Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52062

⸱

6 listopada 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano metodę ilościowego określania wielkości i kształtu zarodków Xenopus laevis. W tym protokole tradycyjne pomiary wielkości są połączone z morfometrią geometryczną, aby umożliwić bardziej wyrafinowane analizy rozwoju i wad ustno-twarzowych.

Streszczenie

Xenopus stał się ważnym narzędziem do analizowania mechanizmów rządzących rozwojem i wadami twarzoczaszki. Metoda ilościowego określania rozwoju ustno-twarzowego pozwoli na bardziej rygorystyczną analizę fenotypów ustno-twarzowych po zniesieniu substancjami, które mogą genetycznie lub molekularnie manipulować ekspresją genów lub funkcją białka. Korzystając z dwuwymiarowych obrazów głów embrionalnych, mierzone są tradycyjne wymiary - takie jak szerokość, wysokość i powierzchnia twarzowa. Ponadto do opisania kształtu ust stosuje się miarę okrągłości zarodka otworu ustnego. Morfometria geometryczna tych dwuwymiarowych obrazów jest również wykonywana, aby zapewnić bardziej wyrafinowany widok zmian w kształcie obszaru ustno-twarzowego. Punkty orientacyjne są przypisywane do określonych punktów w obszarze ustno-twarzowym i tworzone są współrzędne. Analiza składowych głównych służy do zredukowania współrzędnych punktów orientacyjnych do składowych głównych, które następnie dyskryminują grupy leczone. Wyniki te są wyświetlane jako wykres punktowy, na którym osoby o podobnych kształtach ustnych skupiają się razem. Przydatne jest również przeprowadzenie analizy funkcji dyskryminacyjnych, która statystycznie porównuje pozycje punktów orientacyjnych między dwiema grupami leczenia. Analiza ta jest wyświetlana na siatce transformacji, w której zmiany położenia punktu orientacyjnego są wyświetlane jako wektory. Siatka jest nakładana na te wektory, dzięki czemu wyświetlany jest wzór wypaczania pokazujący, gdzie zmieniły się znaczące pozycje punktów orientacyjnych. Zmiany kształtu w analizie funkcji dyskryminacyjnej są oparte na mierze statystycznej i dlatego mogą być oceniane za pomocą wartości p. Analiza ta jest prosta i dostępna, wymaga jedynie stereoskopu i darmowego oprogramowania, a zatem będzie cennym zasobem badawczym i dydaktycznym.

Wprowadzenie

Do najbardziej rozpowszechnionych i niszczących typów wad wrodzonych u ludzi należą te dotyczące ust i twarzy, takie jak rozszczepy ustno-twarzowe1. Dzieci ze zniekształconymi strukturami ustno-twarzowymi przechodzą wiele operacji w ciągu swojego życia i zmagają się ze zniekształceniami twarzy, problemami z mową, słuchem i jedzeniem. W związku z tym ułatwienie nowych badań nad rozwojem czaszki i twarzoczaszki ma zasadnicze znaczenie dla zapobiegania i leczenia tego typu wad wrodzonych u ludzi. Xenopus laevis pojawił się jako nowe narzędzie do analizowania mechanizmów rządzących rozwojem twarzoczaszki (niektóre przykłady to2,3,4-11). Dlatego ilościowa metoda analizy zmian wielkości i kształtu podczas rozwoju głowy i pyska tego gatunku może być bardzo skuteczna 3.

Tutaj prezentujemy taką metodę; łącząc tradycyjne pomiary rozmiarów z geometrycznymi morfometriami zaadaptowanymi z badania Xenopus 12 i bogactwa badań analizujących ludzką formę twarzy13-15. Celem tego protokołu jest umożliwienie naukowcom ilościowego określenia rozmiaru i kształtu twarzy w celu rozróżnienia różnych fenotypów ustno-twarzowych podczas normalnego i nieprawidłowego rozwoju. Analiza ta pozwoli na lepsze rozróżnienie subtelnych wad twarzoczaszki, takich jak te wynikające z synergicznego działania genów i/lub czynników środowiskowych. Dodatkowo, ta metoda kwantyfikacji może również ujawnić nawet niewielką poprawę lub uratowanie wady twarzoczaszki. To sprawia, że jest to przydatny przewodnik w analizie potencjalnych terapii.

Kombinacja pomiarów twarzy i morfometrii geometrycznej, którą tutaj prezentujemy, pozwala na bardziej wszechstronną analizę statystyczną zarówno rozmiaru, jak i kształtu okolicy twarzo-twarzowej niż obecne protokoły, które w dużej mierze wykorzystują tylko jeden lub drugi15-18. Ponadto przedstawiamy prosty sposób oceny zarówno przyśrodkowej, jak i bocznej płaszczyzny twarzy bez konieczności stosowania zaawansowanego sprzętu do obrazowania trójwymiarowego stosowanego w obecnych badaniach13,19.

