Artykuł metodologiczny

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52067

⸱

28 marca 2015

 ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S Environmental Protection Agency, 2Technical Support Center, Office of Ground Water and Drinking Water, U.S Environmental Protection Agency

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Streszczenie

Metoda EPA 1615 została opracowana w celu zapewnienia standardowej metody pomiaru enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Znormalizowany składnik metody do pobierania próbek koncentruje wirusy, które mogą być obecne w wodzie, poprzez przejście przez minimalną określoną objętość wody przez elektrododatni filtr z wkładem. Minimalne określone objętości dla wód powierzchniowych i wykończonych/gruntowych wynoszą odpowiednio 300 l i 1 500 l. Głównym ograniczeniem metody jest tendencja do zapychania się filtrów przed spełnieniem wymagań dotyczących objętości próbki. Badania z użyciem dwóch różnych, ale równoważnych opcji filtrów z wkładem wykazały, że zatkanie filtra stanowiło problem w przypadku 10% próbek z jednym z typów filtrów w porównaniu z 6% w przypadku drugiego typu filtra. Zatykanie ma tendencję do zwiększania się wraz ze zmętnieniem, ale nie można go przewidzieć wyłącznie na podstawie pomiarów zmętnienia. Z punktu widzenia kosztów jedna z opcji filtracji jest lepsza od drugiej, ale przy wyborze filtrów należy wziąć pod uwagę jakość wody i doświadczenie z systemem wodnym, z którego ma być pobierane próbki.

Wprowadzenie

Ludzkie wirusy jelitowe replikują się w przewodzie pokarmowym i rozprzestrzeniają się drogą fekalno-oralną. Wirusy te często znajdują się w ściekach w wysokich stężeniach 1-3. Mogą utrzymywać się w ściekach ściekowych 4,5 oraz na powierzchni 6,7, gruntach 8-10 i oczyszczonych 11 wodach pitnych. Jeśli wirus jest obecny, stężenie w wodach środowiskowych w USA jest zazwyczaj zbyt niskie, aby można było dokonać bezpośredniego pomiaru 12,13. Wymaga to, aby wirusy były skoncentrowane z dużych ilości wody. Podczas monitorowania Information Collection Rule (ICR) prowadzonego przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (USEPA) 14, stężenia wirusa w próbkach dodatnich w wodzie źródłowej dużych zakładów użyteczności publicznej w całym kraju wahały się od 0,009 do 19,7 najbardziej prawdopodobna liczba jednostek zakaźnych (MPN)/L. Mediana i średnie stężenia próbek dodatnich wynosiły 0,03 i 0,17 MPN/L dla wód źródłowych z płynących strumieni, 0,01 do 0,07 MPN/L dla tych z jezior i zbiorników wodnych oraz od 0,04 do 0,74 MPN/L dla tych korzystających z wód podziemnych 11 (dane z bazy danych ICR Aux1 18-miesięcznego dostępu z dnia 25.04.2000). Stężenia wirusa w dodatnich próbkach z badania USEPA krajowych wód gruntowych wahały się od 0,009 do 2,12 jednostek zakaźnych/l, przy medianie i średnich stężeniach 0,13 i 0,29 jednostki zakaźnej/l 8. Stężenie wirusa w dodatnich próbkach wód gruntowych było wyższe niż w płynących strumieniach. Większość obiektów wykorzystujących wody gruntowe w tych badaniach pozyskiwała wodę z warstw wodonośnych zlokalizowanych w rejonach krasowych. Te, wraz z tymi zlokalizowanymi w środowisku wapiennym i krystalicznym (spękanym podłożu skalnym), prawdopodobnie mają wyższe stężenia wirusa niż w innych środowiskach 8,15,16. Metody USEPA dotyczące wirusa określają objętość próbek od 200 l (ICR) do 300 l (metoda 1615) wód powierzchniowych i od 1 000 l (ICR) do 1 500 l (metoda 1615) wód gruntowych 17,18. Jednak nawet przy użyciu dużych objętości próbek, większość próbek wód powierzchniowych i gruntowych jest ujemna na obecność wirusa 8,11,19,20.

Wirusy obecne w wodach powierzchniowych stanowią potencjalne zagrożenie dla zdrowia konsumentów wody pitnej. Zasada uzdatniania wód powierzchniowych wymaga, aby wszystkie oczyszczalnie wykorzystujące wodę powierzchniową zmniejszyły stężenie wirusa o co najmniej 4 logarytmy. Nawet przy redukcji o 4 logarytmy, stężenie wirusa infekcyjnego w wodzie źródłowej wynoszące zaledwie 0,0044 MPN/L może prowadzić do jednej infekcji dziennie, przy założeniu takich średnich warunków ekspozycji i leczenia oraz parametrów reakcji na dawkę dla rotawirusa 11,21. Ryzyko związane z wirusem w nieoczyszczonych wodach gruntowych może być jeszcze większe ze względu na brak leczenia i występowanie wirusa. Borchardt i współpracownicy szacują, że do 22% ostrego zapalenia żołądka i jelit u dorosłych i 63% u dzieci poniżej piątego roku życia może być spowodowane wirusem w wodzie pitnej w społecznościach korzystających z nieoczyszczonych wód gruntowych.

