Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Summary

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Abstract

Naprawa i regeneracja mięśni szkieletowych wymaga działania komórek satelitarnych, które są rezydującymi komórkami macierzystymi mięśni. Można je wyizolować z próbek biopsji mięśni ludzkich za pomocą trawienia enzymatycznego, a ich właściwości miogenne badano w hodowli. Ilościowo, dwa główne typy komórek adhezyjnych uzyskane z trawienia enzymatycznego to: (i) komórki satelitarne (zwane komórkami miogennymi lub komórkami prekursorowymi mięśni), zidentyfikowane początkowo jako CD56 ⁺, a później jako komórki CD56 ⁺ / desmina ⁺ oraz (ii) fibroblasty pochodzące z mięśni, zidentyfikowane jako CD56^- i TE-7 ⁺. Fibroblasty namnażają się bardzo wydajnie w hodowli, a w mieszanych populacjach komórek komórki te mogą przełamywać komórki miogenne, aby zdominować hodowlę. Izolacja i oczyszczanie różnych typów komórek z ludzkich mięśni jest zatem ważnym czynnikiem metodologicznym przy próbie zbadania wrodzonego zachowania każdego typu komórki w hodowli. Tutaj opisujemy system sortowania oparty na delikatnym trawieniu enzymatycznym komórek za pomocą kolagenazy i dyspazy, a następnie sortowaniu komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), co daje zarówno wysoką czystość (>95% komórek miogennych), jak i dobrą wydajność (~2,8 x 10⁶ ± 8,87 x 10⁵ komórek/g tkanki po 7 dniach in vitro) do eksperymentów w hodowli. Podejście to opiera się na inkubacji mieszanej populacji komórek pochodzących z mięśni za pomocą mikrokulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem przeciwko CD56, a następnie przepuszczaniu komórek przez pole magnetyczne. Komórki CD56 ⁺ związane z mikrokulkami są zatrzymywane przez pole, podczas gdy komórki CD56 ^przechodzą bez przeszkód przez kolumnę. Zawiesiny komórek z dowolnego etapu procesu sortowania mogą być powlekane i hodowane. Po danej interwencji morfologię komórki oraz ekspresję i lokalizację białek, w tym jądrowych czynników transkrypcyjnych, można określić ilościowo za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego za pomocą specyficznych przeciwciał oraz pakietu do przetwarzania i analizy obrazu.

Introduction

Naprawa i regeneracja mięśni szkieletowych wymaga działania komórek satelitarnych¹, miogennych komórek macierzystych^2,3. In vivo komórki te istnieją w odwracalnym stanie spoczynku zlokalizowanym między sarkolemmą a blaszką podstawną każdego włókna mięśniowego, ale stają się aktywowane do proliferacji, łączenia i różnicowania w miarę uszkodzenia, naprawy i regeneracji tkanki mięśniowej³. Komórki satelitarne można wyizolować z próbek biopsji mięśni ludzkich u młodych i starszych osób za pomocą trawienia enzymatycznego⁴, a następnie badać ich właściwości miogenne w hodowli pierwotnej⁵. Skuteczność tego procesu izolacji zarówno w odniesieniu do wydajności, jak i czystości populacji komórek zależy od zastosowanych metod i może się różnić w zależności od próbki. Dwa główne typy komórek adherentnych uzyskane z trawienia enzymatycznego to komórki satelitarne (obecnie nazywane komórkami miogennymi lub komórkami prekursorowymi mięśni), zidentyfikowane początkowo jako komórki CD56 ⁺ / desmina oraz fibroblasty pochodzące z mięśni, zidentyfikowane jako komórki CD56 ⁱ TE7 ^{+ 5}. Fibroblasty mają szybkie tempo proliferacji i nie ulegają nieodwracalnemu zatrzymaniu wzrostu i końcowemu różnicowaniu w kontakcie komórka-komórka, jak komórki miogenne; Tak więc w populacjach mieszanych fibroblasty mogą przejechać komórki miogenne, aby zdominować hodowlę.

Fibroblasty były często postrzegane jako podrażnienie dla biologów mięśniowych, jednak obecnie rośnie zainteresowanie fibroblastami jako komórkami wartymi zbadania samo w sobie, szczególnie że wykazano, że odgrywają one rolę współpracy z komórkami miogennymi podczas naprawy mięśni⁶. Izolacja i oczyszczanie różnych typów komórek z ludzkich mięśni jest zatem ważnym czynnikiem metodologicznym przy próbie zbadania wrodzonego zachowania obu typów komórek w hodowli. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to metoda, za pomocą której komórki mogą być sortowane do dalszych badań i/lub liczone i analizowane. Wykazano, że FACS niezawodnie wzbogaca ludzkie komórki miogenne, ale wydajność komórek do późniejszej hodowli nie była do tej pory wysoka⁷. Biorąc pod uwagę ograniczony potencjał replikacyjny komórek somatycznych, takich jak komórki miogenne pochodzące z komórek satelitarnych, oraz bardzo słabą proliferację i różnicowanie związane ze starzeniem^{się 4}, wymagane są łagodniejsze podejścia. Hodowle pojedynczych włókien mięśniowych oferują inny, mniej agresywny sposób pozyskiwania mysich komórek satelitarnych, które nadal znajdują się w swojej niszy sublaminalnej i po ich aktywacji w hodowli^8,9. Jednak często nie jest to możliwe z materiału do biopsji mięśni ludzkich (ponieważ włókna rzadko można uzyskać od ścięgna do ścięgna), co oznacza, że technika ta może nie być dostępna dla wielu laboratoriów badawczych zainteresowanych badaniem komórek pochodzących z ludzkich mięśni. Co więcej, technika pojedynczego włókna zapewnia tylko bardzo ograniczoną liczbę komórek.

