Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Podsumowanie

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Streszczenie

Porównanie między dwiema lub więcej odrębnymi grupami, takimi jak zdrowie vs. choroba, jest niezbędne do określenia statusu komórki. Mitochondria znajdują się w centrum zdrowia komórek ze względu na ich rolę zarówno w metabolizmie komórkowym, jak i produkcji energii, a także w kontroli apoptozy. Dlatego bezpośrednia ocena izolowanych mitochondriów i zaburzeń mitochondriów daje możliwość określenia, czy występuje (dys)funkcja specyficzna dla organelli. Metody opisane w tym protokole obejmują izolację nienaruszonych, funkcjonalnych mitochondriów z komórek hodowanych HEK oraz wątroby i rdzenia kręgowego myszy, ale można je łatwo dostosować do stosowania z innymi hodowanymi komórkami lub tkankami zwierzęcymi. Funkcja mitochondriów oceniana przez TMRE oraz zastosowanie powszechnych rozprzęgaczy i inhibitorów mitochondriów w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych sprawiają, że protokół ten jest nie tylko wszechstronny i dostępny dla większości laboratoriów badawczych, ale także oferuje wysoką przepustowość.

Wprowadzenie

Żywe komórki gromadzą energię metaboliczną w postaci tłuszczów i węglowodanów i wykorzystują tę energię do biosyntezy, transportu błonowego i ruchu. Pewna ilość energii jest uzyskiwana w cytozolu poprzez konwersję cukrów dietetycznych bezpośrednio do ATP podczas glikolizy. Jednak główne źródło produkcji ATP w komórce jest wykorzystywane w mitochondriach za pośrednictwem mitochondrialnego łańcucha oddechowego¹. Architektura mitochondriów zapewnia niezbędną orientację przestrzenną dla efektywnej i wydajnej produkcji ATP. Mitochondria posiadają podwójną błonę oddzieloną przestrzenią międzybłonową i wraz z macierzą, najbardziej wewnętrznym przedziałem mitochondrialnym, mieszczą składniki i koordynują reakcje chemiczne biorące udział w wytwarzaniu ATP. Błona wewnętrzna zawiera szereg kompleksów białkowych związanych z błoną, które obejmują łańcuch oddechowy, a także syntazę ATP, kompleks białkowy, który łączy ADP i Pi w celu utworzenia ATP. Błona wewnętrzna jest złożona w grzebienie, a elektrony są przekazywane wzdłuż kompleksów łańcucha oddechowego przez cytochrom c, rozpuszczalny nośnik elektronów, który przemieszcza się między kompleksami w przestrzeni międzybłonowej. Gdy elektrony się poruszają, następuje utlenianie równoważników redukujących, a jony wodorowe są pompowane z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. W wyniku wysokiego stężenia jonów w przestrzeni międzybłonowej powstaje gradient elektrochemiczny, w wyniku którego powstaje potencjał błonowy w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej (∆ψ)². Tlen jest końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a jony wodoru przepływają przez syntazy ATP z przestrzeni międzybłonowej z powrotem do matrycy, a tym samym bezpośrednio powodują powstawanie ATP. Proces ten, opisany w całości, jest znany jako fosforylacja oksydacyjna. Fałdy grzebienia zwiększają powierzchnię błony wewnętrznej, umożliwiając maksymalny transport elektronów i produkcję ATP w każdym mitochondrium. Białka, enzymy i inne cząsteczki biorące udział w fosforylacji oksydacyjnej pochodzą zarówno z genów jądrowych, jak i mitochondrialnych. Mitochondria zawierają własne koliste DNA, kodujące 13 białek, a także tRNA i mRNA niezbędne do produkcji ATP³. Potrzeba jednak znacznie więcej białek, a zatem są one kodowane jądrowo. Większość z tych białek kodowanych jądrowo jest kierowana do macierzy mitochondrialnej za pomocą presekwencji na N-końcu białka prekursorowego, a ich import jest częściowo napędzany przez ∆ψ^4,5.

