).

Na koniec zbadaliśmy ścieżkę napływu sodu do dendrytów i kolców w odpowiedzi na odblokowanie glutaminianu. W tym celu zastosowaliśmy CNQX oraz APV, które są selektywnymi blokerami odpowiednio jonotropowych receptorów glutaminianu podtypów AMPA i NMDA, przepuszczalnych dla sodu. Nasze wyniki pokazują, że w obecności tych blokerów zniesiono indukowane glutaminianem wewnątrzkomórkowe sygnały sodowe oraz wywołane prądy somatyczne (Rysunek 7B). Po wypłukaniu blokerów sygnały zostały przywrócone. Dowodzi to, że odblokowanie glutaminianu aktywuje jonotropowe receptory glutaminianu w neuronach piramidowych CA1, które pośredniczą w napływie sodu do dendrytów i kolców, co skutkuje wewnątrzkomórkowymi przejściowymi wzrostami stężenia sodu i prądami wewnątrzkomórkowymi.

Schemat aktywności neuronu; sygnał sodowy, analiza prądu somatycznego; wyniki badań elektrofizjologicznych.
Rycina 7. Profil farmakologiczny wywołanych sygnałów sodowych i prądów wewnątrzkomórkowych. (A) Neuron piramidowy obszaru CA1 wypełniony SBFI z pipetą patch (PP) przytwierdzoną do somy. (B) Lewo: Przejściowy wzrost stężenia sodu i prąd somatyczny wywołane fotoaktywacją „zakratowanego” glutaminianu w dendrycie i przyległych kolcach. Środek: Perfuzja z zastosowaniem blokerów jonotropowych receptorów glutaminianu CNQX i APV hamuje zarówno sygnał sodowy, jak i prąd wewnątrzkomórkowy wywołany odblokowaniem glutaminianu. Prawo: Po wypłukaniu blokerów sygnały zostają przywrócone. Czerwona linia reprezentuje dopasowanie do danych eksperymentalnych. Szary obszar reprezentuje okres, w którym błysk odblokowujący (300 msec) zakłócał obrazowanie fluorescencji SBFI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Niniejsze badanie pokazuje, że SBFI dobrze nadaje się do dwufotonowego obrazowania wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych sodu w małych przedziałach komórkowych. Należy jednak pamiętać, że sprawność kwantowa SBFI jest raczejniska15 , a względne zmiany stężenia sodu są dość małe przy aktywności fizjologicznej. W związku z tym pomiar stanów nieustalonych Na+ w wysokiej rozdzielczości w precyzyjnych procesach jest stosunkowo żmudnym zadaniem, a grupowanie lub uśrednianie kilku prób może być konieczne w celu uzyskania zadowalających sygnałów. Ponadto kinetyka stanów przejściowych sodu jest zaskakująco powolna, co sprawia, że konieczne jest rejestrowanie przez dłuższy czas. Obserwacja ta koresponduje z obserwacją wcześniejszych badań, w których monowykładniczy rozpad przejściowych sodu w dendrytach neuronalnych i astrocytach charakteryzował się dużymi stałymi czasu rozpadu w zakresie 10 sekund w temperaturze pokojowej1,2,6. Wydaje się zatem, że stany przejściowe sodu mają znacznie wolniejszy przebieg w czasie i znacznie większe stałe czasu rozpadu w porównaniu z stanami przejściowymi wapnia16.

Pomijając te wady, obrazowanie sodu okazuje się cennym narzędziem do badania fizjologicznych właściwości subdomen neuronalnych. Na przykład obrazowanie sodu może służyć do monitorowania pobudzającej aktywności synaps w aktywnych synapsach lub w ich pobliżu. Ponieważ sód zasadniczo nie jest buforowany8,17, stany przejściowe sodu wywołane aktywnością są liniowo związane z szerokim zakresem uwalniania glutaminianu synaptycznego lub egzogennie stosowanego glutaminianu. Reprezentują one zatem bezpośrednie i bezstronne wskaźniki aktywności glutaminergicznej neuronów. Ponadto barwniki wskaźnikowe sodu wykazują wysoką zawartość Kd (Kd SBFI mieści się w zakresie 25 mM1). Nawet przy stosunkowo wysokich stężeniach barwnika wewnątrzkomórkowego stosowanych do osiągnięcia wystarczającej jasności (zwykle 0,5 - 1 mM), wysokie Kd oznaczają, że barwniki same w sobie nie działają jako dla sodu. W związku z tym nie zniekształcają one amplitudy ani przebiegu czasowego stanów przejściowych sodu, co zawsze stanowi problem, gdy do komórek wprowadzane są barwniki wrażliwe na wapń18. Można zatem założyć, że wykryte sygnały stanowią dobrą miarę "rzeczywistych" zmian w wewnątrzkomórkowym sodzie. Ich powolny bieg w czasie sugeruje zatem, że prędkość wewnątrzkomórkowej dyfuzji sodu w neuronach jest znacznie mniejsza niż wcześniej zakładano19.