Tutaj opisujemy system sortowania oparty na delikatnym trawieniu enzymatycznym komórek za pomocą kolagenazy i dyspazy, po którym następują dwie kolejne rundy magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (MACS), co daje zarówno wysoką czystość (>95% komórek miogennych), jak i wydajność (~2,8 x 10>⁶ ± 8,87 x 10⁵ komórek/g tkanki) do eksperymentów w hodowli. CD56 jest uważany za złoty standard markera powierzchniowego do identyfikacji ludzkich komórek satelitarnych in situ¹⁰ i in vitro¹¹ i stanowi idealnego kandydata na marker powierzchniowy do mocowania kulek. W tym podejściu przeciwciała CD56 sprzężone z tlenkiem żelaza i kulkami superparamagnetycznymi zawierającymi polisacharydy są wiązane z komórkami i przechodzą przez kolumnę do separacji komórek magnetycznych o wysokim gradiencie, umieszczoną w silnym polu magnetycznym^12,13. Kolumny separacyjne wypełnione są matrycą z ferromagnetycznej wełny stalowej lub kulek żelaznych, które służą do skupiania linii pola magnetycznego w kierunku ich powierzchni, generując silne gradienty pola magnetycznego (~4tesla)¹⁴. W kolumnach tych nawet lekko magnetyczne komórki są przyciągane i adsorbowane do ich powierzchni¹⁴. Komórki niezwiązane (CD56^\u2012) przechodzą przez kolumnę, natomiast komórki CD56⁺ znakowane mikrokulkami magnetycznymi są zatrzymywane do momentu usunięcia z pola magnetycznego^12,15.

Zawiesiny komórek z dowolnego etapu procesu sortowania mogą być powlekane z pożądaną gęstością do dalszych eksperymentów. Po danej interwencji składniki komórkowe można zidentyfikować za pomocą immunocytochemii, zobrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej lub konfokalnej i przeanalizować ilościowo przy użyciu podejścia do analizy obrazu, które umożliwia szybki obiektywny pomiar wszystkich znakowanych komórek na dowolnym obrazie. W naszym laboratorium zastosowaliśmy to podwójne sortowanie immunomagnetyczne, a następnie analizę obrazu¹⁶, aby wykazać, że CD56 ^– ludzkie fibroblasty łatwo różnicują się w adipocyty, podczas gdy komórki miogenne pochodzenia satelitarnego są wysoce odporne na tę konwersję adipogenną⁵.

Protocol

UWAGA: W przypadku badań przeprowadzonych w naszym laboratorium wszyscy badani wyrazili pisemną, świadomą zgodę na uczestnictwo, a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu Etyki Narodowej Służby Zdrowia Wielkiej Brytanii (Londyński Komitet Etyki Badań; nr referencyjny: 10/H0718/10) oraz zgodnie z Ustawą o Tkankach Ludzkich i Deklaracją Helsińską.

1. Wstępne przygotowanie przed biopsją mięśni (15 min)

1. Zrób pożywkę do wzrostu ludzkich mięśni szkieletowych. Do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z podziałką dodać 2,5 ml mieszanki suplementów, 10 ml płodowej surowicy cielęcej, antybiotyki (penicylina/streptomycyna) i glutamina do właściwych stężeń końcowych (Tabela 1), a następnie napełnić probówkę do 50 ml podłożem podstawowym dla mięśni szkieletowych.
2. Umieścić 15 ml podłoża podstawowego dla mięśni szkieletowych w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 20 ml i zważyć. Po zważeniu umieść tę probówkę na lodzie. Użyj tego, aby otrzymać próbkę mięśni ludzkich.
3. W innej probówce o pojemności 20 ml przygotować 10 ml roztworu enzymu kolagenazy D i dypazy II do końcowego stężenia 2 mg/ml każdy, rozpuszczając podstawowe porcje tych enzymów w podłożu podstawowym mięśni szkieletowych. Przefiltruj i wysterylizuj ten roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm. Umieścić tę sterylną mieszaninę enzymów w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na 15 minut, aby się rozgrzała.
   UWAGA: Ta mieszanina enzymów jest nieco łagodniejsza niż trypsyna i lepiej utrzymuje żywotność komórek¹⁷.
4. Odłóż na bok szalkę Petriego i parę sterylnych skalpeli.