Poza przyczynianiem się do bioenergetyki komórki, mitochondria wpływają również na główne procesy metaboliczne, takie jak TCA i beta-oksydacja, sygnalizacja komórkowa poprzez regulację wapnia, a także odgrywają kluczową rolę w apoptozie⁶. W szczególności w okresach stresu komórkowego białka z rodziny BCL-2, które znajdują się na zewnętrznej błonie mitochondriów lub oddziałują na niej, mogą powodować przepuszczalność zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP)^7,8. Podczas MOMP cytochrom c i inne białka są uwalniane do cytozolu i wraz z kilkoma białkami cytozolowymi tworzą kompleks zwany apoptosomem^9,10. Apoptosom aktywuje kaspazy, które następnie rozszczepiają białka komórkowe i DNA podczas fazy wykonywania apoptozy. Gdy tylko wystąpi MOMP, ∆Ψ ulega zapadnięciu, a produkcja ATP zostaje wstrzymana. Tak więc, gdy apoptoza jest inicjowana, funkcja mitochondriów jest zagrożona, a zmiany w ∆Ψ mogą być skorelowane ze zdrowiem mitochondriów i komórek¹². Podczas gdy apoptoza jest punktem końcowym w wielu modelach choroby, funkcja mitochondriów i zmiany w ∆Ψ mogą również dostarczyć cennych informacji na temat pochodzenia i/lub progresji choroby. Na przykład w przebiegu chorób neurodegeneracyjnych udokumentowano zmiany strukturalne i funkcjonalne mitochondriów^13,14.

W pierwszej części protokołu opisana jest izolacja nienaruszonych mitochondriów, które zachowują swoje ΔΨ. Komórki HEK-293T wystawiono na działanie różnych stężeń i kombinacji rekombinowanych TNF-α, IL1-β i IFN-γ w celu wywołania apoptozy. Cytokiny te zostały wybrane, ponieważ często zgłasza się, że są one wysokie w pierwotnych próbkach septycznych u ludzi¹⁵, a zewnętrzna ścieżka apoptozy może być wywołana przez interakcję wiązania TNF-α z jego receptorem⁶ . Ponieważ istnieją subtelne różnice niezbędne do wyizolowania funkcjonalnych mitochondriów z tkanek pierwotnych w porównaniu z komórkami hodowanymi, a także dlatego, że wiele badań wykorzystuje zwierzęta, protokół opisuje również, jak wyizolować mitochondria z wątroby i rdzenia kręgowego w mysim modelu stwardnienia bocznego przedniego (ALS).

Druga część protokołu została opracowana do monitorowania zaburzeń potencjału błony mitochondrialnej za pomocą czułego na potencjał barwnika fluorescencyjnego z czytnikiem płytek fluorescencyjnych. Różnice między statusem komórkowym (tj. zdrowym a niezdrowym) różnicuje się poprzez ilościowe określenie siły ΔΨ izolowanych mitochondriów w połączeniu ze środkami rozprzęgającymi, inhibitorami łańcucha oddechowego, inhibitorami złożonymi i jonoforami, z których wszystkie powodują rozproszenie potencjału błony mitochondrialnej. Im zdrowsze mitochondria, tym większa zmiana ∆Ψ po leczeniu inhibitorami mitochondriów, dlatego odpowiedź mitochondriów może być wykorzystana jako wskaźnik (dys)funkcji mitochondriów.