Metoda 1615 USEPA została opracowana do wykrywania enterowirusów i norowirusów podczas trzeciego cyklu monitorowania nieuregulowanych zanieczyszczeń (UCMR3) 22 jako krajowa kontynuacja ustaleń Borchardta i współpracowników 19,23. Metoda USEPA została zaprojektowana przede wszystkim do pomiaru wirusa w systemach wykorzystujących nieoczyszczone wody gruntowe, ale została napisana bardziej ogólnie, aby uwzględnić inne typy matryc wodnych. Nowa metoda jest hybrydą zachowującą wiele składników z poprzedniej metody wirusowej stosowanej podczas ICR 17, dodanie procedur molekularnych opartych na metodzie Borchardta i wsp. 19,23 oraz dodatkowe zestawy starterów dla norowirusa 24. Celem niniejszego artykułu jest opisanie procedury pobierania próbek oraz kroków niezbędnych do utrzymania integralności próbki podczas pobierania i transportu. Ocena całej metody jest opisana w Cashdollar et al. 25. Protokół ten obejmuje proste zbieranie wód powierzchniowych i gruntowych w terenie, w przypadku gdy pompa i filtr wstępny nie są konieczne i w przypadku których nie są wymagane regulacje pH lub obecności środka dezynfekującego w wodzie, z której mają być pobrane próbki. Bardziej złożone wymagania dotyczące pobierania próbek opisano w Fout i wsp. Rozdział 17,18.

Protokół

1. Procedury wstępne

  1. Zamontuj standardowe urządzenie filtrujące, jak pokazano na rysunku 1, składające się z modułu wlotowego, modułu obudowy wkładu i modułu wyładowczego, jak opisano w Materiały dodatkowe.
  2. Przed pierwszym użyciem skalibrować przepływomierz/licznik przy natężeniach przepływu stosowanych do pobierania próbek. Sprawdź kalibrację po pierwszym użyciu, a następnie po miesiącu użytkowania. Jeśli kalibracja natężenia przepływu uległa zmianie po pierwszym użyciu lub po pierwszym miesiącu użytkowania, należy określić częstotliwość kontroli kalibracji zgodnie z opisem w Materiałach dodatkowych.
    1. Podłącz moduł tłoczny do modułu wlotowego, a następnie podłącz moduł wlotowy do kranu. Ustaw przepływomierz/sumator tak, aby odczytywał natężenie przepływu. Całkowicie odkręć kran, a następnie wyreguluj natężenie przepływu na 10 l/min za pomocą brązowego zaworu kulowego. Gdy natężenie przepływu ustabilizuje się na poziomie 10 l/min, zresetuj przepływomierz/licznik, aby odczytać całkowitą objętość.
    2. Umieść wylot modułu wyładowczego w cylindrze z podziałką o pojemności 4 l lub większej i jednocześnie zresetuj licznik do zera. Zmierz odczyt sumatora na znaku 4 l i czas potrzebny do osiągnięcia znaku 4 l na butli. Zmień ustawienie przepływomierza/sumatora z powrotem na natężenie przepływu.
      UWAGA: Jeśli natężenie przepływu spadło poniżej 9.95 l lub wzrosło do ponad 10.05 l po wykonaniu kroku 1.2.2, poczekaj, aż natężenie przepływu się ustabilizuje i powtórz krok 1.2.2. Prawidłowo skalibrowany miernik osiągnie znak 4 l na cylindrze z podziałką po 24 ± 1 sekundzie z odczytem sumatora 4,0 ± 0,04 l.
    3. Jeśli odczyt sumatora jest mniejszy niż 3,96 lub większy niż 4,04 l, oblicz współczynnik korekcyjny potrzebny do skorygowania o obserwowaną różnicę. Na przykład, jeśli przepływomierz/licznik wskazuje 3,9 l w znaku 4 l na cylindrze z podziałką, współczynnik korekcyjny wyniesie 1,026 (4 ÷ 3,9). Tak więc, jeśli pożądana objętość próbki terenowej wynosi 300 l, objętość pobrana zgodnie z odczytem na przepływomierzu/sumatorze powinna wynosić 300 ÷ 1,026 = 292,4 l.
  3. Wysterylizuj standardowy aparat filtrujący i przygotuj go do pobrania próbki.
    1. Przed każdym użyciem sterylizować moduły wlotowe i wkłady 0,525% podchlorynem sodu przez co najmniej 30 minut, całkowicie zanurzając moduły w roztworach lub cyrkulując podchloryn sodu przez moduły za pomocą pompy. Przepłukać moduły sterylnymdH2O, a następnie odchlorować w roztworze zawierającym 50 ml 1 M tiosiarczanu sodu na litr sterylnej wody odczynnikowej przez 5 minut. Przykryj końce modułu aparatu do pobierania próbek filtra sterylną folią aluminiową.
    2. Dodać elektrododatni filtr nabojowy do modułu obudowy wkładu aseptycznie.
      UWAGA: Należy upewnić się, że filtr nabojowy jest prawidłowo osadzony w obudowach. Prawidłowo osadzone filtry nie będą przeciekać, a filtr nie będzie się poruszał w obudowie po potrząśnięciu. Uszczelki na prawidłowo osadzonym filtrze będą miały widoczne wgłębienia pokazujące, gdzie filtr się z nimi styka. Uszczelki należy zawsze sprawdzać pod kątem wgłębień natychmiast po wyjęciu filtra z obudowy.
    3. Zapisać niepowtarzalny numer próbki w karcie danych próbki (przykład znajduje się w materiałach uzupełniających), a następnie zabrać lub wysłać aparaturę do pobierania próbek z filtrem oraz kartę danych próbki do osoby, która będzie pobierać próbkę terenową, wraz z wszelkimi niezbędnymi instrukcjami dotyczącymi pobierania próbki (np. objętość próbki, miejsce pobierania próbek itp.).

