Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Summary

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Abstract

Danio pręgowany stał się powszechnie używanym organizmem modelowym do badania mechanizmów leżących u podstaw biologii rozwoju i badania patologii chorób ludzkich ze względu na ich znaczny stopień genetycznej konserwacji u ludzi. Genetyka chemiczna wiąże się z badaniem wpływu małych cząsteczek na proces biologiczny i staje się popularną metodą badań translacyjnych w celu identyfikacji związków terapeutycznych. Danio pręgowany jest szczególnie atrakcyjny do wykorzystania w genetyce chemicznej ze względu na ich zdolność do wytwarzania dużych lęgów przezroczystych zarodków, które są zapładniane zewnętrznie. Co więcej, zarodki danio pręgowanego można łatwo leczyć farmakologicznie poprzez proste dodanie związku do pożywki zarodkowej. Korzystając z hybrydyzacji in situ (WISH), ekspresję mRNA można wyraźnie zwizualizować w zarodkach danio pręgowanego. Razem, wykorzystując genetykę chemiczną i WISH, danio pręgowany staje się silnym kontekstem dla całego organizmu, w którym można określić komórkowe i fizjologiczne efekty małych cząsteczek. Poczyniono innowacyjne postępy w technologiach wykorzystujących procedury badań przesiewowych oparte na maszynach, jednak dla wielu laboratoriów takie opcje są niedostępne lub pozostają zbyt kosztowne. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, jak przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe chemiczne badanie genetyczne, które wymaga podstawowych zasobów i może być wykonane przez pojedynczą osobę lub mały zespół w efektywnym czasie. W związku z tym protokół ten zapewnia wykonalną strategię, która może zostać wdrożona przez grupy badawcze w celu przeprowadzenia genetyki chemicznej u danio pręgowanego, co może być przydatne do uzyskania podstawowych informacji na temat procesów rozwojowych, mechanizmów chorobowych oraz do identyfikacji nowych związków i szlaków sygnałowych, które mają istotne zastosowania medyczne.

Introduction

Identyfikacja skutecznych leków terapeutycznych do leczenia chorób ludzkich jest celem wielu badaczy biomedycznych. Chociaż identyfikacja i charakterystyka potencjalnych środków farmakologicznych do zastosowań klinicznych ma oczywistą wartość dla opieki zdrowotnej, pozostaje ona poważnym wyzwaniem. Ostatecznie rozwój wielu związków terapeutycznych wynika z wiedzy o tym, jak rozwijają się lub funkcjonują określone typy komórek. Danio pręgowany, Danio rerio, jest słodkowodnym teleostem z rodziny Cyprinidae, który stał się głównym nurtem organizmu modelowego w biologii rozwojowej¹. Danio pręgowany to genetycznie podatne kręgowce, które są łatwe w utrzymaniu i manipulowaniu nimi na potrzeby badań naukowych^2,3. Zarodek danio pręgowanego jest przezroczysty, zapłodniony zewnętrznie i może być produkowany w setkach sztuk z jednej dorosłej pary godowej w ciągu zaledwie^{tygodnia 2,3}. Co więcej, danio pręgowany ma wspólne główne układy narządów i wykazuje duże podobieństwo genetyczne do ssaków, w tym do ludzi⁴. Uderzające jest to, że 70% ludzkich genów ma ortolog⁴ danio pręgowanego. Ze względu na to podobieństwo, danio pręgowany był bardzo istotnym systemem eksperymentalnym do badania mechanizmów rozwoju i fizjologii kręgowców i został wykorzystany do podsumowania wielu chorób człowieka^5-7. Te m.in. powody sprawiły, że danio pręgowany stał się idealnym kandydatem do kontynuowania badań genetycznych i zaowocowały stale rosnącym uznaniem dla użyteczności danio pręgowanego w badaniach biomedycznych^6,7.

W ciągu ostatnich kilku dekad u danio pręgowanego rozwinięto mnóstwo narzędzi genetycznych. Genom danio pręgowanego jest podatny na mutagenezę i transgenezę³. Do tej pory przeprowadzono mnóstwo badań genetycznych w przód i w tył, które doprowadziły do wygenerowania ponad 9 000 mutantów³. Ponadto stworzono liczne linie transgeniczne, które umożliwiły znakowanie i izolację określonych typów komórek³. Podjęto znaczne wysiłki w celu scentralizowania i dystrybucji tych zasobów wśród społeczności naukowej, które są dostępne dla laboratoriów po stosunkowo niskich kosztach za pośrednictwem Międzynarodowego Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (ZIRC)⁸. Co więcej, obszerne repozytorium informacji biologicznych i narzędzi molekularnych, począwszy od wzorców ekspresji genów, a skończywszy na sekwencjach i protokołach morfolina, jest stopniowo opisywane w sieci informacyjnej danio pręgowanego (ZFIN)^9-11. Ta infrastruktura badawcza nad danio pręgowanym była możliwa dzięki znacznemu wsparciu NIH i rzecznictwu dla tego modelu zwierzęcego⁸. Ten zbiór mutantów danio pręgowanego, linii transgenicznych i istotnych informacji nadal ma wyjątkową wartość dla całej społeczności badaczy biologicznych. Jednakże, chociaż danio pręgowany jest obecnie dobrze ugruntowanym i wybitnym organizmem modelowym, stanowią one w dużej mierze niewykorzystany rezerwuar do badania biologii rozwojowej i chorób poprzez zastosowanie chemicznych badań genetycznych.

Genetyka chemiczna to użycie małych molekuł, takich jak leki lub inne związki, do wpływania na proces biologiczny w żywym systemie¹². Genetyka chemiczna może być wykorzystana do zrozumienia molekularnych mechanizmów funkcjonowania genów, takich jak identyfikacja czynników, które ratują lub zaostrzają określoną wadę genetyczną¹². Co więcej, genetyka chemiczna stanowi jedną z głównych dróg prowadzenia badań translacyjnych¹². Podczas gdy tradycyjne badania genetyczne w modelach zwierzęcych były niezwykle skuteczne w łączeniu określonych genów z chorobami, brakuje im wymiaru czasowego, co utrudnia, a czasem uniemożliwia obserwację fenotypów, które pojawiłyby się po wczesnej embriogenezie. Ponadto redundancja genów może utrudnić interpretację wyników zaobserwowanych w genetyce postępowej. Alternatywnie, chemiczne badania przesiewowe genetyki pozwalają na precyzyjną kontrolę czasową i jednocześnie stanowią cenny punkt wyjścia do odkrywania leków^12,13.

Genetyka chemiczna może być przeprowadzana za pomocą systemów in vitro (np. linii komórkowych, białek) lub za pomocą systemu in vivo, takiego jak cały organizm. Korzystanie z systemu in vitro w genetyce chemicznej może być korzystne, ponieważ jest prostsze niż system całego organizmu, łatwiejsze do pracy na dużą skalę, mniej kosztowne i mniej czasochłonne. W rezultacie, systemy in vitro pozwalają zarówno na wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS), jak i badania przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS). Korzystanie z systemu in vitro ma wiele zalet, które należy wziąć pod uwagę przy podejściu do genetyki chemicznej, ale także istotne ograniczenia. Jednym z głównych ograniczeń w korzystaniu z linii komórkowej jest to, że małe cząsteczki mogą być skuteczne i nietoksyczne w określonej linii komórkowej, ale stają się toksyczne po wprowadzeniu do całego organizmu. Sedno problemu polega więc na tym, że systemy in vitro nie ujmują szerokiego kontekstu organizmu, a zatem nie zawsze są w stanie dokładnie naśladować to, co dzieje się w całym organizmie. Podczas gdy badania złożone na całych organizmach mogą obejść te problemy, stosowanie modeli całych organizmów ssaków stwarza szereg ograniczeń fizycznych i etycznych. Na przykład badania przesiewowe na obecność narkotyków u myszy są logistycznie utrudnione ze względu na przestrzeń i koszty potrzebne do przetestowania odpowiedniej wielkości próby. Ponadto pytania rozwojowe mogą być trudne do zbadania ze względu na fakt, że ssaki rozwijają się w macicy. Wreszcie, chociaż prowadzenie badań biomedycznych ma ogromną wartość społeczną, to jednak istnieją poważne potrzeby ochrony dobrostanu zwierząt poprzez ograniczenie intensywnych badań i złagodzenie bólu i cierpienia zwierząt wykorzystywanych do badań. Danio pręgowany stanowi realny substytut pracy z wyższymi kręgowcami, takimi jak ssaki, a ponadto wiele tematów można badać przy użyciu genetyki chemicznej w stadium embrionalnym i larwalnym, gdy przetwarzanie neurologiczne jest nieobecne lub działa na niskim poziomie^12,13.