Użycie izolowanych mitochondriów zamiast oceny funkcji in situ dostarcza ostatecznych dowodów, że patologia lub leczenie bezpośrednio moduluje zmiany w organellach^16-18. Chociaż w literaturze istnieją metody izolowania mitochondriów od hodowanych komórek, są one niejasne¹⁷ i/lub wykorzystują specjalistyczny sprzęt¹⁶. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę izolacji i można go łatwo dostosować do innych linii komórkowych, w tym tkanek pierwotnych i kultur^13,14,19,20. Wiele izolowanych badań mitochondriów wykorzystuje te same rozprzęgacze i inhibitory mitochondriów, które są używane w tym protokole, ale z elektrodą Clarka (²¹ jest reprezentatywnym przykładem wielu artykułów w literaturze), która ponownie jest bardzo specyficznym i specjalistycznym elementem wyposażenia. Ponadto ta tradycyjna metoda ma ograniczenia, takie jak niska przepustowość i wysoka złożoność^22,23 i wymaga znacznej ilości mitochondriów (~500 μg/reakcję). W tym protokole sonda potencjału TMRE z membraną fluorescencyjną jest używana w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych, który jest standardową maszyną w wielu laboratoriach. TMRE jest powszechnie ceniony, ponieważ szybko wnika do komórek i izolowanych mitochondriów i może być stosowany w niskich stężeniach²⁴. Za pomocą tego protokołu można szybko skonfigurować wiele reakcji w tandemie i analizować je wsadowo. Ponadto reakcje wymagają znacznie mniejszej ilości izolowanych mitochondriów (~10 μg/reakcję). Wymagając mniejszej ilości materiału, mniejsze próbki tkanek lub hodowli komórkowych można wykorzystać jako punkt wyjścia do izolacji mitochondriów, można skonfigurować więcej powtórzeń lub reakcji i potencjalnie możliwa jest wystarczająca ilość materiału do innych izolowanych eksperymentów mitochondrialnych, takich jak produkcja ATP, zużycie tlenu lub testy importowe.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wake Forest. Pary hodowlane dla modelu myszy SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] uzyskano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Nietransgeniczne samice typu dzikiego (WT) i SOD1G93A samce [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] zostały wyhodowane w celu wyhodowania SOD1G93A myszy i nietransgenicznych rodzeństwa z miotu WT, które zostały wykorzystane w eksperymentach.

1. Modele do badań

1. Hodowla komórkowa
   1. Utrzymuj ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK-T293) w DMEM uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 1% L-glutaminą, w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
   2. Hoduj komórki w kolbach T75 i pozwól im osiągnąć 90% konfluencji.
   3. Przeprowadzić podział komórek poprzez trypsynizację (0,25% Trypsin-EDTA) przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 ,} inaktywację trypsyny przy równej objętości pożywki komórkowej i odwirowanie komórek przez 5 minut w temperaturze 700 x g w 4 °C.
   4. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej.
   5. Komórki nasienne w odpowiedniej kolbie lub płytce 7 x 10⁴ komórki do kolby T75 48 godzin przed poddaniem działaniu cytokin. Powinno to dać ~70% gęstości w momencie zabiegu.
   6. Surowica głodzy komórki 24 godziny później, odsysając pożywkę i zastępując ją tą samą objętością pożywki bez surowicy (DMEM, sterylne).
   7. Przygotować TNF-α, IL1-β i IFN-γ z liofilizowanego proszku z ultraczystą wodą o stężeniach roboczych odpowiednio 5 pg/μl, 10 ng/μl i 10 ng/μl i dodać je do studzienek/kolb.
   8. Leczyć wygłodzone komórki surowicy poprzez dodanie rozpuszczonych cytokin bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych w odpowiednich kolbach. Leczenie składało się z pojedynczych cytokin, koktajlu wszystkich 3 (określanego jako "*3") lub sterylnej wody jako kontroli (określanej jako "0").
   9. Inkubować leczone komórki przez 24, 48 lub 72 godziny przed oceną i pobraniem.
2. Ocena żywotności komórek
   1. Sporządzić 5 mg/ml roztworu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) w 1x PBS.
   2. W przypadku płytek 12-dołkowych dodaj 100 μl roztworu MTT do każdego dołka i delikatnie zamieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
   3. Inkubować płytki przez 15 minut–1 godzinę w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ i sprawdzić pod mikroskopem pod kątem obecności fioletowego zabarwienia. Jeśli nie ma fioletu, ponownie zawiruj i pozwól komórkom inkubować w odstępach 5 minut, aż zaobserwuje się fiolet. Ilość niezbędnego czasu powinna być określona przez każdego badacza.
   4. Używając powtarzalnego pipetora, dodaj 700 μl rozpuszczalnika MTT (4 mM HCl i 0,1% NP40 w izopropanolu) do każdego dołka i kołysz płytką (płytkami) w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut lub do momentu, gdy cały fioletowy kolor opuści komórki. Jeśli fioletowy kolor nie wychodzi z komórek, dodaj dodatkowe 200 μl rozpuszczalnika i kontynuuj wirowanie.
   5. Do analizy pobrać 100 μl z każdej studzienki i umieścić na 96-dołkowej płytce i odczytać na czytniku płytek przy użyciu 570 nm i referencyjnej długości fali 630 nm, jednak 595 nm jest również dopuszczalne, o ile odczyty są dokonywane w spójnych ustawieniach.
3. Model zwierzęcy ALS
   1. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wake Forest. Pary hodowlane dla modelu myszy SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] uzyskano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Nietransgeniczne samice typu dzikiego (WT) i SOD1G93A samce [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] zostały wyhodowane w celu wyhodowania SOD1G93A myszy i nietransgenicznych rodzeństwa WT, które zostały wykorzystane w eksperymentach.
   2. Przeprowadzić genotypowanie za pomocą standardowych starterów przeciwko zmutowanemu SOD1²⁵.