2. Procedura biopsji mięśni (45 min-1 godz.)

1. Przed rekrutacją uczestników należy uzyskać pełne poświadczenie etyczne i zgodę proceduralną (w tym odpowiednie szczepienia dla eksperymentatorów) od wszystkich odpowiednich organów zarządzających, komitetów i świadczeniodawców opieki zdrowotnej (np. etycznych, instytucjonalnych, rządowych itp.).
2. Stwórz sterylne pole wokół nogi (np. za pomocą sterylnych prześcieradeł chirurgicznych) i dokładnie oczyść obszar wokół miejsca biopsji antyseptycznym środkiem przeciwbakteryjnym (chlorheksydyna).
3. Znieczulenie proponowanego miejsca biopsji na nodze ochotnika poprzez miejscowe wstrzyknięcie 2% lidokainy w obszar podskórny pokrywający powięź mięśnia obszernego bocznego.
4. Wykonać nacięcie o szerokości ~5 mm za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego przez skórę i powięź i wykonać procedurę biopsji igłowej^{Bergströma 18} z dodatkowym odsysaniem.
5. Za pomocą sterylnych kleszczy usuń mięsień ze światła igły i zanurz w podstawowym podłożu na lodzie. Należy jak najszybciej przetransportować tkankę do laboratorium w celu dalszego przetwarzania, chociaż żywotne komórki miogenne można uzyskać po upływie 24 godzin lub dłużej.
6. Przeprowadź rozmowę z pacjentem, oczyść i uszczelnij miejsce nacięcia wieloma sterylnymi samoprzylepnymi paskami zamykającymi skórę i aseptycznie ubierz się w zewnętrzne wodoodporne pokrycie.

3. Izolowanie komórek prekursorowych pochodzących z mięśni (1 godz., 30 min)

1. Wyjmij probówkę zawierającą próbkę mięśni i zważ ją (upewnij się, że probówka jest sucha, wycierając ją chusteczką). Obliczyć masę próbki mięśniowej, odejmując masę probówki zawierającej pożywkę i próbki od samej probówki zawierającej pożywkę.
2. Zamieszaj roztwór kilka razy, aby umyć próbkę krwi z mięśni. Pozwól mięśniom osiąść w temperaturze pokojowej przez 30-60 sekund.
   1. Usunąć prawie całą objętość pożywki z probówki, najpierw za pomocą elektronicznego przyrządu pipetującego lub aspiratora, ale pozostawić około 2-3 ml w probówce.
   2. Umieścić probówkę na sterylnej szalce Petriego, pozwalając pozostałemu płynowi przenieść próbkę mięśni na szalkę; użyć sterylnego skalpela, aby usunąć pozostałe fragmenty mięśni. Obróć naczynie, aby zmobilizować pozostały płyn i usuń go pipetą. Usuń wszelkie widoczne kawałki tłuszczu lub tkanki łącznej.
3. W przypadku biopsji o masie 100-400 mg należy dodać 3 ml ciepłego roztworu enzymatycznego i za pomocą sterylnych skalpeli pociąć próbkę mięśni na bardzo małe kawałki (<1-2 mm³).
4. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml o szerokim otworze pobrać fragmenty mięśni i roztwór enzymu, a następnie przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 10 ml. Umyć szalkę Petriego kolejnymi 3-5 ml roztworu kolagenazy i enzymu dyspazy, a następnie za pomocą mniejszej pipety o pojemności 10 ml zebrać pozostałe fragmenty mięśni i umieścić w probówce. Dokładna głośność nie jest krytyczna.
5. Umieścić fiolkę w inkubatorze (lub łaźni wodnej) o temperaturze 37 °C na 60 minut z rozcieraniem (pipeta 10 ml) co 15 minut.
6. Po upływie 1 godziny zakończ dysocjację enzymatyczną poprzez dodanie równoważnej objętości świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i przepuść zawiesinę komórkową przez filtr 100 μm w celu usunięcia wszelkich dużych resztek włókien mięśniowych. Odwirować przefiltrowany roztwór komórkowy o sile 657 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej (20-25 °C).
7. Zawiesić osad komórkowy w 5-7 ml pożywki wzrostowej i rozmieścić go w niepowlekanej kolbie do hodowli tkankowych T-25. Przenieść tę płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 7 dni. Zmieniaj podłoże co 48 godzin. Na tym etapie komórki miogenne są bardzo małe i zaokrąglone i trudne do odróżnienia od komórek niemiogennych.
   1. Przy pierwszej zmianie pożywki odwirować supernatant w celu osadzenia wszelkich nieprzylegających komórek. Zawieś je ponownie na świeżym podłożu i ponownie talerzuj.
8. Po 7 dniach w hodowli upewnij się, że większość komórek miogennych (i fibroblastów) przyczepiła się, ale komórki nie osiągnęły jeszcze zbieżności. Oczyść prekursory miogenne i wykonaj MACS zgodnie z protokołem pierwotnie opracowanym przez laboratoria Gherardi i Chazaud^19,20 i dalej zmodyfikowanym przez nas⁵.