Pokazujemy ten protokół na zarodkach Xenopus laevis leczonych inhibitorem receptora kwasu retinowego, który wywołuje nieprawidłowy rozwój szczękowo-twarzowy i środkowy rozszczep podniebienia2,3. Kwantyfikacja wymiarów i kształtu okolicy ustno-twarzowej w tych zarodkach ujawniła zmiany w środkowej części twarzy, które są analogiczne do ludzi z podobnymi szczelinami podniebienia i modelami mysimi 20,21. Jednak protokół ten może być wykorzystany do oceny wpływu innych związków na rozwój jamy ustnej, takich jak substancje naturalne, herbicydy lub białka, takie jak czynniki wzrostu. Co więcej, zmiany wielkości i kształtu ustno-twarzowej wynikające z zaburzeń ekspresji genów poprzez eksperymenty z utratą lub zyskiem funkcji (przy użyciu antysensownych morpholinos lub Crispers/Talens) można również określić ilościowo za pomocą tego protokołu. Wreszcie, opracowaliśmy tę metodę specjalnie do oceny morfologii Xenopus; Można go jednak łatwo zmodyfikować do analizy dowolnego kręgowca. Inne zastosowania mogą również obejmować wykorzystanie tego protokołu do porównywania blisko spokrewnionych gatunków do badań ewolucyjnych lub ekologicznych. Chociaż przykład, który tutaj podajemy, wykorzystuje ten protokół do opisania analizy obszaru ustno-twarzowego, można go łatwo zmodyfikować w celu analizy innych regionów, narządów lub struktur.

Ten protokół kwantyfikacji ustno-twarzowej stanie się cennym źródłem informacji dla społeczności naukowej, a także doskonałym narzędziem nauczania dla studentów studiów licencjackich jako demonstracja wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone przy użyciu Xenopus laevis zostały zatwierdzone przez IACUC (protokół #AD20261) .

1. Przygotowanie odczynników i wymaganych materiałów

  1. Odczynniki:
    1. Przygotować 1 l 10x roztworu MBS (zmodyfikowanej soli fizjologicznej Bartha)22. Do 1 l wody destylowanej dodać NaCl (880 mM), KCl (10 mM),MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) i NaHCO3 (25 mM). Dostosuj pH do 7,8 za pomocą NaOH.
    2. Przygotować 1 l 1x MBS, rozcieńczając 100 ml 10x roztworu MBS w 900 ml wody destylowanej. Dodać 0,7 ml 1 M roztworu CaCl2
      3. .
    3. Przygotować 1 l 0,1 x MBS, rozcieńczając 100 ml roztworu 1x MBS w 900 ml wody destylowanej. Do 1 l 0,1 x MBS roztworu dodać 1 ml 10 mg/ml roztworu gentamycyny do stosowania w hodowli zarodków.
    4. Przygotować MBS o wysokiej zawartości soli, rozpuszczając 4 ml 5 M NaCl w 100 ml 10x MBS. Następnie dodaj wodę destylowaną, aż całkowita objętość wyniesie 1 l.
    5. Wytwarzaj 70% etanolu, rozcieńczając 100% etanolu do 70% etanolu za pomocą wody destylowanej.
    6. Wykonaj BMS-543, przygotowując 10 mM roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku (DMSO).
    7. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA), dodając 4 g proszku paraformaldehydu do 50 ml wody destylowanej. Podgrzać na płycie grzejnej do około 65 °C, w tym momencie kroplami dodawać 5 M NaOH, aż roztwór się klaruje.
      1. Gdy roztwór się klaruje, zdjąć z ognia i dodać 50 ml 2x PBS i 100 μl Tween-20. Pozostawić do ostygnięcia do RT na lodzie. Dostosuj pH do zakresu od 7,2 do 7,5 za pomocą HCl.
    8. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej za pomocą Tween (PBT), rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 800 ml wody destylowanej. Używając HCl, dostosuj pH do 7,4. Dodać 2 ml Tween-20. Dostosuj końcową objętość wodą destylowaną do 1 l.
    9. Przygotuj roztwór cysteiny, rozpuszczając 1 g cysteiny w 50 ml wody destylowanej lub 0,1 x MBS. Dodać 1,5 ml 5 M NaOH i dostosować pH do 7,8.
    10. Przygotować 10% roztwór podstawowy benzokainy, dodając 10 g benzokainy w proszku do 100 ml 100% EtOH. W przypadku eutanazji dorosłych mężczyzn i zarodków gotowych do utrwalenia należy rozcieńczyć do 0,05% roztworu.
    11. Przygotować roztwór do przechowywania jąder, dodając 1 ml surowicy cielęcej do 9 ml buforu L15.
  2. Wymagane narzędzia i sprzęt:
    1. Zaopatrz się w sprzęt wymieniony w Tabeli materiałów i wyposażenia, pokazany na rysunku 1.
    2. Modyfikowanie narzędzia do pipetowania. Umieść końcówkę szklanej pipety Pasteura w płomieniu z palnika Bunsena. Obracaj końcówką pipety, aż stopi się i utworzy zaokrągloną, uszczelnioną końcówkę.
    3. Spłaszcz plastelinę na dnie plastikowej szalki Petriego, wygładzając tak, aby pokryła całą płytkę (można użyć dowolnego rozmiaru) (Ryc. 1Aiv).
      1. Delikatnie wciśnij prostą igłę do drażnienia w wyłożone gliną naczynie pod kątem 45°. Przytrzymaj tam igłę i powoli przesuwaj szalkę Petriego poziomo, aby utworzyć wgłębioną linię (Rysunek 1Bi). Powtórz dla żądanej liczby rzędów.
      2. Użyj końcówki szklanej pipety, aby wykonać płytkie, okrągłe wgłębienia w każdym rzędzie naczynia wyłożonego gliną, aby umieścić głowy zarodków (ryc. 1Bii) i pomóc w uporządkowaniu zarodków podczas fotografowania.
      3. Do fotografii napełnij naczynie PBT (Rysunek 1Biii). Pomiędzy użyciami dokładnie umyj naczynie i glinianą powierzchnię sterylną wodą, a następnie 70% etanolem.