2. Przygotowanie do pobrania próbki w miejscu pobierania próbek

  1. Po przybyciu do miejsca pobrania należy umyć ręce i założyć rękawice chirurgiczne, aby zminimalizować możliwość zanieczyszczenia próbki. Nie pobieraj próbek, jeśli występują objawy jelitowe lub oddechowe. Często zmieniaj rękawice, a zwłaszcza po dotknięciu kranów z wodą i innych przedmiotów, które mogą być zanieczyszczone.
  2. Zapisz odpowiednie informacje o śledzeniu próbki w przykładowym arkuszu danych. Istotne informacje obejmują identyfikację miejsca i próbki, nazwę próbnika oraz modele urządzeń i numery seryjne.
  3. Odkręć kran na 2–3 minuty, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które osiadły w linii. W razie potrzeby użyj węża ogrodowego lub rurki, aby dotrzeć do odpływu na tym etapie.
  4. Jeśli moduły aparatury do pobierania próbek są podłączone, odłącz je i zabezpiecz otwarte końce modułu obudowy wkładu sterylną folią. Podłącz moduł tłoczny do modułu sssącyego, a następnie podłącz oba do kranu. Podłącz wąż ogrodowy na końcu modułu wyładowczego i umieść wolny koniec w pojemniku polipropylenowym o pojemności 1 l.
  5. Odkręcić kran i przepuścić przez aparat co najmniej 75 l wody, z której ma zostać pobrana próbka.
    1. Zmierz i zapisz parametry jakości wody w okresie spłukiwania wody wpływającej do pojemnika polipropylenowego - pozostałość chloru, pH, temperaturę i zmętnienie.
    2. Po zakręceniu dopływu wody z kranu należy odłączyć moduł wyładowczy od modułu doprowadzającego, a następnie podłączyć moduł obudowy wkładu do wylotu modułu doprowadzającego oraz moduł odprowadzający do wylotu modułu obudowy wkładu. Zresetuj odczyt sumatora do zera.