4. Immunomagnetyczne sortowanie komórek na podstawie ekspresji CD56 (1,5 godziny)

1. Po 7 dniach przepłucz monowarstwę komórek (która zwykle zawiera 50-60% komórek miogennych⁵) trzema wymianami roztworu buforu fosforanowego (PBS) w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałe nieprzylegające komórki i zanieczyszczenia z izolacji.
   1. Trypinizuj komórki (0,04% trypsyny w PBS wolnym od Ca²⁺ z 0,73 mM EDTA) przez 3 minuty. Po odłączeniu komórek dodaj 5-10 ml pożywki do wzrostu mięśni szkieletowych, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Granulować komórki przez odwirowanie przy 657 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej (20-25 °C) i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości kompletnej pożywki do liczenia.
   2. Policzyć małą próbkę zawiesiny komórek przy użyciu żądanej metody (np. przy użyciu hemocytometru lub automatycznego urządzenia zliczającego) i obliczyć początkową liczbę komórek i żywotność.
2. Umieść kilka dołków w 96-dołkowej płytce (lub większym naczyniu, jeśli jest to wymagane) w celu immunocytochemicznej lub opartej na cytometrii przepływowej charakterystyki populacji przed sortowaniem (fibroblasty i komórki miogenne będą najliczniejszymi obecnymi typami komórek).
3. Do zawiesiny komórkowej dodać 15 ml jałowego PBS do rozcieńczonych komórek i pożywki. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić je w 170 μl bufora sortującego o temperaturze pokojowej (1% BSA w roztworze płuczącym MACS, sterylizowanym przez przepuszczenie przez filtr 0,22 μm).
   1. Dodać 35 μl dobrze wymieszanych mikrokulek magnetycznych sprzężonych z pierwszorzędowym przeciwciałem CD56 (klon AF12-7H3, 130-050-401) do roztworu komórkowego, pipetować do wymieszania i pozostawić do inkubacji na 15 minut w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem w połowie drogi.
4. Po inkubacji rozcieńczyć roztwór komórek i kulek 10 ml buforu sortującego MACS i odwirować przy 657 x g przez 6 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu sortującego.
5. Dodaj separator MAC (magnes) do stojaka podtrzymującego MACS. Zachowaj ostrożność podczas dodawania magnesu do stojaka ze względu na silne pole magnetyczne. Umieścić szczelinę w kolumnie i zamontować filtr wstępnej separacji. Odpipetować 1 ml buforu sortującego przez filtr wstępnego rozdzielania i kolumnę do smarowania.
6. Natychmiast po tym delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i wlać cały 1 ml przez filtr do wstępnej separacji do kolumny.
7. Przemyć kolumnę trzykrotnie 1 ml (lub 500 μl) buforu sortującego. Zebrać niezatrzymane komórki, które przechodzą przez kolumnę pierwszego sortowania, w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej niewielką ilość pożywki wzrostowej. Komórki te są pierwszym rodzajem CD56^– frakcja i będą wysoce wzbogacone o fibroblasty tkanki łącznej. Nie pozwól, aby kolumna wyschła między praniami.
8. Po umyciu należy wyjąć filtr wstępnego rozdzielania i dodać 2,5 ml buforu MACS do kolumny. Następnie natychmiast wyjmij kolumnę z magnesu i zbierz pierwszą frakcję CD56⁺ do osobnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, wciskając tłok w górną część kolumny.
   UWAGA: Tłok bardzo ciasno przylega do górnej części kolumny i może być dość trudny w obsłudze; Należy to jednak zrobić, gdy kolumna jest nadal pełna bufora, więc wymagana jest szybkość. Należy unikać zbyt mocnego i szybkiego wciskania tłoka.
9. Przed posiewem należy ocenić żywotność komórek, na przykład za pomocą testu błękitu trypanowego. Określ procent żywotnych komórek z pól zliczających 8 x 1 mm² (obie komory hemocytometru).
   UWAGA: Komórki mogą być sortowane pojedynczo lub podwójnie, w zależności od wymaganej czystości. Jeśli zostanie to zrobione ostrożnie, komórki te bardzo dobrze tolerują procedurę podwójnego sortowania, a żywotność jest bardzo wysoka >95%. W celu podwójnego sortowania należy ustawić kolejną kolumnę, nasmarować 1 ml buforu do sortowania i przejść od kroku 4.6.
   1. Jeśli ma być wykonane obrazowanie, umieść komórki bezpośrednio na szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w 24 dołkach²¹ i pokrytych wybraną cząsteczką ECM do przyłączenia komórek (np. kolagenem lub lamininą). Tutaj użyj 0,1-0,5 mg/ml kolagenu-I (Tabela 3).

5. Sortowanie fibroblastów pochodzących z ludzkich mięśni natychmiast po izolacji.

1. Aby oczyścić progenitory fibroblastów natychmiast po izolacji, należy zastosować powyższy protokół z następującymi modyfikacjami:
   1. Natychmiast po izolacji ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce i przefiltrować raz przez sitko o średnicy 100 μm, a następnie ponownie przez sitko o średnicy 40 μm. Dodać 5 ml PBS i wirować w 657 x g przez 6 minut.
   2. Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym MACS i inkubować w mikrogranulkach anty-ludzkich fibroblastów przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Użyj kolumny LS i separatora Midi-MACS (Tabela 3) i zainstaluj filtr wstępnej separacji 40 μm.
   4. Wykonaj jeden lub dwa sortowania w zależności od wymaganej czystości, przenieś komórki tak szybko, jak to możliwe, do podłoża zawierającego surowicę, wykonaj liczenie i pozostaw płytki z pożądaną gęstością