2. Izolacja mitochondriów

UWAGA: Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać wszystko na lodzie przez cały czas trwania procedury.

1. Przygotowanie buforu izolacyjnego mitochondriów (MIB), bufora izolacyjnego rdzenia kręgowego (SC MIB) i buforu eksperymentalnego (EB)
   1. Przygotuj z wyprzedzeniem następujące roztwory podstawowe dla MIB i EB.
   2. Przygotować 1 M Tris/MOPS, rozpuszczając 12,1 g zasady Tris w 70 ml_H2O. Dodać suchy MOPS, aby uzyskać pH do 7,4. Dostosować objętość do 100 ml final. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Otrzymać 1 M Kphos przez zmieszanie 80,2 ml K₂HPO₄ i 19,8 ml KH₂PO₄. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   4. Przygotować 0,2 M EGTA/Tris, dodając 3,8 g EGTA do 10 ml_H2O. Dodaj 1 M Tris/MOPS aż do rozpuszczenia, ~30-40 ml. Dostosuj do 50 ml, sterylny filtr i przechowuj w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że pH wyniesie ~6,7.
   5. Przygotuj 1 M glutaminianu, sporządzając 10 ml 1 M roztworu kwasu glutaminowego. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   6. Przygotować 1 M jabłczan, sporządzając 10 ml 1 M roztworu kwasu jabłkowego. Dodaj Tris/MOPS do 50 mM. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   7. Przygotuj MIB w stężeniu 200 mM sacharozy, 10 mM Tris/MOPS, pH 7,4 i 1 mM EGTA/Tris. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   8. Wykonaj SC MIB o stężeniu 250 mM sacharozy, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT i koktajlu inhibitorów proteazy.
   9. Przygotować EB o stężeniu 125 mM KCl, 10 mM Tris/MOPS, pH 7,4, 5 mM glutaminianu, 2,5 mM jabłczanu, 1 mM fosforanu K, pH 7,4 i 10 mM EGTA/Tris. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie sprzętu przed pobraniem komórek.
   1. Opłucz małe szklane naczynie i tłuczek do homogenizacji trzy razy sterylną wodą i umieść na lodzie.
   2. Zbierz niezbędne przedmioty, takie jak standardowe wiertło, skrobaki do komórek, probówki i roztwory o pojemności 1,5 ml, 15 ml i 50 ml.
3. Izolacja mitochondriów
   1. Hodowane komórki
      1. Dla każdego typu próbki należy użyć dwóch kolb T175 z komórkami.
      2. Upewnij się, że komórki są w ~90% zlewające się i użyj w eksperymentach kontrolnych lub płytkuj i traktuj zgodnie z opisem powyżej w kroku 1.2.
      3. Na blacie stołu odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć przylegające komórki 15 ml 1x PBS za każdym razem.
      4. Odessać bufor i zeskrobać kolby w celu usunięcia przylegających komórek z dna kolby.
      5. Dodać 15 ml 1x PBS do każdej kolby, zamieszać i przenieść do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i umieścić na lodzie.
      6. Po zakończeniu skrobania probówki należy odwirowywać przez 5 minut przy 700 x g, 4 °C za pomocą wirówki stołowej z obracanym wirnikiem kubełkowym.
      7. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 1 ml MIB.
      8. Połączyć obie zawiesiny i przenieść do małego szklanego naczynia w celu homogenizacji.
      9. Dodać MIB do naczynia do momentu, aż bufor dotrze do pierwszej linii. Homogenizuj komórki za pomocą tłuczka przymocowanego do wiertła ze średnią prędkością przez trzy przejścia. Upewnij się, że na tym etapie naczynie znajduje się na lodzie, aby nie wyjmować tłuczka ponad płyn i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami.
      10. Przenieść homogenizowany roztwór do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      11. Pobrać roztwór do strzykawki o pojemności 3 ml za pomocą igły 1 1/2 cala o rozmiarze 18 i wyrzucić go z powrotem do stożkowej probówki na lodzie za pomocą igły 1/2 cala o rozmiarze 27. Należy uważać, aby usunąć roztwór z wewnętrznej ścianki probówki, aby wykorzystać tę siłę do przerwania błony komórkowej.
      12. Powtórzyć czynności z użyciem strzykawki w sumie pięć razy.
      13. Przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut przy 600 x g, 4 °C w wirówce stołowej za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego.
      14. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i rozprowadzić w trzech probówkach o pojemności 1,5 ml.
          UWAGA: Mitochondria znajdują się w supernatancie po tym pierwszym, wolnym sprośnie, podczas gdy błony komórkowe i nieuszkodzone komórki są granulowane.
      15. Probówki wirówkowe w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 x g, 4 °C przez 5 min.
      16. Odessać supernatanty i połączyć granulki w 100 μl MIB i natychmiast umieścić na lodzie.
          UWAGA: Mitochondria znajdują się w granulce po tym szybkim wirowaniu. Mitochondria zazwyczaj zachowują swój potencjał błonowy dla ~2-3 jonów lodu po izolacji i są najbardziej stabilne jako skoncentrowany roztwór podstawowy w MIB.
   2. Izolacja mitochondriów z tkanki myszy