3. Pobieranie próbek terenowych

  1. Zapisz początkowy odczyt sumatora wraz z datą i godziną, a następnie powoli odkręć kran.
    1. Upewnij się, że obudowa wkładu znajduje się w pozycji pionowej i że całkowicie napełnia się wodą. Niektóre obudowy są wyposażone w przycisk odpowietrzania, który można nacisnąć, aby usunąć powietrze z obudowy podczas procesu napełniania.
    2. Całkowicie odkręć kran. Ustaw natężenie przepływu na 10 l/min za pomocą brązowego zaworu kulowego, a następnie zapisz początkowe natężenie przepływu.
  2. Przepuścić 300 l wody powierzchniowej lub 1,500 do 1,800 l wód gruntowych przez aparat, korzystając z odczytów sumatora (zgodnie z regulacją, jeśli to konieczne). Jeżeli filtr zatka się przed osiągnięciem wymaganej objętości i pobrano więcej niż połowę objętości, należy użyć drugiego modułu obudowy filtra, aby pobrać pozostałą próbkę, jeśli jest dostępny.
  3. Obserwuj natężenie przepływu, gdy objętość próbki zbliża się do końca okresu pobierania próbek, a następnie wyłącz przepływ wody w kranie z próbką. Zapisz końcowe natężenie przepływu, datę, porę dnia, końcowy odczyt sumatora i całkowitą objętość próbki.
  4. Odłączyć aparat do pobierania próbek z filtrem od kranu. Odłącz moduł obudowy kasety od innych modułów.
    1. Odwróć obudowę (obudowy) filtra do góry nogami i pozwól, aby nadmiar wody wypłynął, aż woda przestanie spływać zarówno z otworu wlotowego, jak i wylotowego.
    2. Obróć obudowę do góry i przykryj szybkozłączki na każdym końcu sterylną folią aluminiową. Umieść obudowę w jednej lub kilku zamykanych plastikowych torebkach.
    3. Spuść wodę z modułów wlotowych i wylotowych. Umieść moduły w jednej lub kilku zamykanych plastikowych torebkach.

4. Wysyłka próbek terenowych

  1. Umieść moduły filtracyjnej aparatury do pobierania próbek w izolowanej chłodziarce magazynowej i transportowej.
  2. Dodaj zamrożone opakowania z lodem lub podwójnie zapakowane kostki lodu do chłodziarki do przechowywania i transportu, aby upewnić się, że próbka pozostanie w temperaturze 1-10 °C podczas transportu. Dwa duże lub 6-8 małych okładów z lodu powinny wystarczyć.
  3. Umieść urządzenie rejestrujące temperaturę w izolowanej skrzyni do przechowywania i transportu w miejscu niestykającym się z okładami z lodu lub workami z lodem.
    UWAGA: Urządzenie rejestrujące temperaturę jest opcjonalne, jeśli laboratorium analityczne będzie używać wizualnego termometru na podczerwień do pomiaru temperatury obudowy wkładu natychmiast po przybyciu i otwarciu pojemnika.
  4. Wypełnij pustą przestrzeń materiałem opakowaniowym, a następnie umieść przykładową kartę katalogową, zabezpieczoną w zamykanej plastikowej torbie, na wierzchu. Zamknij izolowaną skrzynię do przechowywania i transportu i przyklej ją taśmą, aby zapobiec wyciekowi wody.
  5. Próbkę należy przetransportować lub wysłać do laboratorium analitycznego. Należy zapewnić, aby próbka dotarła do laboratorium analitycznego nie później niż 24 godziny po rozpoczęciu pobierania próbek z pola (tj. w czasie zarejestrowanym w kroku 3.1).

Wyniki

Zapychanie filtra jest głównym potencjalnym problemem, który może wystąpić podczas stosowania Metody 1615. Zapychanie zmniejsza szybkość przepływu wody przez filtr. W niektórych przypadkach można temu zaradzić poprzez otwarcie zaworu grzybkowego, aby umożliwić większy przepływ. W innych sytuacjach filtr może zostać całkowicie zapchany, zanim przez niego przepłynie wymagana objętość. Tabela 1 przedstawia odsetek próbek o zmniejszonej objętości w zależności od rodzaju filtra, rodzaju wody i mętności. Zapychanie występowało zarówno w próbkach wód podziemnych, jak i powierzchniowych, przy czym filtr na bazie nanowłókien tlenku glinu okazał się skuteczniejszy w przypadku próbek wód podziemnych, natomiast w przypadku wód powierzchniowych sytuacja była odwrotna. Ogółem 6% próbek pobranych przy użyciu filtra na bazie aminy czwartorzędowej miało niewystarczającą objętość, podczas gdy 10% próbek pobranych za pomocą filtrów na bazie nanowłókien tlenku glinu nie osiągnęło wymaganej minimalnej określonej objętości z powodu zapchania. Generalnie zapychanie nasilało się wraz ze wzrostem mętności, jednak na mętność wpływa szereg różnych składników, z których niektóre nie prowadzą do zapychania. Na przykład 43% wszystkich przypadków zapchania podczas badania ICR ograniczało się do dwóch systemów rzecznych (dane nie przedstawiono). Podczas ICR minimalna objętość docelowa dla wód powierzchniowych wynosiła 200 L. Średnia objętość pobrana podczas badania wynosiła 217 ± 32 L, a mediana objętości wyniosła 208 L (dane z bazy danych ICR Aux1 z 18-miesięcznego dostępu z dnia 25.04.2000 r.). Zatem pełna objętość może być pobrana z wielu zbiorników wodnych nawet przy wysokiej mętności.