2. Hodowla zarodków Xenopus laevis i leczenie inhibitorami

  1. Zapłodnienie in vitro i hodowla jaj Xenopus:
    1. Uzyskać i wyhodować zarodki Xenopus laevis przy użyciu standardowych opublikowanych metod22,23.
    2. Krótko mówiąc, poddaj eutanazji dorosłego mężczyznę przez zanurzenie w 0,05% roztworze benzokainy. Rozwiń jądra i przechowuj je w buforze pamięci jąder. Wstrzyknij dorosłym samicom ludzką gonadotropinę kosmówkową (HCG), zbierz jaja w MBS o wysokiej zawartości soli i zapłodnij in vitro wypreparowanymi jądrami (ryc. 2A, B).
    3. Hodowla zarodków w 0,1x MBS w temperaturze 15 °C aż do osiągnięcia pożądanego stadium (stadium zarodków zgodnie z tabelą normalnych Xenopus laevis autorstwa Nieuwkoopa i Fabera24,25).
      1. W tym przypadku należy hodować zarodki do stadium 22 (24 godziny po zapłodnieniu (hpf)) i usunąć błonę witelinową pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą dwóch par zaostrzonych kleszczy. Przenieść zarodki za pomocą standardowej, jednorazowej pipety transferowej na czystą szalkę Petriego (o średnicy 100 mm) zawierającą 30-40 ml 0,1 x MBS.
  2. Leczenie inhibitorami zarodków Xenopus (zilustrowane na rycinie 2):
    1. Napełnić niezbędne studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej 1 ml 0,1 x MBS za pomocą skalibrowanego pipetomana. Odgranicz zewnętrzną część studni za pomocą drobnego znacznika punktowego (rysunek 2D, wstawka). Użyj markera, aby również oznaczyć zawartość, która ma być dodana do każdej studzienki na pokrywie 24-dołkowej płytki do hodowli. Skopiuj te informacje na stronę konfiguracji 24 dołków w notatniku laboratoryjnym.
    2. Przenieś 5-10 zarodków do każdej studzienki za pomocą standardowej, jednorazowej pipety transferowej (ryc. 2C). Umieść taką samą liczbę zarodków w każdym dołku.
    3. Napełnij lub wyjmij 0,1 MBS tak, aby znajdował się na poziomie linii oznaczonej 1 ml (Rysunek 2D). Dodaj odpowiednią objętość DMSO (tak, aby końcowa objętość DMSO wynosiła 1%) i delikatnie zamieszaj. Należy uważać, aby nie dodawać DMSO zbyt blisko zarodków i unikać kontaktu zarodków z powierzchnią buforu.
    4. Dodaj odpowiednią objętość środka chemicznego do wyznaczonych studzienek i ponownie delikatnie zamieszaj. Tutaj dodaj 1 μl 10 mM BMS-453 (antagonista receptora kwasu retinowego) i 9 μl DMSO do 1 ml 0,1x MBS.
    5. Jeśli substancja chemiczna jest wrażliwa na światło, luźno zawiń naczynie hodowlane w folię aluminiową. Hodować zarodki w inkubatorze o temperaturze 15 °C do pożądanego etapu. W tym przykładzie traktuj zarodki przez 16-18 godzin.
  3. Wymywanie zarodków z zabiegu i odchów do stadium kijanki:
    1. Usuń od połowy do trzech czwartych roztworu za pomocą jednorazowej pipety do przenoszenia. Uważaj, aby nie przeszkadzać zarodkom. Używając nowej pipety transferowej, napełnij studzienkę 0,1x MBS. Powtórz to 3-6 razy.
    2. Przenieść zarodki na dużą szalkę Petriego (o średnicy 150 mm) zawierającą 100 ml 0,1 x MBS z gentamycyną (1 ml/l). Inkubować zarodki w temperaturze 15 °C, aż osiągną stadium 42-45 (82-100 hpf).
    3. Codziennie zmieniaj 0,1 MBS roztwór zawierający gentamycynę i natychmiast usuwaj martwe zarodki, aby zapobiec zakażeniu lub śmierci innych zarodków. Zapisz liczbę martwych zarodków w notatniku laboratoryjnym.
  4. Utrwalanie zarodków w paraformaldehydzie (PFA):
    1. Utrwal zarodki między etapami 42 i 45 (odpowiednio 82 i 100 hpf), przenosząc je do nowej 24-dołkowej szalki hodowlanej zawierającej 1-2 ml 0,1x MBS. Oznaczyć pokrywkę tymi samymi informacjami, co w opisanym powyżej ustawieniu leczenia (punkt 2.2.1).
    2. Usuń jak najwięcej 0,1 MBS z każdej studzienki, pozostawiając zarodki przykryte i zapewniając minimalny kontakt, aby zapobiec uszkodzeniom. Dodać 1-2 ml 0,05% roztworu benzokainy w 0,1 x MBS i inkubować do momentu, gdy zarodki przestaną reagować na bodźce.
    3. Dodać 1-2 ml 4% PFA. Alternatywnie, umieść zarodki w oznakowanych probówkach do mikrowirówek w celu utrwalenia, jeśli wolisz.
    4. Inkubować zarodki w PFA przez 24 godziny w temperaturze 4 °C na obrotowym wytrząsarce. Usuń PFA, wykonując 3-4 prania z PBT w ciągu 3-5 godzin.