Krytycznym wymogiem dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów dotyczących właściwości pobudzającej transmisji synaptycznej i szlaków napływu sodu do kolców i dendrytów jest indukcja szybkiej i wysoce zlokalizowanej aktywacji struktur postsynaptycznych. Można to uzyskać poprzez szybkie i miejscowe zastosowanie glutaminianu lub agonistów glutaminianu w bezpośrednim sąsiedztwie kręgosłupa lub dendrytu poprzez błyskawiczną fotolizę związków w klatkach. Fotoliza błyskowa nie uszkadza mechanicznie tkanki, jest wolna od artefaktów ruchowych i jest dobrze znana do badania powiązanych zagadnień (np . lokalnej sygnalizacji wapniowej). Średnica miejsca odtworzenia wynosiła 1,5 μm w płaszczyźnie xy. Rozpakowanie w klatkę w pobliżu kolczastego dendrytu wywołało sygnały sodowe w obu kolcach i dendrycie macierzystym. Podczas gdy sygnały były zwykle największe w kolcach znajdujących się najbliżej miejsca odklejenia, amplitudy w macierzystym dendrycie i kolcach dalej były nadal raczej podobne do tych w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca odklejenia. Odblokowanie przeprowadzono na 300 ms, podczas którego prądy wewnętrzne zwiększyły swoją amplitudę. Glutaminian bez klatki mógł dyfundować w tkance w tym samym czasie, aktywując jonotropowe receptory glutaminianu i napływ sodu na obszary dendrytyczne i kolce dalej od miejsca uwolnienia.

Nieodłącznym problemem, który pojawia się podczas stosowania lasera UV do fotolizy związków w klatkach podawanych za pośrednictwem roztworu do kąpieli komórek, jest "filtracja wewnętrzna". Ze względu na wysoki współczynnik absorpcji klatki, światło UV jest silnie tłumione na drodze od obiektywu do miejsca stymulacji20,21. Wykonalnym sposobem uniknięcia tego jest miejscowa perfuzja z klatką, która jest ograniczona tylko do miejsca stymulacji, co ponadto zmniejsza do minimum ilość potrzebnego związku w klatce. W porównaniu z odblokowywaniem za pośrednictwem skaningu laserowego UV, odblokowywanie dwufotonowe w bliskiej podczerwieni22 jest przestrzennie bardziej precyzyjne, głównie dlatego, że dokładność stymulacji jest zwiększona w osi z. Z drugiej strony, ze względu na mały przekrój poprzeczny powszechnie stosowanych klatek dla dłuższych fal, stosowanych w przypadku wzbudzenia dwufotonowego, potrzebne jest albo wysokie stężenie związku w klatce, albo bardzo wysokie, potencjalnie fototoksyczne natężenie światła. Ponadto dwufotonowe rozpakowanie wymaga znacznie większych inwestycji w sprzęt; Potrzebny jest m.in. dodatkowy laser na podczerwień oraz wymagane elementy optyczne.

Zarówno SBFI, jak i glutaminian MNI-są pobudliwe w identycznym zakresie długości fal. Może to prowadzić do niezamierzonej współzależności lasera do odkrzętowania UV i lasera obrazującego SBFI lub IR i glutaminianu MNI, co skutkuje wybielaniem SBFI przez błysk odblokowujący i/lub ciągłym odklejaniem glutaminianu przez wiązkę podczerwieni. Jednak, jak pokazano na rysunku 6C, ani sam błysk UV, ani obrazowanie wielofotonowe nie powodowały takich wzajemnych efektów w naszych warunkach eksperymentalnych.

Systemy błysków UV podobne do tego opisanego tutaj są rutynowo używane w wielu innych laboratoriach i mogą być stosunkowo łatwo włączone do dowolnego istniejącego mikroskopu do obrazowania wielofotonowego. Ma to tę zaletę, że wiązka laserowa do fotolizy może być dowolnie ustawiana w polu widzenia. Ponadto system umożliwia szybką i zautomatyzowaną zmianę położenia wiązki laserowej i objętości uwalniania odpowiednio w polu widzenia podczas eksperymentu. Nasza modyfikacja upraszcza i poprawia dokładne pozycjonowanie miejsca do odblokowania, dzięki czemu ramki oprogramowania do obrazowania mogą służyć do konsekwentnego dostosowywania ramek obrazowania i odcinania.