ICR wymagało od pobierających próbek stosowania wstępnego filtra w przypadku mętności powyżej 75 NTU, jednak nawet przy zastosowaniu wstępnego filtra 34% próbek pobranych z wód o mętności powyżej 75 NTU uległo zapchaniu. Metoda 1615 zaleca stosowanie wstępnego filtra przy mętności wód powyżej 50 NTU; jednak od czasu publikacji Metody 1615 przetestowano kilka różnych opcji filtrów wstępnych poza tym wymienionym w metodzie. Żaden z nich nie przyniósł znaczącej poprawy w zakresie objętości próbki (dane nie przedstawiono).

Schemat systemu filtracji wody pokazujący moduły doprowadzające, obudowę wkładu i odprowadzające.
Rysunek 1. Standardowy aparat filtrujący. Standardowy aparat filtrujący składa się z modułów doprowadzających, obudowy filtra oraz modułów odprowadzających (opis każdego modułu znajduje się w Materiałach uzupełniających). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Całkowita liczba próbek aLiczba próbek niedostatecznych bProcent próbek niedostatecznychMętność (NTU)
Wody podziemne przy użyciu filtrów NanoCeram c
11311< 20
Wody powierzchniowe przy użyciu filtrów NanoCeram c
831214< 20 d
845020 - < 50
6583≥ 50 d
Suma NanoCeram c
2102210≥ 0
Wody podziemne przy użyciu filtrów 1MDS c
3747520< 20
Wody powierzchniowe przy użyciu filtrów 1MDS c
2,693271 e< 20 e
505367 f20 - < 50 f
1221916 e50 - < 75 g
1756034 e,f≥ 75 e,f,g
Suma 1MDS c
3,8692176≥ 0

Tabela 1. Wydajność filtra. a Próbki pochodzą z następujących badań, dla których dostępne są dane dotyczące objętości i mętności: 1) badanie ICR USEPA (dane z bazy danych ICR Aux1 z 18-miesięcznym dostępem z dnia 25.04.2000), 2) badanie wód podziemnych USEPA 8, 3) badanie USEPA w Lawrence i Lowell, MA (dane niepublikowane), 4) badanie rzeki Mississippi USEPA (dane niepublikowane), 5) badanie stacji uzdatniania wody pitnej USEPA (dane niepublikowane), 6) badanie ewaluacyjne metody 1615 USEPA 25 oraz 7) pierwsze trzy miesiące monitoringu UCMR3 (dane niepublikowane). b Próbki, w których filtr zapchał się przed zebraniem minimalnej objętości wody określonej dla każdego badania. Wynosiła ona 200 L dla wód powierzchniowych i 1 500 L dla wód podziemnych, ale wynosiła 200 L dla wód źródłowych będących wodami podziemnymi w ramach ICR USEPA oraz 1 893 L dla badania wód podziemnych USEPA. c Zdolność do zebrania pełnej minimalnej określonej objętości różni się istotnie dla próbek pobieranych przy użyciu filtrów NanoCeram i 1MDS (P = 0,002) oraz pomiędzy wodami powierzchniowymi a podziemnymi zarówno ogółem (P < 0,001), jak i dla każdego typu filtra (P < 0,001) przy zastosowaniu testu sum rang Manna-Whitneya. d – g Grupy z tym samym indeksem nadstawionym różnią się istotnie (P < 0,05) zgodnie z jednoczynnikową analizą wariancji rang Kruskala-Wallisa i procedurą wielokrotnych porównań parzystych Dunna. Dla wszystkich testów statystycznych zmienną zależną jest objętość przepuszczona przez filtr jako ułamek minimalnej określonej objętości, przy maksymalnej wartości 1,0.

Dyskusja

Na przestrzeni lat stosowano różne typy filtrów do zagęszczania wirusów z wód środowiskowych 26 . Obecne metody wykorzystują ultrafiltry 27, filtry elektroujemne 13,28,29, filtry z waty szklanej 23 i filtry elektrododatnie 30. Filtry elektroujemne były szeroko stosowane przez wiele lat, ale wymóg dodawania soli i regulacji pH wody w terenie przed lub w trakcie pobierania próbek ogranicza ich przydatność 13. Najbardziej praktycznym wyborem filtrów do pobierania próbek w terenie są filtry elektrododatnie. Filtry te umożliwiają pobieranie próbek dużych ilości wody przy dużych natężeniach przepływu i bez kondycjonowania wody. Filtry z waty szklanej są najtańszą opcją, ale mają wolniejsze natężenie przepływu niż filtry elektrododatnie i nie są dostępne na rynku. Ultrafiltry zapewniają najwyższy poziom odzysku wirusa w szerokim zakresie jakości wody, ale sprzęt wymagany do pobierania próbek nie jest łatwy do przenoszenia w terenie, a czas potrzebny do pobrania próbek jest znacznie dłuższy 27. Niedawno opracowano metody, które wykorzystują wstępnie kondycjonowane filtry elektroujemne, aby uniknąć konieczności regulacji w terenie, ale mogą one nie mieć zastosowania do pobierania dużych objętości próbek 28,29.