3. Fotografowanie obszaru ustno-twarzowego kijanek Xenopus

  1. Przygotowanie do zdjęć (jest to zilustrowane na rysunku 3):
    1. Umieścić utrwalone zarodki na dużej szalce Petriego (o średnicy 150 mm) zawierającej około 100 ml PBT.
    2. Wykonaj dwa nacięcia, aby odciąć głowę od ciała (ryc. 3A, ciągłe czarne linie). Najpierw przytrzymaj zarodek za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie po tylnej stronie jelita za pomocą sterylnego skalpela (ryc. 3B). Wykonaj drugie nacięcie po przedniej stronie jelita, w pobliżu serca, aby całkowicie usunąć głowę (ryc. 3C).
    3. Odcięte głowy zarodków należy przetrzeć pipetą do naczynia wyłożonego gliną (część 1.2.2) za pomocą standardowej, jednorazowej pipety do transferu.
      1. W przypadku widoków z przodu użyj dwóch par kleszczy, aby ustawić głowy zarodków tylną stroną do dołu wewnątrz okrągłych zagłębień. Używając kleszczy do manipulowania zarówno główką zarodka, jak i otaczającą go gliną, ustaw zarodki tak, aby były skierowane w stronę kamery i nie były przechylone do tyłu lub w żadną stronę (ryc. 3D). Delikatnie dociśnij otaczającą glinkę wokół głowy za pomocą kleszczy i/lub szklanego narzędzia do pipet, aby zamocować głowę na miejscu.
      2. W przypadku widoków bocznych użyj kleszczy, aby umieścić głowy zarodków w okrągłych zagłębieniach tak, aby znajdowały się na boku, skierowane w tym samym kierunku i przylegały płasko do gliny. Manipuluj głową zarodka i otaczającą go gliną tak, aby gruczoły cementowe wszystkich zarodków były ustawione w dół pod tym samym kątem (ryc. 3E). Użyj rzędów narysowanych igłą do drażnienia jako przewodnika, aby zapewnić dokładność podczas wykonywania pomiarów bocznych.
  2. Wykonywanie zdjęć głowy kijanki:
    1. Sfotografuj głowę kijanki za pomocą dowolnego mikroskopu preparacyjnego z dołączonym aparatem cyfrowym i odpowiednim oprogramowaniem aparatu. Użyj największego powiększenia, które może być utrzymane na stałym poziomie dla wszystkich zarodków.
    2. Wyśrodkuj zarodki i skieruj je wszystkie w tym samym kierunku. Rób zdjęcia w najlepszych warunkach oświetleniowych, które pozwalają na uzyskanie najdokładniejszego obrazu obszaru ustno-twarzowego. Ustaw światła, aby uniknąć nadmiernych cieni. Zapisuj obrazy jako pliki .tiff o najwyższej możliwej rozdzielczości.