6. Barwienie immunocytochemiczne (1 dzień i noc).

1. Utrwalić komórki w ich studzienkach przez dodanie równej objętości 8% paraformaldehydu w lodowatym PBS przez 10 minut z delikatnym mieszaniem. Po 10 minutach odessać utrwalacz i przemyć dwukrotnie PBS.
2. Aby immunowybarwić antygeny powierzchniowe komórek, należy zablokować komórki na co najmniej 1 godzinę w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, a następnie sondować odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (Tabela 4).
   1. W przypadku antygenów wewnątrzkomórkowych przeniknij komórki po utrwaleniu przez dodanie 0,2% Triton-X 100 w PBS z 1% BSA i NaN₃ (0,01%) przez 10 minut, a następnie zablokuj i inkubuj z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Wszystkie inkubacje przeciwciał pierwotnych należy przeprowadzić przez noc w temperaturze pokojowej (lub w temperaturze 4 °C), delikatnie mieszając na platformie kołyszącej.
3. Usuń niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj komórki trzykrotnie zimnym PBS. Inkubować przez 1 godzinę inkubacji ze specyficznymi dla gatunku fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi (Tabela 4) w temperaturze pokojowej.
4. Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych przepłukać komórki trzema wymianami PBS, a następnie wybarwić przeciwbarwić roztworem fluorescencyjnego barwnika DNA Hoechst 33342 (1 μg/ml) przez 10 minut na platformie kołyszącej.
5. W celu jednoczesnej wizualizacji zarówno antygenów powierzchniowych komórek, jak i antygenów wewnątrzkomórkowych, należy najpierw zbadać komórki za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko antygenom powierzchniowym komórki, a następnie ich odpowiednich przeciwciał drugorzędowych. Następnie ponownie utrwal komórki w zimnym PFA, przeniknij, zablokuj i inkubuj z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko antygenom cytoplazmatycznym lub jądrowym, a następnie ich odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi.
6. Po zabarwieniu usuń szkiełka nakrywkowe z dołków za pomocą zakrzywionych kleszczy i spłucz tylną część szkiełka nakrywkowego wodą destylowaną. Połóż szkiełko nakrywkowe na kropli podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu²² ustawionego na szklanym szkiełku mikroskopowym.

7. Barwienie czerwienią olejową O w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym komórek (2 godz.)

1. Ujawnić zawartość lipidów w komórkach posianych w 24 dołkach przez barwienie czerwienią olejową O (1-([4-(Ksyliloazo)ksylylo]azo)-2-naftol)^5,23. Najpierw przygotuj roztwór podstawowy 0,5% (w/v) Oil Red O, rozpuszczając 500 mg Oil Red O w 60 ml 99% fosforanu trietylu i 40 ml wody destylowanej. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności do momentu użycia.
2. W dniu użycia przygotować 36% (w/v) roztwór roboczy fosforanu trietylu, zawierający 12 ml roztworu podstawowego czerwieni olejowej O i 8 ml wody destylowanej. Przefiltruj ten roztwór przez bibułę filtracyjną nr 42, aby usunąć całą skrystalizowaną czerwień olejową O (która pogarsza jakość obrazu).
3. Roztwór roboczy należy delikatnie ogrzać w łaźni wodnej przez 1 godzinę, po czym roztwór wiruje się o masie 1 200 x g przez 6 minut. Usunąć supernatant i ponownie przefiltrować przez bibułę filtracyjną (numer 42) i przenieść do świeżej probówki o pojemności 20 ml.
4. Po utrwaleniu, przeniknięciu i wybarwieniu immunologicznym komórek, należy usunąć PBS i dodać 500 μl roztworu O/trietylofosforanu Oil Red do studzienek na 60 minut. Triton-X w stężeniu stosowanym tutaj do przepuszczalności błony komórkowej nie wpływa na zawartość lipidów komórkowych²³,
   UWAGA: Czerwień olejowa O jest wzbudzana przez długości fal od 540 do 580 nm, a zatem filtr Texas-Red może być używany do wykrywania emisji czerwieni olejowej O w mikroskopii fluorescencyjnej²³. Należy zauważyć, że emisja fluorescencji z czerwonego oleju O może czasami przeciekać do kanału dalekiej czerwieni, jeśli komórki są bardzo silnie wybarwione (tj. bardzo wysoka zawartość tłuszczu).
5. Po inkubacji usunąć nadmiar czerwieni olejowej O i przepłukać komórki pięciokrotnie 500 μl PBS. Zamontować szkiełka nakrywkowe jak w przypadku barwienia immunologicznego, jak opisano w punkcie 6. Wykrywanie barwnika O w kolorze czerwieni olejowej zarówno za pomocą mikroskopii jasnego pola/kontrastu fazowego, jak i mikroskopii epifluorescencyjnej przy użyciu filtra Texas Red (shift free, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630/75, Carl Zeiss).

8. Uzyskiwanie mikrofotografii z mikroskopii fluorescencyjnej do późniejszej analizy

UWAGA: Upewnij się, że preparaty do ilościowego porównania są barwione tymi samymi roztworami, fotografowane w identycznych warunkach (np. ekspozycja, ustawienia kamery i akwizycji itp.) i rejestrowane podczas tej samej sesji mikroskopowej. Całe formatowanie po akwizycji powinno być również identyczne i ściśle zgodne z sugerowanymi wytycznymi dotyczącymi obrazów cyfrowych²⁴.