Podsumowując, obrazowanie całych komórek i wielofotonowe obrazowanie sodu w dendrytach i kolcach neuronów centralnych, w połączeniu ze zmodyfikowaną procedurą rozmieszczania glutaminianu w klatkach wywołanym światłem UV, umożliwia niezawodną i ogniskową aktywację receptorów glutaminianu w tkance. Może zatem służyć do analizy właściwości pobudzającego przekaźnictwa synaptycznego i postsynaptycznych sygnałów sodowych w neuronach w nienaruszonej tkance.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. Autorzy otrzymali wsparcie finansowe umożliwiające publikację w otwartym dostępie przez firmę Rapp Optoelectronic (Wedel, Niemcy), która produkuje instrument wykorzystany w artykule wideo. Firma nie była zaangażowana ani w eksperymenty, ani w przetwarzanie danych, ani w pisanie manuskryptów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant Niemieckiej Fundacji Naukowej (DFG, Ro2327/6-1) dla C.R.R. Autorzy pragną podziękować S. Durry'emu i C. Roderigo za fachową pomoc techniczną oraz M. Dübbertowi (Laboratorium Elektroniki, Instytut Zoologiczny, Uniwersytet w Kolonii, Niemcy) za pomoc we wdrożeniu sterownika ogniw Pockelsa i przełącznika HF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoHilgenberg140505975 x 2 mm, grubość ścianki 0,3 mm
KameraJenoptikProgRes MFIR-DIC Oprogramowanie do
dekonwolucjiSVIHuygens Pofessional X11
Spektrometr światłowodowyOcean OpticsUSB 4000Miniaturowy spektrometr światłowodowy
Rurki filtracyjneVWR0,2 i mikro;
m Oprogramowanie do obrazowaniaOlympus EuropeFlowview Ver 5.0c,
Niestandardowakontrola intensywności wiązki laserowej + szybkie przełączanie na zero po flyback za pomocą lasera IR Pockels cell
SpectraPhysicsMai-Taifs-pulsed Ti:Sa przestrajalny laser (710 - 990 nm); UWAGA
Monitor mocy podczerwieniNiestandardowy
mikromanipulatorBurleighPCS 5000
Mikroskop/system obrazowaniaOlympus EuropeBX51WI/FV300Zarówno mikroskop, jak i systemy obrazowania zostały silnie zmodyfikowane
Koło filtra NDNewport50Q04AV.2Krzemionka topiona UV, gęstość optyczna 0,05 - 2,0
ObiektywNikon Instruments EuropeNIR Apo 60x/1.0w
Wzmacniacz z zaciskiem krosowymHEKAEPC-10
Ściągacz do pipetNarishigeModel PP-830
Pneumatyczny system wyrzucania lekówNPI Elektronicznakomórka PDES-DXH
PockelsConoptics350-80 LA-BKEOM, używana jako szybki przełącznik i do regulacji mocy
Ogniwo Pockels sterownikConopticsM302-RMWysokonapięciowy wzmacniacz różnicowy
MigawkaVincent AssociatesLS6ZM2Ostrza BeCu z powłoką ALMgF2
Kontroler migawki Sterownik migawkiNiestandardowa konstrukcja
Sterownik migawkiVincent AssociatesUniblitz VCM D1
Slicer/VibratomeThermo ScientificMicrom HM 650 V
Oprogramowanie do odblokowywaniaRapp OptoElectronicUGA40 1.1.2.6 + NetCam
Laser UVRapp OptoElectronicDL-355/10cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; UWAGA
System skanowania laserowego UVRapp OptoElectronicUGA 40System skanowania galwanometrycznego
Nazwa związkuFirmaNumer katalogowyKomentarze/
Opis
CNQXAntagonista receptora Sigma AldrichC-127AMPA; UWAGA
DL-AP5Alfa AesarJ64210Antagonista receptora NMDA; UWAGA
SBFI K+ sólTeflabsOO32
TTXAscent ScientificAsc-055Inhibitor kanałów Na+ zależnych od napięcia; UWAGA
L-glutaminian Nmi-Clatek,Torcis1490Glutamian w klatce uwalniany po absobcji UV
Filtr centralny , kontroler mocy wiązki IR Tiempo

Bibliografia

  1. Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons. Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).
  2. Rose, C. R., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites. J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).
  3. Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).
  4. Lamy, C., Chatton, J. Y. Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes. NeuroImage. 58, 572-578 (2011).
  5. Lasser-Ross, N., Ross, W. Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells. Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).
  6. Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission. Glia. 56, 1138-1149 (2008).
  7. Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).
  8. Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma. Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).
  9. Denk, W., Piston, D., Webb, W. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).
  10. Jaffe, D., et al. The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
  11. Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons. J. Vis. Exp. , (2011).
  12. Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation. J. Vis. Exp. , (2011).
  13. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid. J. Vis. Exp. , (2011).
  14. Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices. J. Vis. Exp. , (2012).
  15. Minta, A., Tsien, R. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).
  16. Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation. Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).
  17. Despa, S., Bers, D. M. Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering. Biophys. 84, 4157-4166 (2003).
  18. Regehr, W., Tank, D. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).
  19. Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. Ionic mobility in muscle cells. Science. 166, 1297-1298 (1969).
  20. Palma-Cerda, F., et al. New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups. Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).
  21. Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).
  22. Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie wielofotonoweuwalnianie z klatek UVuwalnianie glutaminianu z klatekpatch clamp ca ej kom rkifluorescencja SBFIprzygotowanie skrawk w hipokampajonotropowe receptory glutaminianuobrazowanie kolc w dendrytycznych
Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.