Do tej pory przeprowadzono niezliczone chemiczne badania genetyczne, szczególnie przy użyciu embrionów danio pręgowanego, ponieważ dostarczanie związków można osiągnąć poprzez zanurzenie zarodków w pożywce zawierającej interesujący nas lek^12-15. Co więcej, poczyniono liczne postępy naukowe i technologiczne, dzięki którym chemiczne badania genetyczne są możliwe i możliwe do opanowania^16-20. Peterson i współpracownicy jako pierwsi wykorzystali danio pręgowanego w chemicznym badaniu genetycznym w 2000 roku, a później w 2004 roku zidentyfikowali związek, który hamował mutację koarktacji aorty u danio pręgowanego^21,22. Od tego czasu wdrożono chemiczne badania przesiewowe w celu zbadania kilku rozwijających się tkanek (np. serca, krwi, naczyń krwionośnych)^23-25, funkcji fizjologicznych (np. neurologicznych podstaw zachowania)²⁶, regeneracji dorosłych^27,28 oraz modeli chorobowych (np. dystrofii mięśniowej i raka)^29,30. Spośród tych chemicznych badań przesiewowych danio pręgowanego, odkrycie, że prostaglandyny regulują hematopoetyczne komórki macierzyste, zostało poddane badaniom klinicznym na ludziach, wykazując moc przemieszczania się z "zbiornika do łóżka"^23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Ostatnio pojawiły się obiecujące potencjalne terapie dla złożonych narządów, takich jak nerki, które korygują patologię komórkową w wielotorbielowatości nerek (PKD)³⁴ i ostrym uszkodzeniu nerek^27,35, chociaż nie zostały one jeszcze przeniesione do badań klinicznych. Te chemiczne badania przesiewowe w szerokim zakresie pokazują użyteczność testowania małych związków u rozwijającego się danio pręgowanego oraz zdolność do zastosowania genetyki chemicznej do badania funkcji dorosłych tkanek. Ponadto istnieje rosnąca lista komercyjnie dostępnych kolekcji farmakologicznych, które są dostępne do badań akademickich¹⁹.

W ciągu ostatnich kilku lat nastąpił znaczący postęp w technologii chemicznych badań genetycznych, w tym wykorzystanie zautomatyzowanych systemów robotów do wydawania i obsługi leków, wraz z automatycznymi systemami obrazowania^36-38. Takie systemy dają możliwość badania wielu tysięcy związków w celu uzyskania zarówno HTS, jak i HCS^36-38. Niestety, przeprowadzanie chemicznych badań genetycznych za pomocą tych innowacyjnych przedsiębiorstw robotycznych zazwyczaj wymaga znacznych zasobów. Tego typu zasoby stanowią istotną przeszkodę dla wielu instytucji, które nie mają kapitału na nabycie, prowadzenie i utrzymywanie takiego oprzyrządowania. Podczas gdy stworzenie infrastruktury do zrobotyzowanej obsługi bibliotek chemicznych, w tym przenoszenia zarodków na płytki w układ, pozostaje dla wielu laboratoriów zbyt kosztowne, zautomatyzowane obrazowanie i analiza są ogólnie bardziej dostępne¹². Zautomatyzowane badania przesiewowe obrazu umożliwiają ilościowe określenie fluorescencyjnych reporterów transgenicznych i ułatwiają specyficzną analizę fenotypową^12,15.

Chociaż zautomatyzowane systemy reprezentują użyteczne osiągnięcia technologiczne, wiele pytań można rozwiązać za pomocą bardziej skoncentrowanych ekranów manualnych, takich jak zapytanie o kilka tysięcy biologicznie aktywnych związków w procesie rozwojowym z całościową hybrydyzacją in situ (WISH) odczyt³⁹. Co więcej, podczas gdy coraz więcej laboratoriów korzysta z chemicznych badań przesiewowych danio pręgowanego w celu zbadania pytania badawczego, niewiele (jeśli w ogóle) wysiłków osiągnęło nasycenie, a wiele tematów nie zostało jeszcze naruszonych za pomocą genetyki chemicznej. Badania chemiczne można przeprowadzić przy użyciu małej kolonii danio pręgowanego składającej się tylko z kilku zbiorników typu dzikiego lub transgenicznego. Dlatego ta forma genetycznego przesłuchania powinna być osiągalna dla większości grup badawczych danio pręgowanego zainteresowanych ekspansją/dywersyfikacją na tej arenie. Biblioteki chemiczne o różnej wielkości można nabyć u komercyjnego dystrybutora i/lub współpracowników. Z tych powodów genetyka chemiczna może być ekonomicznie wykonalna nawet w trudnych warunkach finansowania. Istnieją jednak przeszkody na drodze do rozpoczęcia badania przesiewowego genetyki chemicznej, takie jak sposób planowania logistycznych aspektów badania: np. liczba personelu potrzebnego do udanego badania przesiewowego, przydzielenie dedykowanego czasu i opracowanie fizycznego protokołu ręcznego przetwarzania próbek, których liczba wynosi od setek do kilku tysięcy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy ręczny protokół o wysokiej przepustowości do przeprowadzania genetyki chemicznej w zarodku danio pręgowanego z odczytem WISH. Metoda ta polega na leczeniu farmakologicznym zarodków danio pręgowanego, a następnie wykrywaniu transkryptów mRNA za pomocą rybosondy. Korzystając z tego protokołu, mały zespół lub nawet jedna osoba może rozsądnie przebadać i przeanalizować skromną bibliotekę chemiczną około 600 związków w ciągu 9 tygodni.

Protocol

Opisane tutaj procedury pracy z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame. Przedstawiono przewodnik po projekcie badawczym dla tego ręcznego badania przesiewowego małych cząsteczek u danio pręgowanego (ryc. 1). Przegląd metodologii opisanych w niniejszym protokole przedstawiono w postaci schematu blokowego (rysunek 2). Proszę zapoznać się z przykładowym systemem etykietowania (rysunek 3), aby zaplanować etapy przetwarzania zarodków opisane w częściach 4-10. W celu oceny stopnia zarodków należy zapoznać się z serią⁴⁰ oceny zaawansowania danio pręgowanego, a w celu przygotowania antysensownych rybosond WISH stosowanych w częściach 9-10, należy zapoznać się z ostatnio opublikowanymi metodami⁴¹.

1. Przygotowanie komór godowych danio pręgowanego

1. Umieścić dorosłego samca danio pręgowanego i dorosłą samicę danio pręgowanego w komorze godowej, oddzielonych przegrodą komory O/N.
   UWAGA: Krycia masowe, takie jak te z wykorzystaniem grup 2-3 samic i 2-3 samców, mogą generować więcej zarodków w porównaniu z kryciami pojedynczymi parami i mogą być wykonywane w komorach godowych o odpowiedniej wielkości.
2. Powtórz krok 1.1 w taki sposób, aby na każdą 96-dołkową płytkę małych cząsteczek, która będzie testowana, ustawiono łącznie 25 par danio pręgowanego.

2. Kolekcja zarodków danio pręgowanego

1. Następnego dnia usuń przegrodę, która oddziela każdą parę ryb i po 1 godzinie zbierz zarodki danio pręgowanego za pomocą sitka o drobnych oczkach i umieść je na szalce Petriego zawierającej pożywkę dla zarodków E3 (przepis znajduje się w wykazie materiałów).
   UWAGA: Pobranie zarodków po 1 godzinie zapewnia, że zarodki są w podobnym stadium rozwoju.
2. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby usunąć zanieczyszczenia (np. żywność i odpady stałe). Następnie użyj mikroskopu stereoskopowego, aby obserwować każde lęg zarodków i usunąć wszelkie niezapłodnione jaja.
3. Zdekantować pożywkę z zarodków E3 i zastąpić ją świeżą pożywką E3, a następnie umieścić każdą szalkę z zarodkami w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C. Po 2 godzinach obserwuj każdy lęg zarodków za pomocą mikroskopu stereoskopowego i usuń wszelkie niezapłodnione jaja.
   UWAGA: Niezapłodnione jaja mogą zatruwać inne zarodki i będą wydawać się w stadium pojedynczej komórki lub nieprzezroczyste.
4. Kontynuuj monitorowanie postępu rozwojowego zarodków za pomocą stereomikroskopu, aż osiągną 40% epibolii. Obserwuj kształt kuli zarodka, który wydaje się składać z dwóch oddzielnych warstw w 40% stadium epibolii⁴⁰.