      1. Znieczulić mysz zgodnie z protokołem IACUC. Ustaw waporyzator na 5,0%, aby wywołać znieczulenie. Potwierdzono, że zwierzę jest znieczulone przez brak odruchu szczypania stopy lub odruchu mrugania, gdy zbliża się do oka lub stuka wacikiem. Utrzymuj mysz w znieczuleniu przez cały zabieg chirurgiczny, utrzymując waporyzator w zakresie od 1,5% do 2,0%.
      2. Odetnij wątrobę i rdzeń kręgowy od każdego zwierzęcia i umieść osobno w lodowatym chłodnym 1x PBS -/-, aby spłukać krew.
      3. W przypadku wątroby przenieś tkankę do naczynia wagowego na lodzie i posiekaj na drobne kawałki za pomocą świeżej żyletki przez 1 minutę.
      4. Dodać tkankę i odpowiedni bufor (MIB dla wątroby lub SC MIB dla rdzenia kręgowego) do naczynia, aż bufor dotrze do pierwszej linii. Homogenizuj tkankę tłuczkiem ręcznie przez pięć przejść. Upewnij się, że na tym etapie naczynie znajduje się na lodzie, aby nie wyjmować tłuczka ponad płyn i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami.
      5. Przenieść homogenaty do czystych probówek o pojemności 15 ml.
      6. Probówki wirówkowe w wirniku o stałym kącie nachylenia 750 x g, 4 °C przez 10 min.
      7. Zachowaj supernatanty w czystych probówkach i umieść je na lodzie.
         UWAGA: Mitochondria znajdują się w supernatancie po tym pierwszym, wolnym sprośnie, podczas gdy błony komórkowe i nieuszkodzone komórki są granulowane.
      8. Ponownie zawiesić granulki rdzenia kręgowego w 500 μl SC MIB.
      9. Ponownie homogenizuj każdy trzy razy, tym razem napełniając naczynie tylko do połowy SC MIB.
      10. Przenieść nowy homogenat do świeżej probówki.
      11. Wirować w wirniku o stałym kącie nachylenia 750 x g, 4 °C przez 10 min.
      12. Połącz te nowe supernatanty, które zawierają więcej mitochondriów, z pierwszym supernatantem z każdej próbki.
      13. Probówki wirówkowe w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 x g, 4 °C przez 5 min.
      14. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić granulki wątroby w 500 μl MIB, a granulki rdzenia kręgowego w 50 μl SC MIB i natychmiast umieścić na lodzie.
          UWAGA: Mitochondria znajdują się w granulce po tym szybkim wirowaniu. Mitochondria zazwyczaj zachowują swój potencjał błonowy dla ~2-3 jonów lodu po izolacji i są najbardziej stabilne jako skoncentrowany roztwór podstawowy w MIB.
      15. Wykonaj test stężenia białka, aby oszacować stężenie mitochondriów w roztworze. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi korzystania z komercyjnego zestawu do oznaczania białek lub podobnej metody²⁶. Typowe stężenia mitochondriów to: 2 kolby T175 dają ~ 2 mg / ml, 1 wątroba myszy ~ 3-5 mg / ml i 1 rdzeń kręgowy myszy ~ 1-3 mg / ml.
4. Test cytochromu c przy użyciu zestawu badawczo-rozwojowego Szczur/mysz Quantikine Quantikine ELISA (dostosowany na podstawie protokołu dostarczonego przez producenta).
   1. Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji należy rozcieńczyć mitochondria do stężenia roboczego 0,5 mg/ml za pomocą EB i rozprowadzić rozcieńczone mitochondria w probówkach o pojemności 1,5 ml do reakcji (zwykle 30-50 μl mitochondriów na probówkę).
   2. Dodaj EB lub DMSO, w ilości 1% całkowitej objętości, do rozcieńczonych mitochondriów i inkubuj reakcje na stole przez 7-10 minut. Reakcje te są stabilne do 30 minut w temperaturze pokojowej, jeśli potrzebne są dłuższe ramy czasowe.
   3. Mitochondria osadzać przez odwirowanie w rotorze o stałym kącie nachylenia przy 10 000 x g, 4 °C przez 5 minut, a następnie ostrożnie oddzielić supernatant i umieścić go w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Probówki można zamrozić w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy lub natychmiast zużyć.
   4. Oznaczyć uwalnianie cytochromu c przez porównanie stężenia cytochromu c w osadzie i supernatancie²⁷.
      1. Przygotuj próbki, rozpuszczając granulki w pierwotnej objętości reakcji z 0,5% Tx-100 w 1x PBS.
      2. Dla każdej próbki przygotuj 2 studzienki na płytce ELISA, jedną dla rozpuszczonego osadu i jedną dla supernatantu z reakcji przez dodanie 100 μl koniugatu cytochromu c (stosować prosto z butelki) plus 100 μl 0,5% Tx-100 w 1x PBS, a następnie całą próbkę osadu lub supernatantu.
      3. Delikatnie obracać płytkę na niskim poziomie (poziom 2-4) przez 20 sekund, aby wymieszać, przykryć i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      4. Następnie należy czterokrotnie umyć płytkę buforem myjącym rozcieńczonym zgodnie z zaleceniami producenta. Usuń nadmiar roztworu, stukając w dołki ręcznik papierowy.
      5. Następnie dodaj 150 μl roztworu rozwijającego 1:1 A+B do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20-30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
      6. Na koniec dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i dokonać odczytów absorbancji przy 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oblicz ilość uwalnianego cytochromu c, porównując ilość cytochromu c w osadzie i supernatance dla każdej reakcji.