Metoda EPA 1615 wykorzystuje elektrododatnie filtry wkładowe, które uzyskują swój dodatni ładunek z nanowłókien tlenku glinu lub amin czwartorzędowych. Przewaga pierwszego z nich nad drugim polega na tym, że jest tańszy i skutecznie zbiera wirusa z wód w szerszym zakresie naturalnych wartości pH 30,31; jednak każdy wkład, a także filtry z waty szklanej używane przez Borchardta i współpracowników dają podobne odzyski enterowirusa i norowirusa z wody 23,31,32 (Cashdollar, dane niepublikowane). Filtry kasetowe są umieszczane w prostym aparacie do pobierania próbek, który został zaprojektowany w celu uproszczenia pobierania próbek i zmniejszenia zanieczyszczenia podczas pobierania próbek.

Standardowe metody są nieocenione, gdy prowadzone są duże badania z wykorzystaniem wielu laboratoriów analitycznych. Metoda EPA 1615 zawiera standardowe procedury i wytyczne mające na celu zminimalizowanie dwóch głównych problemów związanych z pobieraniem próbek, które mogą mieć wpływ na dane zebrane podczas tych badań - fałszywie dodatnich wyników wynikających z zanieczyszczenia podczas pobierania próbki lub z nieodpowiednio zdezynfekowanych elementów aparatury oraz zatkania porów filtra przez składniki w wodzie, z której pobierana jest próbka.

Tak jak wirusy jelitowe mogą przenosić się z człowieka na człowieka z powodu nieodpowiedniej higieny, tak wirusy mogą być wprowadzane do próbek pochodzących ze źle umytych rąk lub rąk w zanieczyszczonych rękawiczkach 33. Istotne jest, aby osoby pobierające próbki rozumiały potencjalne drogi zanieczyszczenia i stosowały technikę aseptyczną podczas pobierania próbek. Próbniki powinny rozumieć, że rękawice są używane przede wszystkim w celu ochrony próbnika przed narażeniem, a nie w celu ochrony aparatury przed zanieczyszczeniem. Ręce należy umyć przed rozpoczęciem pobierania próbek, a podczas zakładania rękawic należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu dłoni o rękawice. Osoby pobierające próbki z zapaleniem żołądka i jelit lub objawami ze strony układu oddechowego nie mogą pobierać próbek, ponieważ mogą one wydalać enterowirusy lub norowirusy w dużych ilościach.

Po drugie, należy zachować ostrożność, aby zapobiec przenoszeniu wirusa z poprzednich przypadków pobierania próbek. Aby zminimalizować to potencjalne źródło zanieczyszczenia, aparatura do pobierania próbek w metodzie 1615 została zmodyfikowana w stosunku do aparatury ICR poprzez niewłączenie regulatora ciśnienia i miernika ciśnienia między wlotem a modułem obudowy wkładu. Elementy te zostały usunięte, ponieważ ciśnienia obserwowane podczas pobierania próbek były zawsze poniżej maksymalnej wartości znamionowej obudowy (np. 125 psi dla 5-calowych obudów wkładów) oraz dlatego, że były trudne do dezynfekcji. Ten ostatni problem wykazano poprzez zastosowanie ślepej próby aparatury w badaniach przeprowadzonych po ICR 6,20. Stopień, w jakim wpłynęło to na dane ICR, jest nieznany, ale prawdopodobnie był niewielki; Podczas badania były tylko dwie fałszywie dodatnie ujemne próbki oceny działania (dane nie pokazane). Aby jeszcze bardziej ograniczyć możliwość przenoszenia zanieczyszczeń, zaleca się również wymianę przewodów modułu wlotowego po każdym pobraniu próbki. Szczególnie ważne jest zapewnienie odpowiedniej dezynfekcji, jeśli aparatura była używana do kontroli jakości lub wydajności, która została zasiana wirusem. Przed przystąpieniem do dezynfekcji należy zmierzyć stężenie wolnego chloru pod kątem ewentualnych ubytków podczas przechowywania. Oprócz zmian w konfiguracji aparatury opisanych powyżej, konieczne jest przeprowadzanie regularnych ślepych prób sprzętu w celu wykazania, że dezynfekcja jest skuteczna. Metoda 1615 nakazuje, aby ślepe próby sprzętu były wykonywane przy użyciu aparatów, które zostały zdezynfekowane po użyciu do kontroli z nasionami wirusów, upraszczając w ten sposób procedurę poprzez wyeliminowanie potrzeby przepuszczania roztworu zaszczepionego wirusem przez aparaturę przed dezynfekcją. Stężenie środka dezynfekującego zostało zwiększone do 0,525% podchlorynu dla metody 1615, ponieważ stężenie to jest wymagane zarówno do dezaktywacji wszelkich żywotnych wirusów na sprzęcie, jak i do degradacji kwasów nukleinowych. W związku z tym ślepe próby sprzętowe muszą być analizowane zarówno przy użyciu hodowli komórkowych, jak i testów qPCR.