3. Przygotowanie chemiczne rozcieńczania

1. Wyjąć płytkę z biblioteki chemicznej z magazynu w temperaturze -80 °C, przykryć folią aluminiową i rozmrozić w temperaturze RT.
   UWAGA: Różne biblioteki będą rozmrażać się w różnym tempie, w zależności przede wszystkim od użytego rozpuszczalnika. Zazwyczaj biblioteka chemiczna zamrożona w temperaturze -80 °C zostanie całkowicie rozmrożona w ciągu około 3 godzin w temperaturze pokojowej. Płytki do rozmrażania należy przechowywać w bezpiecznym miejscu z odpowiednim oznakowaniem materiałów niebezpiecznych. Podczas pracy z chemikaliami należy nosić odpowiednie okulary, fartuch laboratoryjny i dwa zestawy rękawiczek.
2. Użyj 8-kanałowej pipety wielokanałowej, aby dodać 99 μl E3 do kolumn 2-12 płytki 96-dołkowej.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że odpowiedni początkowy zakres leków wynosi od 10 μM do 50 μM, a także zgodnie z opisem w obecnych protokołach³⁹. Tutaj demonstrujemy obróbkę 10 μM przy użyciu płytki wyjściowej biblioteki chemicznej 1 mM.
3. Użyj 8-kanałowej pipety wielokanałowej, aby dodać 1 μl każdego związku do odpowiedniego dołka z E3.
4. Za pomocą P10 odpipetować 1 μl DMSO (lub odpowiedniego rozpuszczalnika) do kolumny kontrolnej (tutaj kolumna 12).
5. Przykryj płytkę do rozcieńczania chemicznego folią aluminiową, ponieważ folia aluminiowa ochroni wszelkie wrażliwe na światło związki w bibliotece, a następnie przywróć podstawową płytkę biblioteki chemicznej do temperatury -80 °C w celu przechowywania.

4. Układanie zarodków danio pręgowanego

1. Wybierz szalkę Petriego zawierającą zarodki danio pręgowanego w 40% fazie epibolii. Za pomocą pipety transferowej ostrożnie umieść około 10 zarodków w każdym dołku płytki 96-dołkowej o głębokości (1,1 ml). Dozować zarodki do kolumn 2-12 głębokiej płytki 96-dołkowej.
   UWAGA: Badacz powinien wybrać punkt czasowy dodawania leku, który jest najlepiej dopasowany do procesu rozwojowego, który chce przesłuchać. Użycie plastikowej pipety transferowej może zminimalizować uszkodzenie zarodków. Ponieważ leczenie farmakologiczne przed 40% epibolią może skutkować zwiększoną śmiertelnością zarodka, należy rozwijać zarodki przez dłuższy czas przed ekspozycją na lek, zwłaszcza gdy badane są późniejsze procesy rozwojowe. Umieszczenie więcej niż 15-20 zarodków w każdym dołku może prowadzić do opóźnienia rozwoju z powodu zatłoczenia i należy tego unikać. Ważne jest, aby pamiętać, że głęboka 96-dołkowa płytka zawierająca zarodki różni się od płytki 96-dołkowej rozcieńczonej chemicznie.
2. Użyj szklanej pipety transferowej, aby usunąć nadmiar E3 z każdej studzienki i wyrzuć nadmiar E3 do pojemnika na odpady płynne.
   UWAGA: Proces ten trwa zwykle od 30 minut do 1 godziny, w zależności od szybkości badacza, więc zarodki są od 50% do 60% epibolii po zakończeniu, co jest docelowym etapem rozwojowym dla dodania opisanego tutaj rozcieńczenia chemicznego. Płytkę można przechylić pod kątem 45°, aby spowodować opadnięcie zarodków na dno studzienki, tak aby końcówka pipety mogła zostać dociśnięta do dna studzienki w celu odciągnięcia nadmiaru E3.

5. Dodanie zabiegów chemicznych

1. Użyj 8-kanałowej pipety wielokanałowej, aby przenieść 100 μl rozcieńczeń chemicznych do odpowiednich dołków w głębokiej 96-dołkowej płytce zawierającej ułożone w układ zarodki danio pręgowanego.
   UWAGA: Upewnij się, że pierwotna lokalizacja studzienki związku jest zgodna z lokalizacją studzienki w odpowiedniej głębokiej płytce 96-dołkowej (np. lokalizacja studzienki B1 na płycie rozcieńczającej chemikalia jest pipetowana do lokalizacji studzienki B1 w głębokiej płytce 96-dołkowej).
2. Zwilż ręcznik papierowy i umieść go w światłoczułym pojemniku wystarczająco dużym, aby pomieścić płytkę 96-dołkową.
   UWAGA: Mokry ręcznik papierowy pomoże zapobiec parowaniu rozcieńczenia chemicznego.
3. Następnie za pomocą maty uszczelniającej uszczelnij głęboką płytkę 96-dołkową, umieść ją w światłoczułym pojemniku i inkubuj w temperaturze 28,5 °C.
   UWAGA: Pozwól zarodkom danio pręgowanego rozwijać się do następnego ranka. Alternatywnie, pozwól zarodkom rozwijać się aż do odpowiedniego etapu rozwoju dla analizowanego procesu.

6. Usuwanie chemikaliów

1. Użyj 8-kanałowej pipety wielokanałowej, aby dodać 300 μl E3 do każdego rzędu studzienek poddanych działaniu leku. Pobrać i wyrzucić rozcieńczenie E3/chemiczne z każdego rzędu studzienek. Umyj zarodki 3 razy 300 μl E3,
   UWAGA: Wyrzuć odpady narkotykowe do oznakowanego pojemnika używanego tylko do tego celu. Aby ułatwić mycie, użyj szklanej miski wypełnionej E3 wystarczająco szerokiej, aby można było korzystać z pipety wielokanałowej.

7. Pronaza i utrwalanie zarodków danio pręgowanego

1. Przenieś zarodki danio pręgowanego za pomocą plastikowej pipety transferowej do czterech 24-dołkowych płytek, a następnie usuń wszelkie martwe zarodki. Oznacz 24 dołki tak, aby odpowiadały pierwotnym lokalizacjom dołków lekowych. Po każdym transferze studzienki należy umieścić pipetę na ciemnym tle, aby uwidocznić zarodki w pipecie i zapobiec krzyżowaniu się zarodków.
2. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby pobrać E3, aby zarodki były ledwo zanurzone w płynie.
3. Użyj szklanej pipety, aby dodać 2 krople bulionu pronazy (50 mg/ml) do każdego dołka. Pozwól zarodkom inkubować w pronazie przez 5 minut, a następnie porusz studzienkami, aby spowodować rozpad kosmówki. Alternatywnie, pronaż zarodki, zanim osiągną pożądany etap rozwoju do analizy.
4. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby dwukrotnie umyć zarodki E3.
5. Gdy zarodki znajdą się na pożądanym etapie analizy, całkowicie odciągnij i wyrzuć pozostały E3.
6. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby dodać świeże 4% PFA/PBS do każdego dołka. Inkubować zarodki w temperaturze 4 °C O/N w celu utrwalenia. Użyj świeżo rozmrożonego PFA do wstępnego utrwalenia zarodków.
   UWAGA: Przejdź do wykonania interesującego Cię testu ekranowego. W sekcjach 8-10 szczegółowo opisano procedurę obróbki płyt sitowych za pomocą WISH. Alternatywne metody można zastąpić według potrzeb, a następnie przejść do sekcji 11 i ocenić wyniki.