4. Mierzenie i analizowanie wymiarów twarzy u kijanek Xenopus

  1. Zmierz wymiary ustno-twarzowe (podsumowane na rysunku 4):
    1. Określ szerokość twarzy. Zidentyfikuj punkty, w których brzuszna część każdego oka styka się z obrzeżami twarzy (Rysunek 4A, strzałki) i zmierz odległość między tymi punktami (Rysunek 4A, czerwona linia).
    2. Określ wysokość twarzy. Najpierw określ linię środkową, mierząc odległość między każdym okiem i obliczając znak połowy. Następnie narysuj poziome linie, które wyznaczają najbardziej grzbietowe krawędzie oczu i najbardziej grzbietowy punkt gruczołu cementowego (ryc. 4B, białe linie). Na linii środkowej zmierz odległość między liniami poziomymi (Rysunek 4B, czerwona linia).
    3. Określ obszar ustno-twarzowy. Użyj tych samych poziomych linii oznaczających grzbietowe krawędzie oczu i gruczoł cementowy, aby poprowadzić pomiar obszaru (Rysunek 4C, białe linie). Zacznij od punktu, w którym pozioma linia wyznaczająca górną część dławika cementowego styka się z obrzeżem lewej strony lica (ryc. 4Ca).
      1. Obrysować wzdłuż krawędzi twarzy obejmującej oko aż do punktu, w którym pozioma linia wyznaczająca górną część oczu styka się z obrzeżem twarzy (rysunek 4Cb). Kontynuuj śledzenie wzdłuż tej najbardziej poziomej linii grzbietowej aż do punktu, w którym styka się ona z obrzeżem prawej strony twarzy (ryc. 4Cc).
      2. Śledź w dół wzdłuż krawędzi twarzy obejmującej oko aż do punktu, w którym najbardziej pozioma linia brzuszna wyznaczająca górną część dławika cementowego spotyka się z obrzeżem prawej strony twarzy (ryc. 4Cd). Kontynuuj śledzenie wzdłuż tej dolnej poziomej linii, aż napotka punkt, w którym rozpoczęło się śledzenie. Użyj oprogramowania do edycji zdjęć, aby obliczyć obszar wewnątrz obrysowywania.
    4. Określ długość pyska. Na obrazach bocznych wykonaj pionową linię, która zaznacza przednią część oka. Następnie zmierz odległość poziomą od najbardziej wysuniętego do przodu punktu, w którym powierzchnia styka się z grzbietową krawędzią gruczołu cementowego, do pionowej linii wyznaczającej przednią część oka (ryc. 4D).
    5. Określ szerokość ust. Zmierz odległość poziomą między lewym i prawym punktem, w którym spotykają się górne i dolne "wargi" otworu ust (Rysunek 4E). Można je uznać za żabi odpowiednik spoidła wargowego.
    6. Określ okrągłość ust. Obliczać okrągłość ust jako odwrotny współczynnik proporcji, gdzie (4 × [Obszar]) / (π × [Oś główna]2).
      1. Użyj narzędzia Lasso w edytorze zdjęć, aby prześledzić krawędzie otworu ust, jak pokazano na rysunku 4F. Wybierz pozycję Analizuj na głównym pasku narzędzi, a następnie wybierz pozycję Zmierz. Alternatywnie oblicz okrągłość na podstawie pomiaru powierzchni i średnicy otworu ustowego.
  2. Analiza danych dotyczących wymiarów twarzy:
    1. Wprowadź pomiary wymiarów twarzy do programu do analizy danych, aby porównać grupę leczoną z grupą kontrolną. Określ średnią każdego pomiaru zarówno dla grupy eksperymentalnej, jak i kontrolnej, aby utworzyć wykresy słupkowe. Określ odchylenie standardowe w celu utworzenia słupków błędów. Wykonaj testy t-Studenta, aby statystycznie porównać grupy.
      UWAGA: Dane te mogą być dość zmienne ze względu na nieco inne tempo rozwoju wśród zarodków.