Oba typy filtrów elektrododatnich uległy zatkaniu podczas badań opisanych w Tabeli 1. Nieznana liczba próbek o zmniejszonej objętości mogła być spowodowana błędami w pobieraniu próbek, takimi jak błędny odczyt sumatora lub celowe wcześniejsze zatrzymanie pobierania próbek w celu dotrzymania innego terminu, szczególnie w przypadku wód o odczytach mętności mniejszych niż 20 NTU. Stopień zapchania zależy zarówno od rodzaju filtra, jak i parametrów jakości wody. Filtry wstępne zapewniają pewną poprawę, ale jeśli są stosowane, powinny być przetwarzane i analizowane oddzielnie od filtra elektrododatniego. Obecne zalecenie dla UCMR3 jest takie, że próbka powinna być pobierana bez filtrów wstępnych przy użyciu dwóch filtrów na bazie nanowłókien tlenku glinu, jeśli co najmniej połowę objętości można zebrać za pomocą pierwszego filtra.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują licznym pracownikom EPA, których wkład umożliwił monitorowanie przeprowadzone podczas ICR i UCMR3, następujący główni badacze innych badań EPA poinformowali: Daniel Dahling, Alfred Dufour, Andrey Egorov, Susan Glassmeyer, Asja Korajkic, Richard Lieberman, Robert Safferman i Tim Wade; oraz Shannon Griffin i Michael Ware za krytyczną recenzję tego rękopisu. Autorzy dziękują zakładom wodociągowym Indian Hill Water Works za wykorzystanie jednej z ich pompowni do zademonstrowania pobierania próbek. Chociaż praca ta została zrecenzowana przez USEPA i zatwierdzona do publikacji, niekoniecznie musi odzwierciedlać oficjalną politykę Agencji. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelka polipropylenowa 1 lNalgene2104-0032
Kwadraty z folii aluminiowejCole-Parmer06275-40
AutoklawSterisAmsco Lab
Folia bąbelkowaU.S. Plastics50776
Zamykana torbaUlineS-12283
Zamykana torbaFisher Scientific
Komercyjne okłady z loduCole-Parmer06345-20
Fajny sejfZróżnicowana biotechnologiaCSF-BOX
Gąbka z gazyFisher Scientific22-415-469
Cylinder z podziałkąCole-Parmer06135-904-L lub większy
Hype WipeFisher Scientific14-412-56
Rejestrator temperatury iButtonsMaximDS1921G
Izolowana skrzynia do przechowywania i transportuFisher Scientific11-676-12
Taśma pakowaU.S. Plastics50083
Przenośny zestaw testowy do kolorymetru chloru IIHach
OmegaPHH-830
Przenośna miernik zmętnieniaOmegaTRB-2020-E
Taśma gwintowana PTFECole-Parmer08270-34Stosować na wszystkich połączeniach gwintowanych
Pompa, odśrodkowy napęd magnetycznyCole-Parmer72010-20
Złączka redukcyjnaCole-Parmer06349-87
Podchloryn sodu (NaClO)Używaj lokalnie dostępnego wybielacza domowego
Tiosiarczan sodu (Na2S2O3)Sigma Aldrich217247
Rękawice chirurgiczneFisher Scientific19-058-800
Wodoodporny markerFisher Scientific22-290546
Składpodłoża
0,525% podchloryn sodu (NaClO)Przygotuj 0,525% roztwór NaClO, rozcieńczając wybielacz domowy w stosunku 1:10 w dH2O.  Przechowuj 0,525% roztworów NaClO do 1 tygodnia w temperaturze pokojowej. 
 