8. Permeabilizacja zarodków

1. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby pobrać 4% PFA/PBS z zarodków i umyj zarodki dwukrotnie 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z Tween) PBST. Przenieś zarodki do 48-dołkowych płytek, a następnie odbierz 1x PBST z zarodków. Oznacz płytki 48 dołków, aby pasowały do oryginalnych lokalizacji studni głębokiej płytki 96-dołkowej.
2. Przemyć, dodając 100% metanolu do studzienek za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie odciągnąć ją i ponownie dodać 100% metanolu do zarodków.
3. Umieścić zarodki w temperaturze -20 °C i inkubować przez co najmniej 20 minut. Alternatywnie, należy przechowywać zarodki w 100% metanolu w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
4. Usuń 100% metanol i umyj zarodki 50% MeOH/1x PBST, następnie 30% MeOH/1x PBST, a na koniec dwukrotnie 1x PBST.
   UWAGA: Zarodki starsze niż 24 godziny po zapłodnieniu (hpf) można w tym momencie wybielić w celu usunięcia pigmentacji³⁹.
5. Dodać 15 μl rozmrożonej proteinazy K (10 mg/ml) do 50 ml 1x PBST, aby przygotować roztwór roboczy proteinazy K (5 μg/ml).
6. Usuń 1x PBST z zarodków i dodaj roztwór roboczy proteinazy K. Usunąć proteinazę K po 4 minutach
   UWAGA: Na tym etapie eksperymentator powinien działać szybko, aby zapobiec degradacji zarodka. Stężenie proteinazy K i okres inkubacji muszą być zróżnicowane w zależności od wieku leczonych zarodków⁴¹. Opisane tutaj parametry dotyczą zarodków, które mają 24 hpf.
7. Umyj zarodki 1x PBST, a następnie dodaj lodowate 4% PFA/PBS. Pozwól zarodkom inkubować w 4% PFA/PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

9. Hybrydyzacja i usuwanie sondy

1. Za pomocą szklanej pipety transferowej usuń 4% PFA/PBS i umyj zarodki dwukrotnie 1x PBST. Zastąp 1x PBST 500 μl HYB⁺ i inkubuj zarodki przez 4 godziny w temperaturze 70 °C.
   UWAGA: Wstępną hybrydyzację można wykonywać już przez 2 godziny, ale 4 godziny są idealne. Ponadto różne temperatury hybrydyzacji i prania mogą być idealne dla niektórych sond, takich jak 65 °C, ale powinny być testowane indywidualnie.
2. Wygeneruj rybosondy znakowane digoksygeniną odpowiadające genom będącym przedmiotem zainteresowania⁴¹.
3. Dodać 16 μg rybosondy do 16 ml HYB⁺. Przed użyciem podgrzej roztwór rybosondy/HYB⁺ w temperaturze 70 °C przez co najmniej 20 minut. W przypadku korzystania z wielu sond dodaj 16 μg każdej sondy do tej samej objętości HYB⁺ (16 ml).
4. Za pomocą szklanej pipety transferowej usuń HYB⁺ i użyj P1000, aby dodać 200 μl mieszaniny rybosondy/HYB⁺. Odwróć koktajl rybosondy/HYB⁺ tuż przed użyciem i pipetuj raz w górę i w dół przed dodaniem mieszaniny do każdej studzienki. Użyj barierowych końcówek pipet, aby dodać roztwór rybosondy/HYB⁺, zapobiegając przedostawaniu się pary mieszaniny do pipety.
5. Inkubować zarodki w koktajlu rybosondy/HYB⁺ w temperaturze 70 °C O/N. Użyj folii samoprzylepnej, aby przykryć dołki płytki do inkubacji sondy O/N i wszystkich następujących gorących płukań.
6. Przygotować 50% formamidu/2x SSCT, 2x SSCT i 0,2x SSCT i wstępnie ogrzać w temperaturze 70 °C O/N.
7. Za pomocą P1000 wyjmij rybosondę/HYB⁺ i przechowuj mieszaninę w temperaturze -20 °C. Opcjonalnie użyj ponownie mieszaniny rybosondy/HYB⁺ do trzech razy. Przed każdym ponownym użyciem dodać 3 μg rybosondy do oryginalnej mieszaniny rybosondy/HYB⁺.
8. Za pomocą szklanej pipety transferowej przemyć zarodki dwukrotnie 50% formamidem/2x SSCT przez 30 minut w temperaturze 70 °C. Przemyć zarodki raz za pomocą 2x SSCT przez 15 minut w temperaturze 70 °C. Przemyć zarodki dwukrotnie 0,2x SSCT przez 30 minut w temperaturze 70 °C. Usunąć 0,2x SSCT i przemyć zarodki MABT dwa razy w temperaturze pokojowej.

10. Inkubacja i detekcja przeciwciał anty-digoksygenowych

1. Użyj szklanej pipety transferowej, aby usunąć MABT z każdej studzienki. Za pomocą plastikowej pipety transferowej dodaj świeży roztwór blokowy do każdej studzienki. Pozwól zarodkom inkubować w bloku przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Dodać 8 μl przeciwciała anty-digoksygeninowego do 40 ml roztworu blokowego (rozcieńczenie 5000-krotne).
2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej zastąp roztwór blokowy roztworem przeciwciała/roztworu blokowego. Dodać tyle przeciwciała/roztworu blokowego, aby całkowicie pokryć zarodki.
3. Przykryj płytkę 48-dołkową folią aluminiową, tak aby żadne światło nie mogło przeniknąć do zarodków. Inkubować zarodki O/N w temperaturze 4 °C. Za pomocą szklanej pipety usunąć przeciwciało/roztwór blokowy i przemyć zarodki 10 razy MABT przez 5-10 minut każdy.
   UWAGA: Mycie MABT może być wykonywane w sposób ciągły, ponieważ usunięcie MABT z każdej płytki i dozowanie świeżego MABT do studzienek zajmie badaczowi 5-10 minut.
4. Wygeneruj dwie probówki po 40 ml (łącznie 80 ml) buforu do wstępnego barwienia. Dodać 180 μl NBT (50 mg/ml) i 140 μl BCIP (50 mg/ml) do jednej z przygotowanych probówek buforu do wstępnego barwienia, aby uzyskać roztwór barwiący.
   UWAGA: To roztwór barwiący wygeneruje podłoże w kolorze fioletowym.
5. Zastąp MABT buforem do wstępnego barwienia i pozwól zarodkom inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
6. Zastąp bufor do wstępnego barwienia roztworem barwiącym i pozostaw w temperaturze RT. Monitoruj reakcję kolorymetryczną co 15 minut za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
   UWAGA: Reakcje barwienia mogą trwać od kilku minut do wielu godzin, w zależności od sondy.
7. Zastąp roztwór barwiący 1x PBST po zakończeniu reakcji barwienia, a następnie umyj zarodki dwukrotnie 1x PBST przez 5 minut.
8. Usuń 1x PBST i dodaj 4% PFA/PBS, aby utrwalić zarodki.
   UWAGA: Alternatywnie, wykonaj podwójne ŻYCZENIE, aby wykryć rybosondy znakowane przeciwciałem anty-fluoresceinowym. W przypadku wykonywania podwójnej in-situ, należy pominąć dodawanie 4% PFA/PBS (krok 10.9) po 1x płukaniu PBST (krok 10.8) i myć zarodki dwa razy przez 15 minut 0,1 M glicerolem, dwa razy przez 15 minut z płukaniem MABT, a następnie inkubować zarodki przez 30 minut w bloku. Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało O/N i wykonaj kroki 10.3-10.9 przy użyciu odpowiedniego roztworu barwiącego. Aby wykryć rybosondę znakowaną fluorosceiną, należy przygotować roztwór barwiący z BCIP i INT w celu obserwacji czerwonego podłoża (patrz krok 10.1).

11. Punktacja na płytkach zarodkowych z ekranem chemicznym

1. Wykonaj wizualną ocenę wyników za pomocą mikroskopu stereoskopowego w celu oceny próbek zarodków w teście fenotypu.
2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś zarodki z płytek 48-dołkowych do płytek 12-dołkowych, aby uzyskać optymalną wizualizację. Oznacz płytki z 12 dołkami tak, aby odpowiadały lokalizacjom studzienek z oryginalnej głębokiej płytki 96-dołkowej. Po zakończeniu przesyłania view pod mikroskopem stereoskopowym.
   UWAGA: Reprezentatywne zarodki można wybrać z płytek 12-dołkowych i zobrazować na szkiełkach podstawowych pod szkiełkiem nakrywkowym⁴¹.