5. Analiza ilościowa kształtu twarzy i morfometrii

  1. Umieszczanie punktów orientacyjnych i tworzenie pliku współrzędnych punktu orientacyjnego (zilustrowanego na rysunku 5A).
    1. Wybierz opcję Punkty orientacyjne w taki sposób, aby oddawały kształt obrazu docelowego i mogły być wielokrotnie umieszczane w tym samym położeniu względnym we wszystkich analizowanych próbkach. Jeśli struktura nie istnieje we wszystkich próbkach, nie umieszczaj na niej punktu orientacyjnego.
      1. Tutaj umieść 24 punkty orientacyjne reprezentujące środkową część twarzy z charakterystycznymi znakami, takimi jak oczy, nozdrza i usta. Aby zachować spójność, umieść punkty orientacyjne w połowie odległości między poprzednio umieszczonymi punktami orientacyjnymi (na przykład punkty orientacyjne ujścia, Rysunek 5Ai).
    2. Przechwyć współrzędne punktu orientacyjnego i utwórz "plik współrzędnych punktu orientacyjnego". Otwórz pierwszy obraz twarzy kijanki (na przykład pierwszego zarodka kontrolnego).
      1. Wybierz zakładkę Wtyczki na głównym pasku narzędzi i wybierz Pointpicker z menu rozwijanego. Wybierz kartę Dodaj punkty i umieść punkty orientacyjne w żądanych lokalizacjach, ponieważ punkty orientacyjne będą wyświetlane jako wielokolorowe krzyżyki (Rysunek 5Ai).
      2. Przesuwaj lokalizacje punktów orientacyjnych po umieszczeniu, wybierając narzędzie Przesuń krzyżyki. Po umieszczeniu wszystkich punktów orientacyjnych na obrazie wybierz kartę Wyświetl wyniki na głównym pasku narzędzi i wybierz opcję Pokaż (Rysunek 5Aii), aby wyświetlić współrzędne punktu orientacyjnego i skopiować je do programu arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 5Aiii).
      3. Wklejając te współrzędne z tego pierwszego zarodka do programu arkusza kalkulacyjnego, pozostaw pusty wiersz nad danymi. W kolumnie B tego pustego wiersza (wiersz 1) wpisz "LM= " z liczbą punktów orientacyjnych w próbce. W tym miejscu wpisz "LM= 24", ponieważ utworzono 24 punkty orientacyjne (Rysunek 5Aiii, czerwona ramka).
      4. W wierszu poniżej punktów danych wpisz "ID=" z nazwą identyfikującą próbkę. Tutaj, na rysunku 5Aiii, wprowadź "ID=CON1", ponieważ są to dane współrzędnych punktu orientacyjnego pierwszego zarodka kontrolnego (rysunek 5Aiii, czerwona strzałka).
      5. Powtarzaj ten proces z twarzami każdego zarodka w eksperymencie (eksperymentalnym i kontrolnym), aż wszystkie współrzędne punktu orientacyjnego zostaną wprowadzone do arkusza kalkulacyjnego.
        UWAGA: Ważne jest, aby każdy zarodek miał unikalną nazwę w wierszu "ID=". Tutaj, na przykład, następny zestaw współrzędnych punktu orientacyjnego otrzymuje identyfikator "CON2", ponieważ był to drugi zarodek w grupie kontrolnej.
      6. Skopiuj całą drugą i trzecią kolumnę do dokumentu tekstowego i zapisz jako plik .txt.
  2. Skonfiguruj oprogramowanie morfometryczne do analizy danych (zilustrowane na rysunku 5B).
    1. W tym miejscu wybierz opcję Utwórz nowy zestaw danych w menu głównym w oprogramowaniu morfometrycznym. Nazwij plik i zestaw danych w odpowiednich polach (na przykład odpowiednio "Hamowanie kwasu retinowego" i "Punkty orientacyjne twarzy") na wyskakującym ekranie (Rysunek 5Bi). Zaimportuj plik jako TPS i wybierz plik tekstowy współrzędnych, aby utworzyć zestaw danych (Rysunek 5Bi, czerwona strzałka).
    2. Dopasowanie danych i prokrustajów:
      1. Wykonaj dopasowanie i wyrównanie prokrustu. Zaznacz zestaw danych w zakładce Drzewo projektu, wybierz Wstępne na głównym pasku narzędzi i Nowe dopasowanie Procrustes z menu rozwijanego.
      2. Wybierz opcję Wyrównaj według osi głównej i wybierz opcję Wykonaj dopasowanie prokrustowe u dołu pola (Rysunek 5Bii, czerwona strzałka). Wróć do menu rozwijanego Praktyki wstępne, wybierz opcję Generuj macierz kowariancji (Rysunek 5Biii), a następnie wybierz opcję Wykonaj.
      3. Wyświetl korelacje macierzy kowariancji na karcie Wyniki.
    3. Utwórz "plik klasyfikatora", przypisując każdą próbkę w zbiorze danych do odpowiedniej zmiennej klasyfikatora, aby rozróżnić, czy należy ona do grupy eksperymentalnej, czy do grupy kontrolnej.
      1. Oznacz etykietą dwie kolumny w arkuszu kalkulacyjnym. Oznacz nagłówek pierwszej kolumny mianem "ID" i wprowadź te same identyfikatory podane dla każdej próbki (na przykład CON1, RARINHIB1 itd.; Rysunek 5Biv). Oznacz nagłówek drugiej kolumny tekstem "LECZENIE" i wprowadź do każdej komórki grupę traktowania, która odpowiada próbce wymienionej w sąsiedniej komórce identyfikacyjnej.
      2. Tutaj użyj etykiet "CONTROL i RAR INHIBITOR" jako klasyfikatorów (Rysunek 5Biv). Skopiuj do pliku tekstowego i zapisz jako plik .txt. Zaimportuj zmienne klasyfikacyjne do programu morfometrycznego. Wybierz opcję Dopasuj według identyfikatora i otwórz plik tekstowy (Rysunek 5Bv).
  3. Utwórz wykres punktowy analizy głównych składowych (PCA), wybierając menu rozwijane Zmienność i wybierając opcję Analiza głównych składowych (Rysunek 6Ai). Następnie wybierz kartę Grafika, aby wyświetlić trzy dodatkowe karty: zmiany kształtu komputera, wartości własne i wyniki komputera (Rysunek 6Aii). Zakładka Wyniki PC wyświetla dwuwymiarowy wykres rozrzutu głównych składowych danych punktu orientacyjnego dopasowania Prokrustesa (Rysunek 6Aii).