1. W celu uzyskania obrazu (mikroskopia szerokokątna) włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła i pozostaw na zalecany czas, aby fluorescencyjne źródło światła rozgrzało się i ustabilizowało.
2. Ustaw ciemny prąd dla kamery, blokując drogę światła do kamery; uzyskaj obraz w maksymalnej rozdzielczości i wykorzystaj go do skorygowania później uzyskanych obrazów.
3. Oświetlić sondy immunofluorescencyjne za pomocą epifluorescencji dostarczanej przez ciekłe światłowody (elastyczna rurka z fluoroplastu wypełniona olejem fenylometylossilikonowym) i sygnałów wizualizowanych przez filtry pasmowe czerwone (zestaw filtrów 45 HQ Texas red shift free), zielone (zestaw filtrów 44 FITC special shift free) i niebieskie (zestaw filtrów 49 DAPI shift free) filtry pasmowe na odwróconym mikroskopie epi-fluorescencyjnym (10X, 20X, 40X, planarno-apochromatyczne obiektywy o aperturach numerycznych odpowiednio 0,25, 0,75, 0,95).
4. Aby uniknąć nasycenia pikseli, znajdź optymalną ekspozycję w zakresie liniowym detektora dla każdego znacznika fluorescencyjnego, korzystając z funkcji "Prześwietlenie" w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Zanotuj znormalizowaną ekspozycję dla każdej etykiety fluorescencyjnej.
5. Przechwytuj poszczególne kanały i zapisuj pliki obrazów w skali szarości lub pseudokolorowych tiff (tagged image file format) w najwyższej głębi bitowej (najlepiej 16 bitów - 65 536 wartości szarości) dostarczanej przez urządzenie rejestrujące (np. chłodzone CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem) zamontowane w mikroskopie). Ustaw rozdzielczość obrazu na 1 388 x 1 040 lub wyższą. Pamiętaj, aby na obrazie umieścić podziałkę liniową lub obiekt o znanych wymiarach.
6. Tam, gdzie to możliwe, zapisuj pliki w 16-bitowym formacie pliku obrazu oznaczonego (.tiff), a nie w formacie .jpeg, aby zapobiec utracie informacji²⁵.
7. Jeśli istnieją jakiekolwiek obawy co do równomierności oświetlenia (oprogramowanie dołączone do mikroskopu może mieć automatyczną korektę do tego), należy wykonać obraz "płaskiego" szkiełka nakrywkowego bez komórek, ale wybarwionego i zamontowanego w taki sam sposób, jak szkiełka eksperymentalne; można go użyć do skorygowania wad oświetlenia po akwizycji w oprogramowaniu do analizy obrazu.
8. W przypadku akwizycji obrazu (mikroskopia konfokalna) zoptymalizuj wzmocnienie detektora i moc lasera dla każdego eksperymentu obrazowania (unikaj nasycenia). Ogólnie rzecz biorąc, mierzona fluorescencja jest proporcjonalna do poziomu mocy lasera. Ustaw rozmiar otworu na "1 airy", aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu (lepszą rozdzielczość można osiągnąć przy 0,5 airy dla szczególnie silnych sygnałów). Przeprowadź sekcje optyczne na różnych poziomach wzdłuż osi z przez komórki znakowane przeciwciałami i zapisz maksymalną projekcję 16 bitów dla każdego kanału do analizy obrazu.

9. Wykonywanie pomiarów znakowanych fluorescencyjnie jądrowych czynników transkrypcyjnych za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów (5 minut na pole widzenia).