Results

Opisane tutaj podejście manualne pozwala pojedynczemu badaczowi na efektywne i skuteczne przeprowadzenie wysokoprzepustowego badania genetycznego małych cząsteczek przy użyciu modelu embrionu danio pręgowanego (Rysunek 1). Korzystając z tej metody, praktyczne jest, aby jedna osoba przeprowadziła badanie przesiewowe genetyki chemicznej, tak aby w ciągu 9 tygodni jedna osoba (zaangażowana w 40-godzinny tydzień pracy) mogła przeprowadzić badanie ~ 600 związków (Rysunek 1). W ten sposób czas pracy przy stole przez jedną osobę może ominąć potrzebę stosowania sprzętu wymagającego dużych zasobów, takiego jak zautomatyzowane systemy. Kompromis polega na tym, że ręczny ekran wymaga kilku tygodni poświęconego wysiłku. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie zautomatyzowanych systemów może skompresować czas potrzebny na roboty do 1-2 tygodni i może wiązać się ze stosunkowo minimalnym wysiłkiem badaczy. Jednym ze sposobów na zwiększenie wydajności i/lub zakresu ręcznego badania przesiewowego jest zatrudnienie łącznie 2-3 badaczy, co umożliwiłoby badania przesiewowe większej liczby związków, różne stężenie związków i/lub badania przesiewowe w krótszym okresie czasu.

Podstawowe kroki związane z protokołem przeprowadzenia badania genetycznego na zarodkach danio pręgowanego z odczytem WISH są zilustrowane jako schemat blokowy (Rysunek 2). Zadania eksperymentalne można podzielić na dwa rodzaje tygodni roboczych: (1) ekspozycja chemiczna i znakowanie zarodków oraz (2) analiza i obrazowanie. W tygodniu pracy nad ekspozycją na chemikalia kroki te obejmują przygotowanie dorosłych ryb danio pręgowanego (dzień 1), pobranie zarodków, ułożenie zarodków i leczenie farmakologiczne (dzień 2), przygotowanie zarodków do hybrydyzacji in situ (dzień 3) i hybrydyzację in situ (dzień 4-6). W tygodniu analizy/obrazowania badacz analizuje ekspresję mRNA, aby ocenić zarodki i trafienia obrazu (dzień 7-11).

Kluczowym elementem przeprowadzania badania genetyki chemicznej jest konsekwentne i dokładne oznaczanie lokalizacji odwiertów. Ze względu na to, że opisany tutaj proces badań przesiewowych genetyki chemicznej polega na wielokrotnym przenoszeniu zestawów zarodków z dołka na jednej płytce do studzienki na innej płytce, potrzeba precyzyjnego i jasnego etykietowania jest kluczowa, tak aby po namierzeniu trafienia chemicznego można było liniowo i łatwo prześledzić jego tożsamość w bibliotece chemicznej (Rysunek 3). Łatwym sposobem, aby to zapewnić, jest oznakowanie płytek w taki sposób, aby w dowolnym momencie lokalizacja dołka dla zestawu zarodków traktowanych związkiem bezpośrednio odpowiadała lokalizacji dołka w bibliotece chemicznej leku dla związku użytego do leczenia tych zarodków (ryc. 3). W tym przypadku zastosowano podwójny system kodowania kolorami i etykiet numerycznych do organizowania próbek, które zostały dodane do płyt sitowych za pomocą trwałych znaczników (ilustracja 3).

Podczas analizowania wyników badania przesiewowego o wysokiej przepustowości, istnieje krytyczna potrzeba opracowania metody poprawnej organizacji, adnotacji i analizy potencjalnych trafień małych cząsteczek. Dlatego badanie przesiewowe genetyki chemicznej musi mieć dokładny i przejrzysty system klasyfikacji, który jest starannie zaprojektowany i ściśle przestrzegany. Taki system powinien w łatwy i kompletny sposób przekazywać ważną dynamikę związku i zapewniać zwięzły sposób prezentacji wyników gotowego ekranu. Jednym ze sposobów skonstruowania takiego systemu jest klasyfikacja zarodków przy użyciu systemu klasowego, który wyjaśniałby ogólną nasilenie morfologiczną i pewność trafienia. Co więcej, kategorie klas mogą być połączone z (⁺) lub (^-) w celu opisania ekspansywnego lub redukcyjnego wpływu na region (regiony) zainteresowania. W tym przypadku zarodki danio pręgowanego poddano działaniu pojedynczych związków z biblioteki bioaktywnej (Enzo Chemicals) od 50% epibolii do 24 hpf, a następnie oznaczono za pomocą WISH przy użyciu koktajlu trzech rybosond w celu wykrycia segmentów nefronu (Figura 4A). Jako przykład system klasyfikacji, studnia zawierająca grupę zarodków, które miały dramatycznie powiększony proksymalny kanalik kręty (PCT) przednercza, nerki embrionalnej danio pręgowanego, spowodowałaby, że związek stosowany w leczeniu tego dobrostanu zostałby sklasyfikowany jako (klasa I), co w tym przypadku reprezentowałoby klasę związaną z najpoważniejszą wadą i najwyższym poziomem zaufania do obserwowanego fenotypu (Figura 4B). Związek byłby następnie opatrzony adnotacjami (PCT) i a (⁺), przy czym pełny zapis to (Klasa I - PCT⁺) (Rysunek 4B). Ta koncepcja klasyfikacji zapewnia prosty i szybki sposób opisania skarbnicy informacji dotyczących małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, w tym nasilenia wpływu związków na organizm, regionu, na który wpływa lek i sposobu, w jaki region ten jest dotknięty (ryc. 4B).

Rysunek 1. Ręczna strategia badań przesiewowych chemicznych zarodków danio pręgowanego. Badacz może w praktyce przetestować 96-dołkową płytkę z chemikaliami na zarodkach danio pręgowanego i przeprowadzić późniejsze przetwarzanie WISH w ciągu jednego tygodnia. Wykonywanie dwutygodniowych testów chemicznych (tydzień 1 (dzień 1-6) i tydzień 2 (dzień 7-12)) można połączyć z trzecim tygodniem poświęconym analizie próbek. Około dwóch 96-dołkowych płytek przesiewowych można ocenić i zobrazować w tygodniu 3 (dzień 13-17). Scenariusz ten sprowadza się do badania przesiewowego około 200 związków w okresie 3 tygodni, co odpowiada małej bibliotece około 600 związków całkowicie przebadanych przez 9 tygodni. Ta ręczna strategia może być modyfikowana w zależności od dostępnych zasobów. Na przykład, trzech badaczy może skrócić czas wykonania badania przesiewowego około 600 związków do 3 tygodni w porównaniu z 9 tygodniami, które zajęłoby to jednemu badaczowi. Strategie badań przesiewowych można dostosować, przypisując badaczy do określonych aspektów badania przesiewowego, takich jak leczenie farmakologiczne i hybrydyzacja in situ, lub kierując badaczy do niezależnego przeprowadzenia całego procesu przesiewowego na oddzielnych częściach biblioteki chemicznej.

Rysunek 2. Schemat blokowy: zestawienie 6-dniowego przepływu pracy na ekranie. Proces przesiewowego badania chemicznego można dyskretnie podzielić na 6 dni. Dzień 1 polega na ustawieniu par godowych danio pręgowanego (=/> 25) w celu dostarczenia zarodków na każdą 96-dołkową płytkę do badań przesiewowych. Dzień 2 polega na pobraniu zarodków z komór godowych i ułożeniu ich w głębokiej 96-dołkowej płytce, a następnie leczeniu farmakologicznym. W 3 dniu zarodki są przygotowywane do WISH, w tym dechorionacji, utrwalenia tkanek i odwodnienia zarodka. Na koniec WISH jest wykonywany na zarodkach do 4-6 dnia. Należy pamiętać, że alternatywne procedury barwienia na utrwalonych próbkach można łatwo zastąpić WISH.