3. Ocena funkcji mitochondrialnej (dys)funkcji

1. Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji należy rozcieńczyć mitochondria do stężenia roboczego 0,5 mg/ml za pomocą EB i umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml do reakcji (zwykle stosuje się 30-50 μl mitochondriów na probówkę).
2. Leczenie mitochondrialne
   1. Dodać odpowiednie zabiegi (kontrola EB, 1 μM FCCP zmieszany z 50 nM Walinomycyną, 10 μM rotenonem, 5 μM oligomycyną, 2 mM KCN lub 200 μM ADP, stężenia końcowe) w celu rozdzielenia reakcji przy 1/10 całkowitej objętości rozcieńczonych mitochondriów. Inkubować reakcje na stole przez 7 min.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tymi substancjami, ponieważ przypadkowe spożycie lub wchłonięcie przez skórę może być szkodliwe.
   2. Rozcieńczyć TMRE, rozpuszczony w sterylnej wodzie o stężeniu roboczym 100 μM i przechowywany w temperaturze -20 °C, do 2 μM i dodać objętość równą objętości reakcji mitochondrialnej.
   3. Inkubuj reakcje na blacie stołu przez 7 minut.
   4. Mitochondria osadów przez odwirowanie w wirniku o stałym kącie nachylenia przy 10 000 x g, 4 °C przez 5 min.
   5. Załadować połowę objętości supernatantu z każdej próbki na płytkę 396-dołkową i odczytać fluorescencję.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji TMRE należy zoptymalizować zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu objętości i płytki, które zostaną użyte do testu. Używając standardowej 384-dołkowej czarnej płytki o zawartości 25 μl 1 μM TMRE (końcowe stężenie reakcji), najsilniejszy sygnał uzyskano przy użyciu długości fal wzbudzenia/emisji 485 nm/535 nm.
   6. Obliczyć różnicę fałdowania we fluorescencji między kontrolą (EB) a każdym zabiegiem, dzieląc względną wartość fluorescencji (RFU) uzyskaną z czytnika płytek dla próbki doświadczalnej przez RFU od próbki kontrolnej.