1. Uzyskaj dostęp do poszczególnych plików graficznych TIFF i nałóż na nie odpowiednie kanały, klikając i przeciągając jeden obraz na drugi. Każdy kanał pojawi się wtedy jako osobna warstwa w panelu warstw.
2. Wybierz opcję rozjaśnij z menu filtra, aby umożliwić jednoczesną wizualizację warstw znajdujących się poniżej. Możesz też dostosować krycie górnych warstw do 50%.
   UWAGA: Obrazy TIFF mogą być zapisywane z "bezstratną" kompresją danych Lempel-Ziv-Welch (LZW) w celu zmniejszenia rozmiarów plików bez utraty informacji.
3. W oknie analizy (Analiza > Wybierz punkty danych > Niestandardowe) wybierz Analiza i wybierz wymagane pomiary (np. Gęstość zintegrowana, gęstość średnia, kołowość, histogram itp.). Odrzuć wszelkie niepotrzebne pomiary, odznaczając pole obok nich. Jeśli wymagane są pomiary powierzchni w μm, kliknij Analiza > Ustaw skalę pomiaru. Automatycznie pojawi się narzędzie linijki – prześledź długość podziałki i wprowadź jej znaną długość w mikrometrach. Oprogramowanie następnie przekonwertuje pomiary powierzchni na mikrony kwadratowe.
   UWAGA: W przypadku wybrania analizy histogramu, po zarejestrowaniu pomiarów pojawi się dodatkowy folder (którego lokalizację można wybrać) z 8-bitowymi histogramami dla każdego indywidualnego obszaru selekcji na mikrofotografii, a także sumą wszystkich indywidualnych wyborów (zawsze pojawia się jako histogram-1, jeśli dokonano wielu wyborów). Analiza ta nie może być wykonana przez oprogramowanie w formacie 16-bitowym, ale jest bardzo przydatna do badania rozkładu intensywności pikseli w całym obiekcie zainteresowania.
4. W celu analizy intensywności fluorescencji jądrowej należy najpierw skonstruować reprezentatywną "maskę wyboru zakresu kolorów" (CRSM) dla DNA barwionego metodą Hoechst lub DAPI, aby określić obszar jądrowy. Po nałożeniu żądanych obrazów kanałów, tylko warstwa kanału Hoechst powinna pozostać widoczna, upewniając się, że "ikona oka" obok niej na karcie warstw jest zaznaczona, a następnie warstwa jest podświetlona (zmienia kolor na niebieski), podczas gdy wszystkie inne warstwy powinny być odznaczone. Upewnij się, że lista rozwijana mieszania jest ustawiona z powrotem na "Normalna" na karcie warstw.
5. Otwórz okno dialogowe Zakres kolorów (Wybierz > zakresu kolorów) i ustaw listę rozwijaną opcji wyboru na "Próbkowane kolory". Z podglądem zaznaczenia ustawionym na "szybką maskę" (czerwone tło) zaznacz wszystkie odcienie niebieskiego koloru w jądrach, przytrzymując Shift (pojawi się znak "+") i klikając w obrębie jąder za pomocą narzędzia do zakraplacza, które się pojawi.
   1. Jeśli zaznaczone są niechciane dźwięki, usuń je, naciskając Alt (pojawi się znak '─') i klikając je. Utrzymuj skalę rozmycia na poziomie zerowym, tak aby w pomiarze uwzględniane były tylko ręcznie wybrane odcienie kolorów, a opcja "Zlokalizowane klastry kolorów" powinna pozostać niezaznaczona.
6. Zapisz ten CRSM na dysku twardym komputera jako plik wyodrębniania specyficzny dla programu (. AXT). Z innym losowym polem jąder załaduj, zaktualizuj i zapisz CRSM (Wybierz, Zakres kolorów, Załaduj). Zrób to dla co najmniej pięciu losowych pól, aby upewnić się, że wybory jądrowe są reprezentatywne.
   1. Użyj kolorowej wersji obrazu w skali szarości do stworzenia maski w celu wyodrębnienia cech, ponieważ ludzkie oko jest w stanie lepiej rozróżnić różne odcienie kolorów niż różne odcienie szarości²⁶.
7. Użyj jądrowego CRSM do segmentacji regionów jądrowych do barwienia. Po wybraniu jąder kliknij Image > Adjustment > Threshold i przesuń suwak maksymalnie w prawo, tak aby jądra zmieniły kolor na. Możesz też kliknąć prawym przyciskiem myszy i wybrać "Wypełnij", a następnie wybrać "Wypełnij do:". Następnie kliknij Wybierz > odwrócone, a teraz naciśnij usuń, aby usunąć całe tło (jeśli pojawi się opcja, wybierz "wypełnij do: białego"). To zasadniczo binaryzuje obraz na podstawie twojego wyboru. Następnie załaduj wtyczkę zlewni z zakładki filtrów, aby oddzielić nakładające się jądra (Filtr > Obraz binarny > Separacja cech zlewni).
   1. Jeśli wiele jąder mocno na siebie nakłada, usuń je z analizy, odznaczając je (przytrzymaj Alt i luźno obrysuj je narzędziem lasso).
8. Na teraz binarnej warstwie jądrowej przejdź do Wybierz zakres kolorów > i > Cienie, aby wybrać poszczególne jądra. Alternatywne przytrzymanie, przesunięcie i kliknięcie w dowolnym czarnym jądrze. Wszystkie jądra zostaną natychmiast wybrane. Następnie przenieś ten wybór do warstwy zawierającej barwienie jądrowym czynnikiem transkrypcyjnym (np. miogeniną), zaznaczając tę warstwę i odznaczając wszystkie inne warstwy. Linie marszowe będą teraz pokazywać położenie jąder w kanale miogeniny.
9. Jeśli pracujesz tylko z pseudokolorowymi obrazami, kliknij paletę Kanały (po prawej stronie karty warstw) i wybierz tylko zielony kanał (obraz będzie teraz szary). Następnie kliknij Tryb > obrazu > Skala szarości. Pojawi się ostrzeżenie "Spłaszcz widoczne warstwy i odrzuć ukryte warstwy", kliknij OK, a następnie pojawi się kolejne ostrzeżenie "odrzuć inne kanały", ponownie kliknij OK. Tylko jedna warstwa wybranych jąder w skali szarości będzie teraz obecna w palecie warstw.
   1. Kliknij przycisk Zapisz pomiary w dzienniku pomiarów, aby uzyskać dane dla wybranych jąder. Jeśli warstwa, która ma być analizowana (np. barwienie miogeniną) jest już surowym 16-bitowym obrazem w skali szarości, po prostu naciśnij przycisk Record Measurements (Rejestruj pomiary).
   2. Eksportuj wybrane pomiary jako plik TXT do wybranej przez siebie lokalizacji. Mogą one być następnie dalej przetwarzane i analizowane w innych pakietach oprogramowania do obsługi danych
      UWAGA: Polecenie Edytuj krok > kroku wstecz (naciśnij jednocześnie wszystkie Alt, Ctrl i Z) przywraca wszystkie poprzednie warstwy, jeśli jest to wymagane.
   3. Poprawka dla niespecyficznej fluorescencji tła²⁷, aby wyniki były ilościowe i porównywalne, ponieważ pomiary intensywności fluorescencji są zawsze mieszaniną sygnału i tła.
      1. Wybierz narzędzie do zaznaczania kwadratów i zaznacz "stały rozmiar", wybierz 20 na 20 pikseli (lub więcej, jeśli chcesz i w zależności od zbiegu komórek na obrazie). Trzymając wciśnięty Shift, wybierz dziesięć lub więcej obszarów tła rozmieszczonych w całym polu widzenia. Naciśnij "Zapisz pomiary" w dzienniku pomiarów.
      2. Obliczyć średnią gęstość całkowania (sumę wszystkich wartości szarości pikseli) na piksel we wszystkich 10 wybranych obszarach tła (podanych jako "średnia wartość szarości" w dzienniku pomiarów). Pomnóż średnią gęstość tła na piksel przez liczbę pikseli w obiekcie docelowym (tj. w każdym jądrze), aby uzyskać średnią gęstość tła na obiekt.
      3. Odejmij fluorescencję tła od pierwotnej zintegrowanej gęstości obiektów, aby uzyskać ostateczną skorygowaną wartość tła. Podejście to uwzględnia potencjalne różnice między polami w zakresie niespecyficznej fluorescencji tła.
         UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby wybrać tylko obszary tła w dobrej wierze, ponieważ ta korekta ma znaczący wpływ na końcowe wartości. Podczas dokonywania wyborów zaleca się powiększanie za pomocą szkła powiększającego.
      4. Przydatne może być również podzielenie ogólnej skorygowanej wartości tła przez obszar jądra w pikselach (tak samo jak przy przyjmowaniu średniego poziomu/intensywności szarości na jądro), aby zminimalizować potencjalny wpływ zlokalizowanego jądrowo sygnału tła, który w większym stopniu przyczyniałby się do wartości gęstości zintegrowanej wraz ze wzrostem rozmiaru jądra (Rysunek 3C).