Rysunek 3. Schemat etykietowania transferu płyty. Zarodki danio pręgowanego są układane i poddawane działaniu leków na 96-dołkowej płytce, a następnie przenoszone na 24-dołkową płytkę w celu usunięcia zanieczyszczeń i ekspozycji na pronazę. Zarodki są następnie przenoszone do 48-dołkowych płytek w celu przygotowania zarodków, WISH i utrwalenia tkanek. Następnie zarodki są przenoszone do 12-dołkowych płytek w celu oceny, obrazowania i przechowywania. Precyzyjne układanie zarodków odbywa się dzięki zastosowaniu systemu kodowania kolorami, który umożliwia badaczowi śledzenie pochodzenia substancji chemicznej dla każdej badanej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Przykładowy system klasyfikacji: test segmentacji nerek. Eksperyment WISH umożliwia badaczowi barwienie określonych typów komórek w oparciu o tożsamość wybranych sond, co pozwala na ocenę zmian w fenotypach zarodków w zależności od zmian w lokalizacji i/lub poziomach transkrypcji mRNA. Na przykład trzy segmenty embrionalnej nerki danio pręgowanego, przednercze, zostały oznaczone za pomocą Screen Mix 1. Screen Mix 1 to koktajl sond składający się z wt1b, który specyficznie lokalizuje się w podocytach (P), slc20a1a, który oznacza proksymalny kanalik kręty (PCT) i slc12a1, który oznacza dystalny wczesny (DE) segment⁴⁷. Symbol (⁺) obok etykiety regionu służy do opisywania rozszerzenia lub dodatniego przesunięcia tego regionu, natomiast symbol (^-) służy do dyktowania zmniejszenia regionu. W tym przypadku zarodki leczone lekiem 13-cis RZS mają powiększony proksymalny kanalik kręty i całkowitą utratę dystalnego wczesnego segmentu bez widocznego wpływu na podocyty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Genetyka chemiczna danio pręgowanego może mieć decydujący wpływ na postęp w odkrywaniu leków. Protokół ten zapewnia ręczną, wysokoprzepustową metodę przeprowadzania genetyki chemicznej w zarodkach danio pręgowanego z odczytem WISH, skutecznie umożliwiając indywidualnemu lub małemu zespołowi przeprowadzenie badania przesiewowego małych cząsteczek. Ta metoda oparta na minimalnych zasobach rozszerza wykonalność genetyki chemicznej na wiele grup badawczych. W szczególności ta strategia ekranowa stanowi ważną alternatywę dla stosowania oprzyrządowania zrobotyzowanego, ponieważ takie systemy nie są szeroko dostępne we wszystkich działach badawczych. Ten ręczny ekran umożliwia jednej osobie przetestowanie jednej 96-dołkowej płytki związków z odczytem WISH w ciągu 6-dniowego tygodnia pracy. Ponieważ danio pręgowany jest jajorodny, a zarodki rozwijają się poza rodzicem, a zarodki są wystarczająco duże, aby zobaczyć je gołym okiem (między 1-3 mm), można je obsługiwać ręcznie za pomocą prostych instrumentów, a badacz może układać próbki na płytkach wielodołkowych bez użycia mikroskopu. Ponadto, ponieważ danio pręgowany rozwija się szybko, ekspozycja na małe cząsteczki może być skuteczna przy pojedynczym traktowaniu związku, a nie w powtarzanych dawkach, co minimalizuje dalsze ręczne przetwarzanie. Zarodki danio pręgowanego są łatwe do hodowli, ponieważ ich żółtko stanowi źródło pożywienia do 5-6 dni po zapłodnieniu, co eliminuje komplikacje związane z karmieniem narybku. Dodatkowo w tym okresie większość narządów larwalnych rozwinęła się i stała się funkcjonalna, co daje możliwość zbadania szerokiego wachlarza pytań badawczych. Proste dodawanie małych cząsteczek do pożywki do inkubacji zarodków jest nieinwazyjne i pozwala badaczowi (badaczom) wybrać dawkę leku, czas dodania i czas trwania ekspozycji - zapewniając w ten sposób ścisłą kontrolę nad wieloma zmiennymi i umożliwiając badanie określonych procesów rozwojowych będących przedmiotem zainteresowania. Jak opisano tutaj, przy użyciu tej ręcznej metodologii ekranowej można osiągnąć znaczną produktywność badań w krótkim czasie. Z naszego doświadczenia wynika, że istnieje wysoki zwrot z zainwestowanego wysiłku, który można uwydatnić, wykorzystując znaną bioaktywną bibliotekę chemiczną do analizy interesującego procesu, takiego jak segmentacja nefronów podczas rozwoju nerek (Figura 4; Poureetezadi i Wingert, niepublikowane).

Opisany tutaj ręczny przesiewacz chemiczny jest wyjątkowo wszechstronny, ponieważ obejmuje test na utrwalonych próbkach danio pręgowanego. Na przykład, strategia ta może zostać zmieniona, aby przetestować kilka płytek związków w ciągu jednego tygodnia, a następnie ocenić zarodki w następnym tygodniu. Alternatywne testy na utrwalonych próbkach danio pręgowanego, takie jak immunohistochemia lub inne preparaty do barwienia tkanek, mogą być również zastąpione odczytem WISH. Eksperymentalne strategie przeprowadzania testów komórkowych u danio pręgowanego można dostosować ze względu na przejrzystość optyczną i przezroczystość wczesnych stadiów rozwojowych. Co więcej, naukowcy mogą hamować pigmentację na późniejszych etapach za pomocą chemikaliów lub całkowicie uniknąć komplikacji związanych z rozwojem pigmentu poprzez zastosowanie linii genetycznych bez pigmentu, takich jak kacper lub czysty danio pręgowany¹³. Możliwe jest ręczne podawanie małych cząsteczek, przetwarzanie interesujących nas barwników i ręczna ocena zarodków za pomocą prostego mikroskopu stereoskopowego. Należy jednak pamiętać, że można przeprowadzić automatyczną analizę obrazu, która w rzeczywistości może być wymagana do analizy fenotypu w wysokiej rozdzielczości. Na przykład, lepszym rozwiązaniem może być połączenie zautomatyzowanego systemu analizy obrazu z bezpośrednim testem, takim jak transgeniczny reporter, ponieważ usprawnia to ręczne przetwarzanie próbek, określa ilościowo różnice, które nie są łatwo dostrzegalne gołym okiem, i eliminuje stronniczość badacza¹⁵. Na szczęście niektóre zautomatyzowane systemy obrazowania są zarówno przyjazne dla użytkownika, jak i ekonomiczne pod względem kosztów oprogramowania¹⁵. Zastosowanie i możliwości innych zautomatyzowanych systemów szybko ewoluowały i mogą być wykorzystywane do orientowania organizmów, podawania leków, a nawet do przemieszczania organizmów^12,15. Te zautomatyzowane systemy zwiastowały nową erę technologiczną badań i dostarczyły innowacyjnych rozwiązań do manipulowania dużą liczbą badanych, a tym samym do wykonywania podejść HTS i HCS w całych organizmach^12,15. Chociaż takie maszyny są niezaprzeczalnie przydatnymi narzędziami, są również bardzo kosztowne i są poza zasięgiem wielu podstawowych laboratoriów badawczych. Bez dostępu do tych zautomatyzowanych możliwości może się wydawać, że badania przesiewowe chemiczne nie są możliwe. Jednak protokół ten przedstawia przewodnik dotyczący przeprowadzania ręcznego badania przesiewowego, które można wykorzystać do przeprowadzenia badania przesiewowego genetyki chemicznej w praktyczny sposób w rozsądnym okresie czasu.