Wyniki

Leczenie komórek HEK-293T 200 pg/ml TNF-α, 40 ng/ml IL1-β i 75 ng/ml IFN-γ (*3) przez 24-48 godzin prowadzi do postępującej śmierci komórki (Figura 1A). Żywotność komórek oceniono za pomocą testów MTT i konsekwentnie wykazano, że występuje ~10% spadek żywotności komórek po 24-godzinnym leczeniu i ~20% spadek po 48-godzinnym leczeniu. Komórki traktowane podobnymi stężeniami (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β i 75 ng / ml IFN-γ) dają podobne wyniki śmierci komórki po 48 godzinach, a leczenie pojedynczymi...

Dyskusja

Leczenie komórek HEK-293T rekombinowanymi cytokinami powoduje umiarkowaną śmierć komórki w ciągu 48 godzin (ryc. 1). Ilość śmierci komórki indukowanej przez leczenie TNF-alfa jest podobna do wcześniej opisanych badań³⁰ , a żywotność komórek zmniejsza się po jednoczesnym podaniu wielu cytokin, które są większe niż sumowane ilości z dowolną samą cytokiną, jest również zgodna z literaturą^31,32. Możliwość dostosowania ilości i rodzajów leczenia cytokinami, a także porównanie koktajli do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas L-glutaminowy	Sigma	G1251	Zamiast tego można użyć soli potasowej.
kwas jabłkowy	Sigma	M8304	Zamiast tego można użyć soli potasowej.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Rozcieńczyć do 100  μ M jako zapas roboczy w etanolu i przechowywać w temperaturze -20  °C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Zrób w DMSO i używaj jako 5  μ M zapas roboczy. Przechowywać w temperaturze -20  °C.
sacharoza	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Przygotować skoncentrowany bulion w etanolu, a następnie rozcieńczyć wodą
rotenon	Sigma	R8875	Wysoce toksyczny. Wykonane na etanolu.
oligomycyna	Sigma	O4876	Wysoce toksyczna. Wykonane na etanolu.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Rozcieńczony 100  μ Kolba M z EB natychmiast przed użyciem.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regularny (wysoki poziom glukozy).
Długopis/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamina	Fisher	SH3002101	Przechowywać porcje pod adresem -20  ° C
FBS	Lonza	14-501F	pochodzenie amerykańskie, jakość premium. Podgrzewanie dezaktywacji i przechowywanie podwielokrotności w temperaturze -20  °C.
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Test Protien Barwnik (5x)	Bio-Rad	500-0006	Każdy test białkowy może zastąpić.
BSA	Fisher	BP1600-100	Przygotować 2 mg/ml bulionu w wodzie do oznaczania białka.
MTT w proszku	Sigma	M2128	Filtr sterylizowany 5 mg / ml bulion wykonany z PBS. Przechowuj porcje na poziomie -20  ° C; Przechowywać w 4  ° C przez okres do 1 tygodnia.
Roztwór tergitolu (NP-40)	Sigma	NP40S
Rekombinowany ludzki IL-1B	Gibco	PCH08014	Po otwarciu porcji sklepowych na -20  ° C
Rekombinowany ludzki TNF-alfa	Gibco	PHC3015L
Rekombinowany ludzki IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Upewnij się, że nie ma jonów Mg2+ i Ca2+.
Cytochrom c zestaw ELISA	R& Systemy D	DTC0	Human dla komórek HEK-293T.