Results

Oczyszczone komórki miogeniczne i fibroblasty mogą być hodowane w pożywce do różnicowania adipogenicznego przez trzy dni, a następnie na pożywce adipogenicznej z dowolnego miejsca między 7 a 30 dniami, aby ocenić ich potencjał do adipogenezy. Korzystając z oczyszczonych populacji komórek, barwienie czerwienią olejową O w połączeniu z barwieniem immunologicznym dla markerów linii adipogennej i miogennej wykazało, że tylko frakcja fibroblastów była zdolna do różnicowania adipogennego (ryc. 2). Masowa akumu...

Discussion

Opisaliśmy procedurę sortowania immunomagentycznego w celu selektywnego wzbogacania prekursorów pochodzących z ludzkich mięśni z małych próbek materiału do biopsji mięśni. Technika ta okazała się nieoceniona w naszym laboratorium w przezwyciężaniu utraty kultur pochodzących z ludzkich mięśni na rzecz fibroblastów, ale także w zrozumieniu unikalnego zachowania różnych populacji przodków pochodzących z mięśni. Po oczyszczeniu komórki miogenne mogą być badane pod kątem zmian w ekspresji białek i/lub genów lub wykorzystywane...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kolagenaza  D	Roche
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Przed użyciem należy wysterylizować filtrem
Trypsin/EDTA(	Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μ m sitko komórkowe	BD Biosciences	352360
Roztwór kolagenu (3 mg/ml w 0,1% kwasie octowym)	Sigma, Dorset, Wielka Brytania	C8919
Filtr strzykawkowy Minisart SRP15 (0,2 μ m)	Sartorius	17573ACK	Membrana politetrafluoroetylenowa (PTFE)
CD56 ludzkie mikrogranulki	Miltenyi Biotech	130-050-401	Należy pamiętać o ograniczonym okresie trwałości mikrogranulek
Mikrogranulki antyfibroblastowe, ludzkie	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μ m Filtry do separacji wstępnej	Miltenyi Biotech	130-041-407
Kolumny wielkokomórkowe	Miltenyi Biotech	130-042-202	Kolumny te są wyposażone w rezystor przepływu. Użycie rezystora przepływowego nie jest konieczne do uzyskania opisanej tutaj wysokiej czystości miogenicznej.
Kolumny LS	Miltenyi Biotech	130-042-401
Separator MiniMacs	Miltenyi Biotech	130-042-102	Ten separator pasuje do kolumny o dużej komórki, ale nie do kolumny LS.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
Wielostanowiskowy MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Przed użyciem należy wysterylizować filtr
Czerwony O	Sigma	O0625
Fosforan trietylu	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	Nr 42, bezpopiołowy. Aby przygotować filtr, złóż okrągłą bibułę filtracyjną, aby utworzyć półkole, a następnie ponownie złóż półkole na pół, aby utworzyć kształt stożka. Dopasuj stożek do lejka w celu filtrowania.
Odczynnik molekularny	ProLong Gold Antifade	P36930	Można go kupić z DAPI lub bez i nie gasi początkowej fluorescencji.
AxioVision	Carl Zeiss	Kontakt Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (zakupiony w Pugh Computers)	ADPH16982*