 
 
 
[nagłówek]
1 M tiosiarczanu sodu (Na2S2O3) pentahydratPrzygotować 1 M roztwór, rozpuszczając 248,2 g Na2S2O3 w 1 l dH2O.  Tiosiarczan sodu należy przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej.
Seria S31798C Przenośna sonda pH i temperatury 5870062

Bibliografia

  1. Katayama, H., et al. One-year monthly quantitative survey of noroviruses, enteroviruses, and adenoviruses in wastewater collected from six plants in Japan. Water Res. 42 (6-7), 1441-1448 (2008).
  2. La Rosa, G., Pourshaban, M., Iaconelli, M., Muscillo, M. Quantitative real-time PCR of enteric viruses in influent and effluent samples from wastewater treatment plants in Italy. Annali Dell Istituto Superiore Di Sanita. 46 (3), 266-273 (2010).
  3. Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994 to december 2002. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (1994).
  4. Berg, H., Lodder, W., van der Poel, W., Vennema, H., de Roda Husman, A. M. Genetic diversity of noroviruses in raw and treated sewage water. Res Microbiol. 156 (4), 532-540 (2005).
  5. Haramoto, E., et al. Seasonal profiles of human noroviruses and indicator bacteria in a wastewater treatment plant in Tokyo, Japan. Water Sci Technol. 54 (11-12), 301-308 (2006).
  6. Denis-Mize, K., Fout, G. S., Dahling, D. R., Francy, D. S. Detection of human enteric viruses in stream water with RT-PCR and cell culture. J Water Health. 2 (1), 37-47 (2004).
  7. Hamza, I. A., Jurzik, L., Stang, A., Sure, K., Uberla, K., Wilhelm, M. Detection of human viruses in rivers of a densly-populated area in Germany using a virus adsorption elution method optimized for PCR analyses. Water Res. 43 (10), 2657-2668 (2009).
  8. Lieberman, R. J., et al. Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).
  9. Parshionikar, S. U., et al. Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).
  10. Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort. Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).
  11. Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water. Information Collection Rule Data Analysis. Maguire, M. J., McLain, J. L., Odolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).
  12. Sobsey, M. D., Wallis, C., Henderson, M., Melnick, J. L. Concentration of Enteroviruses from Large Volumes of Water. Appl Microbiol. 26 (4), 529-534 (1973).
  13. Hill, W. F., Akin, E. W., Benton, W. H., Metcalf, T. G. Virus in water. II. Evaluation of membrane cartridge filters for recovering low multiplicities of poliovirus from water. Appl Microbiol. 23 (5), 880-888 (1972).
  14. USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 141(1996).
  15. Pang, L. Microbial removal rates in subsurface media estimated from published studies of field experiments and large intact soil cores. J Environ Qual. 38 (4), 1531-1559 (2009).
  16. Johnson, T. B., et al. Viruses and Bacteria in Karst and Fractured Rock Aquifers in East. Ground Water. 49 (1), Tennessee, USA. 98-110 (2011).
  17. Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. ICR Microbial Laboratory Manual. , Environmental Protection Agency. (1996).
  18. Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).
  19. Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness. Environ Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).
  20. Francy, D. S., Bushon, R. N., Stopar, J., Luzano, E. J., Fout, G. S. Scientific Investigations Report 2004-5219, U.S. Geological Survey. Environmental factors and chemical and microbiological water-quality constituents related to the presence of enteric viruses in ground water from small public water supplies in southeastern Michigan. , 1-54 (2004).
  21. Regli, S., Rose, J. B., Haas, C. N., Gerba, C. P. Modeling the Risk from Giardia and Viruses in Drinking-Water. Journal American Water Works Association. 83 (11), 76-84 (1991).
  22. USEPA. Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems; Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
  23. Lambertini, E., Spencer, S. K., Bertz, P. D., Loge, F. J., Kieke, B. A., Borchardt, M. A. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).
  24. Butot, S., Le Guyader, F. S., Krol, J., Putallaz, T., Amoroso, R., Sanchez, G. Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus. J Virol Methods. 167 (1), 90-94 (2010).
  25. Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
  26. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).
  27. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. J Virol Methods. 176 (1-2), 38-45 (2011).
  28. Katayama, H., Shimasaki, A., Ohgaki, S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and norwalk virus from coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol. 68 (3), 1033-1039 (2002).
  29. Haramoto, E., Katayama, H., Utagawa, E., Ohgaki, S. Recovery of human norovirus from water by virus concentration methods. J Virol Methods. 160 (1-2), 206-209 (2009).
  30. Sobsey, M. D., Jones, B. L. Concentration of poliovirus from tap water using positively charged microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 37 (3), 588-595 (1979).
  31. Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
  32. Ko, G., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. J Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).
  33. Liu, P., et al. Laboratory Evidence of Norwalk Virus Contamination Levels on the Hands of Infected Individuals. Appl. Environ. Microbiol. 79 (24), 7875-7881 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pobieranie próbek wirusówfiltr elektropozytywnyfiltracja wodywykrywanie enterowirusówwykrywanie norowirusówkalibracja natężenia przepływutechnika sterylnazapychanie filtraobjętość próbki
Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.