Zarówno ręczne badania przesiewowe, jak i genetyka chemiczna w ogóle mają swoje wady i należy o nich pamiętać przy rozważaniu badania przesiewowego chemicznego. W szczególności zademonstrowana tu metoda wymaga umiarkowanego stopnia zręczności fizycznej. Ten problem jest zmniejszony lub całkowicie wyeliminowany poprzez powtarzanie, ponieważ zręczność poprawi się wraz z praktyką. Ponadto istnieje minimalne miejsce na rażący błąd, ponieważ w każdym dołku do analizy znajduje się tylko 10 zarodków. Małe cząsteczki mogą różnić się penetracją indukowanego fenotypu, dlatego należy przestrzegać rozsądnego schematu punktacji w celu identyfikacji interesujących związków. Ważne jest, aby badacze korzystający z tego protokołu opracowali odpowiednio rygorystyczne kryteria dotyczące tego, co uznają za trafienie. Ważne jest również, aby pamiętać, że charakter tej formy badania przesiewowego najprawdopodobniej spowoduje pewną część wyników fałszywie dodatnich, które można określić poprzez dalsze badania chemiczne. Ponadto bardzo ważne jest, aby precyzyjnie inscenizować zarodki i pobierać szpony do badań przesiewowych wkrótce po zapłodnieniu, ponieważ rozwój asynchroniczny może prowadzić do komplikacji w dokładnej ocenie efektów leczenia farmakologicznego. Ponadto, jeśli chodzi o chemiczne badania przesiewowe jako strategię eksperymentalną, istnieje wiele ograniczeń. Rozpuszczalność związków i toksyczność cząsteczek nośnikowych (np. dimetylosulfotlenku (DMSO)) może również stanowić problem i może być zaporowa w testowaniu wielu cząsteczek. Kosmówka może również działać jako bariera dla ekspozycji na leki. Wreszcie, mimo że danio pręgowany jest potężnym i translacyjnym modelem genetyki chemicznej, zawsze należy zachować ostrożność przy określaniu, czy alternatywna strategia badań przesiewowych chemicznych, np. przy użyciu systemu in vitro, takiego jak linia komórkowa, może zastąpić wykorzystanie całych zwierząt. Niemniej jednak leczenie chemiczne w całym systemie danio pręgowanego jest uważane za lepsze niż przeprowadzanie podobnych podejść u ssaków, ponieważ zapewnia przewagę w postaci gromadzenia ogólnoustrojowych skutków związków i może umożliwić naukowcom klasyfikację listy związków do przetestowania w modelu ssaków.

Do tej pory badania przesiewowe substancji chemicznych danio pręgowanego dostarczyły potężnego narzędzia eksperymentalnego do nakreślenia mechanizmów rozwoju i ustalenia potencjalnych środków farmakologicznych do zastosowania w medycynie, takich jak identyfikacja cząsteczek zdolnych do zapobiegania patologiom chorobowym. Na przykład w badaniu przeprowadzonym przez Burnsa i współpracowników opracowano zautomatyzowany test mikrostudzienkowy do pomiaru częstości akcji serca przy użyciu transgenicznych zarodków danio pręgowanego, które wykazywały ekspresję GFP w mięśniu sercowym⁴². Wykorzystali tę transgeniczną linię do analizy rozwijającego się tętna i tego, jak wpłynęło ono na leczenie farmakologiczne⁴². Inne badanie, polegające na testowaniu gęstości populacji hematopoetycznych komórek macierzystych w zarodku danio pręgowanego, wykazało, że prostaglandyna E2 reguluje niszę HSC²³. Odkrycie to zostało potwierdzone na myszy, a następnie wdrożone do testów klinicznych w ludzkich przeszczepach pępowiny^23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Dzięki kilku niedawnym badaniom genetyka chemiczna okazała się przydatna w badaniu chorób nerek przy użyciu danio pręgowanego⁴³. Nerka danio pręgowanego stanowi doskonały paradygmat do badania nefrostenezy lub regeneracji nefronu, jednostki funkcjonalnej, która składa się na nerkę podczas rozwoju i ostrego uszkodzenia nerek⁴³. Struktura nefronu jest wysoce konserwatywna między zarodkową nerką danio pręgowanego a nerką dorosłego ssaka^44-50. Kilka badań dotyczących embrionalnej nerki danio pręgowanego wyraźnie ilustruje jej wrodzony potencjał translacyjny w połączeniu z genetyką chemiczną. Przeprowadzono chemiczne badanie przesiewowe genetyki na dwóch mutantach danio pręgowanego, które zostały zmapowane do genów pkd2 i ift172, o których wiadomo, że odgrywają kluczową rolę w wielotorbielowatości nerek (PKD)³⁴. Badania przesiewowe doprowadziły do zidentyfikowania inhibitora deacetylazy pan-histonowej (HDAC), trichostatyny A (TSA), jako małej cząsteczki, która może zniwelować defekty morfologiczne normalnie obserwowane w zmutowanych zarodkach. Inne podejście przyjęte przez de Groha i współpracowników polegało na badaniach przesiewowych pod kątem związków, które indukowały obrzęk w zarodkach danio pręgowanego typu dzikiego, co wskazywałoby na zakłócenie funkcji nerek³⁵. Po zidentyfikowaniu PTBA jako trafienia, zaobserwowali, że oprócz powodowania obrzęku, PTBA zwiększa również ekspresję pax2a, markera dla komórek progenitorowych nerek. Co ważne, wykazano, że zoptymalizowana pochodna PTBA zmniejsza odsetek śmiertelności dorosłych ryb danio pręgowanych, które uległy uszkodzeniu nerek wywołanemu przez gentamycynę, a ponadto przyspieszyło powrót do zdrowia myszy cierpiących na uszkodzenie nerek²⁷. Podsumowując, te wkłady genetyki chemicznej danio pręgowanego pokazują rodzaje odkryć, których można dokonać przy użyciu metody opisanej w tym protokole.

Chociaż badania w dziedzinie genetyki chemicznej mają istotne zalety, nie są pozbawione pewnych wyzwań. Stosowanie wyłącznie podejścia opartego na genetyce chemicznej może utrudnić określenie konkretnego genu lub genów, na które wpływa związek. Nawet jeśli zostanie znaleziony cel (cele), może pozostać znaczna luka między identyfikacją związku a zrozumieniem mechanizmu (mechanizmów) działania, w którym zachowuje się mała cząsteczka. Na przykład określenie mechanizmu, w którym działa mała cząsteczka, może być trudne, ponieważ pojedynczy związek może wywoływać szereg różnych skutków w organizmie. Jednak wraz z pojawieniem się nowej technologii i przeprowadzaniem większej liczby chemicznych badań genetycznych u danio pręgowanego, problem określenia mechanizmu maleje. Jedną z metod, która może pomóc w określeniu efektów molekularnych zidentyfikowanych związków, jest wybór biblioteki leków znanych substancji bioaktywnych do badań przesiewowych, w których mechanizmy można potencjalnie wydedukować na podstawie wcześniej opisanych danych. Ponadto dostępne są algorytmy chemoinformatyczne, takie jak Discovery gate, które mogą porównywać podobieństwa strukturalne związku z bazą danych związków z przypisanymi mechanizmami¹⁴. Jeszcze innym sposobem wyjaśnienia mechanizmu działania związku byłoby wygenerowanie profilu mikromacierzy po leczeniu, a następnie zapytanie o ten profil w kompilacji profili leków z mikromacierzy, takich jak Connectivity Map, w poszukiwaniu mechanistycznie zdefiniowanych związków, które wywołują podobny efekt¹⁴. Podejście to można również wykorzystać do identyfikacji mutantów genetycznych, które mają podobny efekt jak związek będący przedmiotem zainteresowania. Znalezienie związku między związkiem a mutantem może sugerować, że związek działa molekularnie przed lub za powiązanym genem, który można nakreślić, traktując mutanty związkiem i morfolinami. Inną opcją byłaby spektrometria mas, która staje się coraz bardziej zoptymalizowana pod kątem danio pręgowanego. Metoda ta może być stosowana do wyznaczania określonych zmian białkowych lub modyfikacji potranslacyjnych po leczeniu farmakologicznym. Wreszcie, małe cząsteczki, a nawet całe biblioteki mogą być czasami oznaczane w celu usunięcia partnerów wiążących. Warto również zauważyć, że chociaż mechanizm funkcjonowania małej cząsteczki ma duże znaczenie, istnieją leki zatwierdzone przez FDA, dla których mechanizmy pozostają nieznane.