    1. Aby zmienić, które główne komponenty są kreślone, otwórz menu podręczne w obszarze kreślenia i wybierz żądaną oś do zmiany (Rysunek 6Aiii, czerwona strzałka).
    2. Wybierz narzędzie Kolorowe punkty danych (Rysunek 6Aiii). Wybierz wcześniej zaimportowane klasyfikatory (sekcja 5.2.2) w drugim menu podręcznym, które pojawia się, aby określić kolor każdej kategorii (Rysunek 6Aiv).
    3. Wyświetl wielkość wariancji przechwyconej przez każdy główny składnik na karcie Wyniki (Rysunek 6Av). Eksportuj wykres jako plik .bmp.
  4. Utwórz siatkę transformacji analizy funkcji dyskryminacyjnych (DFA) w oprogramowaniu morfometrycznym, wybierając opcję Analiza funkcji dyskryminacyjnych na karcie Porównanie (Rysunek 6Bi). Upewnij się, że w menu podręcznym wybrano odpowiedni zestaw danych, a typ danych to współrzędne dopasowane do prokrustu.
    1. Zaznacz pary grup, które mają zostać porównane, i uruchom 1 000 testów permutacji (Rysunek 6Bii).
    2. W obszarze Grafika wyświetl mapę wektorową współrzędnych na karcie Różnica kształtu (Rysunek 6Biii). Jeśli obraz jest odwrócony, wyświetl menu podręczne w obszarze kreślenia, aby obrócić diagram we właściwej orientacji (Rysunek 6Biii).
    3. Kierunek wektorów odzwierciedla różnicę kształtu między pierwszą grupą a drugą, która jest wyświetlana w menu funkcji dyskryminacyjnych przed uruchomieniem analizy (Rysunek 6Bii). Aby odwrócić kierunek wektorów, otwórz menu podręczne w obszarze wykresu i zmień znak współczynnika skali tak, aby był ujemny (Rysunek 6Biii,iv). Wartość wartości skali jest ustawiona na współczynnik dziesięć, który najlepiej odzwierciedla statystyczne różnice w położeniu punktu orientacyjnego między dwiema grupami bez zniekształceń i zwykle pozostaje na poziomie domyślnym (rysunek 6Biv).
    4. Również w menu podręcznym zmień wykres na siatkę transformacji, aby nałożyć wektory na siatkę (Rysunek 6Biii,v).
    5. Określ liczbę poziomych i pionowych linii siatki w menu podręcznym (Rysunek 6Biii,v).
    6. Wyeksportuj wykres jako plik .bmp.
    7. Wyświetl odległości Procrustesa i Mahalinobisa oraz wartości p na karcie Wyniki (Rysunek 6Bvi).
  5. Dodatkowe analizy morfometryczne, które są przydatne do oceny więcej niż jednej grupy leczonej
    1. Utwórz siatkę transformacji analizy głównych składników. Na karcie Zmiany kształtu komputera wyświetlana jest mapa wektorowa zmian kształtów uwzględniająca wariancję w każdej grupie próbek. Użyj wyskakującego menu w obszarze kreślenia, aby odpowiednio ustawić obraz i nałożyć wektory na siatkę transformacji. Ustaw współczynnik skali na wartość na osi x wykresu wyników PC, która odpowiada szacowanemu środkowi grupy kontrolnej. Wyeksportuj obraz jako plik .bmp.
    2. Utwórz wykres rozrzutu CVA. Na karcie Porównanie na głównym pasku narzędzi wybierz opcję Analiza wariancji kanonicznej i zaznacz zestaw zmiennych klasyfikatora, który został wcześniej zaimportowany (patrz sekcja 5.2.3). Wybierz 1 000 iteracji dla testów permutacji, a następnie wybierz pozycję Wykonaj. Wybierz kartę Wyniki CV, aby wyświetlić wykres rozrzutu CVA dla dwóch zmiennych. Jest to oznaczone kolorami na podstawie przesłanych klasyfikatorów. Zmień schemat kolorów, wywołując menu podręczne w obszarze kreślenia (patrz Sekcja 5.3.3). Eksportuj jako plik .bmp.
    3. Utwórz siatkę transformacji CVA. Siatka transformacji wyników CVA może być generowana podczas porównywania więcej niż dwóch grup. Na karcie Grafika wybierz opcję CV Shape Changes, aby zwizualizować siatkę transformacji współrzędnych punktu orientacyjnego. Wyświetl menu podręczne w obszarze kreślenia, aby zmienić kierunek wektora, nałożyć wyniki na siatkę transformacji i określić liczbę linii siatki. Wyeksportuj wykres jako plik .bmp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym materiale zaprezentowano ilościową analizę wielkości i kształtu otworu gębowego w celu porównania embrionów traktowanych inhibitorem receptora kwasu retinowego (inhibitor RAR) z kontrolami nietraktowanymi. Embriony poddano działaniu tego inhibitora chemicznego w stężeniu 1 μM od stadium 24 do 30 (26-35 hpf), po czym zostały wypłukane i utrwalone w stadium 42 (82 hpf). Następnie przetworzono je i przeanalizowano zgodnie z opisem w protokole. Wyniki stanowią oryginalne dane, są one jednak zgodne z obserwacjami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Xenopus laevis stał się użytecznym narzędziem do analizowania mechanizmów rozwojowych leżących u podstaw rozwoju ustno-twarzowego; Jednak obecnie nie ma protokołów opisujących zmiany wielkości i kształtu tego regionu u żab. Opisana tutaj metoda znacząco przyczyni się do rozwoju ustno-twarzowego, umożliwiając bardziej rygorystyczną kwantyfikację fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus i innych kręgowców.