Chociaż danio pręgowany wykazuje wiele podobieństw do ssaków zarówno pod względem genetycznym, jak i fizjologicznym, nadal istnieje kwestia krzyżowania leków¹⁴. W jednym z badań badano zdolność uderzeń z badania przesiewowego pod kątem inhibitorów cyklu komórkowego w zarodkach danio pręgowanego⁵⁰. Badanie przesiewowe pozwoliło zidentyfikować 14 trafień, o których wcześniej nie wiedziano, że posiadają aktywność cyklu komórkowego. Spośród tych 14 związków, 6 stwierdzono aktywność cyklu komórkowego zarówno w testach hodowli komórek ludzkich, jak i danio pręgowanego, 3 okazały się być inaktywowane surowicą w testach hodowli komórkowych, 1 był aktywny tylko w komórkach danio pręgowanego, a 4 nie wykazywały aktywności ani w testach hodowli komórek danio pręgowanego, ani w testach hodowli komórek ludzkich, ale tylko w całym organizmie danio pręgowanego. Warto zauważyć, że 4 związki, które wykazywały aktywność tylko u danio pręgowanego, pokazują, że istnieją różnice między danio pręgowanym a ssakami, które mogą uniemożliwiać potencjał translacyjny niektórych związków. Jest to ważna kwestia, o której należy pamiętać, jednak istnieją przykłady małych cząsteczek, takich jak PGE₂, która zwiększa zdolność HSC do wszczepiania się u ludzkich biorców i pochodne PTBA, które poprawiają tempo regeneracji nerek u ssaków, dostarczając w ten sposób dowodu na zasadę, że krzyżowanie jest możliwe^23,31-33.

Niezależnie od tych pułapek, genetyka chemiczna i to podejście oparte na minimalnych zasobach mają wiele do zaoferowania społeczności naukowej. Genetyka chemiczna jest szczególnie przydatna w przypadku danio pręgowanego i będzie nadal odgrywać kluczową rolę w badaniu szlaków molekularnych i odkrywaniu leków. Badania przesiewowe chemiczne oparte na dyskretnych celach molekularnych były historycznie narażone na wysoki wskaźnik niepowodzeń ze względu na tak zwaną konstelację właściwości adsorpcji, dystrybucji, metabolizmu, wydalania i toksykologicznego (ADMET)⁵¹. Badania chemiczne wykorzystujące danio pręgowanego do skupienia się na procesie, a nie na dyskretnym celu, mogą obejść kilka problemów związanych z ADMET i zidentyfikować związki, które są skuteczne w kontekście całego organizmu. Wraz z rosnącą pulą zasobów dostępnych do badań nad danio pręgowanym, w tym obecnymi zmutowanymi szczepami i możliwością wykorzystania edycji genomu do tworzenia ukierunkowanych mutantów genetycznych i transgenicznych, istnieje praktycznie nieograniczona liczba potencjalnych chemicznych badań genetycznych z wykorzystaniem danio pręgowanego. Stworzono wiele bibliotek chemicznych, które obejmują kolekcje ze znanymi substancjami bioaktywnymi, nowymi związkami, zróżnicowanymi strukturalnie i strukturalnie podobnymi. Odczynniki te zapewniają wiele ekscytujących możliwości dla kombinacji sito, które są obecnie dostępne i prawdopodobnie będą się dalej rozwijać w nadchodzących latach. Mając te możliwości w ręku, ten ręczny i wysokoprzepustowy protokół zapewnia praktyczny i przyjazny dla użytkownika sposób na zwiększenie zdolności grup badawczych do przeprowadzania chemicznych badań genetycznych z wykorzystaniem danio pręgowanego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l naturalne końcówki do pipet	USA Scientific	1111-3800
1x E3			Generuj przy użyciu 50x E3 i wody DI.
1x PBST			Generuje 0.1% Tween-20 w 1x PBS.
10x	PBS American Bioanalytical	AB11072
12-dołkowe naczynie do barwienia	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
24-dołkowa płytka	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			Generuj 4% PFA (w/v) w 1x PBS - gotuj, a następnie zamrażaj i przechowuj w temperaturze -20 & st. C.
Płytka 48-dołkowa	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			Generuje 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4, 250 mM NaCl i 8,5 mM KCl w wodzie DI.
96 płytka głębinowa	VWR	100-11-940
Mata uszczelniająca 96 dołków	VWR	10011-946
przeciwciało anty-digoksygeninowe	Roche	11-093-274-910	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Zapas BCIP	Sigma	B8503	Generuj 50 mg / ml przy użyciu 100% DMF - zamroź, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni C.
Roztwór			Wygeneruj 50 ml przy użyciu 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS i 35 ml MABT. (Rozmrażanie BSA i FCS w temperaturze 37 stopni Celsjusza)
Zapas BSA (albuminy surowicy bydlęcej)	AB00448	Bioanalityczny	Wytwarzaj 10% BSA, mieszając płatki BSA w MAB w temperaturze pokojowej, a następnie zamroź i przechowuj w temperaturze -20 stopni C. (Niewykorzystane płatki BSA należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza).
Rybosonda znakowana DIG/FLU Odczynniki do reakcji transkrypcyjnej in vitro	Roche	11175025910; 11685619910	Skonsultować się z procedurą producenta.
DMF (dimetyloformaldehyd)	Amerykański inhibitor	DNazy 1 AB00450
, 10x bufor DNazy 1	Roche	4716728001
naczynie do inkubacji zarodków	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
Etanol (EtOH)	Sigma	E7023	Wygeneruj 50 ml 70% EtOH o klasie cząsteczkowej H2O i 100% EtOH, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni C.
FCS (płodowa surowica cielęca)	Invitrogen	16140089	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
jednostka sterylizacji	filtrów Corning	430516	0,45 μ m CA / 1 L
objętości drobne kleszcze	Roboz	RS-1050
płaskodenna probówka mikrowirówkowa	VWR	87003-300; 87003-298
	Formamid Amerykański AB00600 bioanalityczny		Przechowywać w temperaturze -20 & st. C.
szklana miska 90 x 50	Kimax Kimble	23000
szklana pipeta	VWR	14673-010
szklana fiolka	Wheaton	225012
glicerol	Sigma	G7893
glicyna	Sigma	G8898
glikogen	Roche	10901393001
HYB+			Generuj 50% formamidu, 0,1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg / ml RNA toruli drożdżowej i 50 μ l/μ l heparyna
INT zapas	Sigma	I8377	Generuj 55 mg / ml przy użyciu 70% DMF i 30% H2O - zamroź, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
MAB			Generowany przez dodanie 55,0 g zasady Trisma, 8 ml 1 M Tric-HCl pH 9,5, 23,2 g kwasu maleinowego i 17,5 g NaCl do 1,5 l dejonizowanego H2O. Następnie napełnij dejonizowanym H2O do 2 l i autoklaw.
MABT			Generuj 0,1% Tween-20 w MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
siatkowy sitko do herbaty	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
woda destylowana klasy molekularnej	Mediatech	25-055-CM
wielokanałowa pipeta 0,5 - 10 i #956; l	Eppendorf	3122000.019
wielokanałowa pipeta 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stock	Sigma	N6876	Generuj 50 mg / ml przy użyciu 70% DMF i 20% H2O - zamrażaj, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni C.
paraformaldehyd	Usługi mikroskopii elektronowej	19210
Klej foliowy PCR	Eppendorf	30127.48
na płytki (piórnik)	Bufor
			(Za każdym razem przygotuj świeże do użycia.)
Pronase	Roche	11459643001	Generuj 50 mg / ml za pomocą E3, zamrażaj, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni C.
Proteinaza K	Roche	03-115-879-001	Wygeneruj 10 mg / ml w wodzie DI, a następnie zamroź i przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Inhibitor RNazy 1	Roche	3335399001
gumowa bańka	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
roztwór barwiący-fioletowy	NIE	DOTYCZY NIE DOTYCZY	Generowanie przy użyciu 45 i #956; l z NBT i 35 μ l BCIP na każde 10 ml potrzebne w buforze do wstępnego barwienia.
roztwór barwiący-czerwony			Generuj przy użyciu 31,5 i #956; l z INT i 35 μ l BCIP na każde 10 ml potrzebne w buforze do wstępnego barwienia.
mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ645, SMZ1000
Polimeraza RNA T3	Roche	11031171001
Polimeraza RNA T7	Pipeta	10881775001
	Samco	202, 204
Tween-20 zapas	Amerykańska bioanalityczna	AB02038
kąpiel wodna	Thermo	51221073	Model # 2831)