Pierwszym, najbardziej krytycznym aspektem prawidłowego wykonania tego proto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pieniądze na rozpoczęcie działalności dla A. Dickinsona z VCU wsparły tę pracę.

Autorzy pragną podziękować Danowi Nacu za jego talent artystyczny w tworzeniu ilustracji schematu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop preparacyjnyZeisswyposażony w kamerę AxioCamICC1
Dumont #5 Kleszcze InoxFine Science Tools11251-10
Sterylny, jednorazowy skalpelSklar06-2015
Płytka 24-dołkowaFisher Scientific087721
Standard Jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-7M
150 mm x 15 mm Szalki PetriegoFalcon351058
InkubatoryEktotermaustawiona na 15 ° C lub 20 ° C
ModelinaPremo lub inna nietoksyczna plastelinaw kolorze czarnym lub białym
Prosta igła do drażnieniaThermo Scientific19010
Rurka kapilarna (do igieł)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID / Włókno, 100 mm każdy
Ściągacz do igieł, model P-97Sutter Instrument Co.Ściągacz do igieł: P-97 Ściągacz do mikropipet Flaming/Bown Filament: FB300BW przypadku filamentów użyj filamentów Sutter 3.00 mm w kształcie kwadratu o szerokości 3.0 mm.
PipetyGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CysteinaSigma-Aldrich52-90-4
Paraformaldehyd w proszkuSigma-Aldrich158127
szalki PetriegoFalcom353003, 351058Średnica 100 mm i średnica 150 mm
100% etanolVWR89125-170

Bibliografia

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zarodki Xenopusgeometryczna morfometriaanaliza wymiar w twarzymapowanie punkt w charakterystycznychanaliza g wnych sk adowychanaliza funkcji dyskryminacyjnejsiatka transformacjiobrazowanie stereoskopowedarmowe oprogramowanie
Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.