Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Podsumowanie

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Streszczenie

Elektrofizjologiczny zapis potencjałów czynnościowych z neuronów czuciowych komarów daje badaczom wgląd w chemiczną percepcję tych wektorów chorób. Niedawno zidentyfikowaliśmy neuron wyczuwający gorycz w labellum samicy Aedes aegypti, który reaguje na DEET i inne repelenty, a także gorzką chininę, poprzez bezpośrednie badania elektrofizjologiczne. Te odpowiedzi neuronów receptora smakowego skłoniły nas do sekwencjonowania całkowitego mRNA zarówno z męskich, jak i żeńskich próbek labella i stępu, aby wyjaśnić przypuszczalne geny chemorecepcji ulegające ekspresji w tych kontaktowych tkankach chemorecepcji. Próbki stępu podzielono na podtypy pro-, mezo- i śródpiersiowe dla obu płci. Następnie zweryfikowaliśmy nasz zestaw danych, przeprowadzając qRT-PCR na tych samych próbkach tkanek i zastosowaliśmy metody statystyczne do porównania wyników między tymi dwiema metodami. Badania nad funkcjami molekularnymi mogą teraz koncentrować się na konkretnych genach, aby określić te zaangażowane w postrzeganie środków odstraszających przez komary. Te szlaki receptorowe mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych nowych repelentów w kierunku zakłócenia zachowań związanych z poszukiwaniem żywiciela w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się szkodliwych wirusów.

Wprowadzenie

Wykazano, że związki takie jak DEET, Picaridin, Citronellal i IR3535 skutecznie odstraszają komary, w tym ważny wektor choroby Aedes aegypti^1,2. Rejestrujemy potencjały czynnościowe z neuronów czuciowych związanych ze specyficzną zmysłowością smakową, aby określić komórki zaangażowane w odstraszanie komarów. W połączeniu z dalszym sekwencjonowaniem ekspresji genów w tych tkankach, możemy zidentyfikować geny, które najprawdopodobniej pośredniczą w odpowiedziach tych komórek w celu zbadania nowych związków w celu poprawy zdolności odstraszania.

RNA-seq to potężne narzędzie, szybko stając się standardem do śledzenia czasowy....

Protokół

1. Hodowla dorosłych Ae. Aegypti

1. Wykluwaj jaja w wodzie o głębokości około 3/4 cala na płytkiej tacy. Przeludnienie zmniejszy liczebność dorosłych.
2. Tylne larwy w temperaturze 25 °C (12-hL:12-hD) i karmić się mielonym pokarmem dla ryb.
   UWAGA: Przekarmienie może zmniejszyć przeżywalność.
3. Poczwarki należy usuwać pojedynczo za pomocą pipety Pasteura codziennie i przenosić do plastikowych naczyń (9 cm × 5,5 cm) w małych pojemnikach z pokrywkami o drobnych oczkach, ustalając w ten sposób 24-godzinne grupy wiekowe.
4. Dorosłe komary należy karmić 10% roztworem sacharozy za pomocą wacika umieszczonego na ściankach ekranu ....

Wyniki

Zapisy śladów potencjałów czynnościowych z sensilli smakowych Ae. aegypti (Rysunek 1) demonstrują skuteczność bezpośredniej stymulacji różnymi substancjami chemicznymi. Technikę tę można wykorzystać do ilościowego określenia odpowiedzi na dowolny związek stymulujący poprzez zliczanie impulsów o określonej amplitudzie i czasie trwania w odpowiednim przedziale czasowym (zazwyczaj krótszym niż 500 ms). Zapisy śladów muszą być łatwo powtarzalne w danym zestawie warunków eksperymentalnych. W przeciwn.......

Dyskusja

Najtrudniejszym aspektem rejestrowania potencjałów czynnościowych z zmysłów smakowych jest ustalenie, które reakcje są "normalne". W przypadku zastosowania rejestracji pojedynczej końcówki zmysłu smakowego po raz pierwszy dla danego gatunku owadów, całkowita liczba i czułość neuronów receptora smakowego (GRN) jest prawdopodobnie nieznana. Wiele wstępnych zapisów jest wymaganych w pierwszej kolejności, aby zdecydować o zakresie i stężeniach substancji chemicznych do testowania. W tym przypadku zaczęliśmy od obserwacji, że.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kapilara szklana	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Srebrny drut	A-M Systems	7875.015	" goły
drut wolframowy	Alfa Products	369	o średnicy 0,127 mm
Kleszcze drobnoziarniste	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Etap lodówkowy	BioQuip Products	1429	Chill Przedwzmacniacz stołowy
	Syntech	Taste Probe	przedwzmacniacz
Oprogramowanie do elektrofizjologii	Oprogramowanie Syntech	Autospike	do elektrofizjologii
Karma dla ryb TetraMin	Tetra	Tropical karma dla ryb granulki	pokarm dla ryb mielony na drobny proszek
TRIzol	Life Technologies	15596-026	Odczynnik do izolacji RNA
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	zawiera eliminator gDNA i kolumny wirujące RNeasy
Spektrofotometr Nano	Drop Products	Spektrometr stołowy	ND-1000
Darmowe oprogramowanie do statystyk R	(stworzone przez Roberta Gentlemana i Rossa Ihakę)	www.r-project.org	Użyj funkcji lm pakietu stats i funkcji equiv.boot pakietu równoważności w środowisku obliczeniowym R.
Stojak na probówki 1,5 ml	Evergreen	240-6388-030	Wlej ciekły azot do kilku pustych studzienek, aby zamrozić i zmielić tkankę.
Probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml z tłuczkiem	Grainger	6HAX6	Wirówka bez RNaz
	Thermo Scientific	11178160	Zawiruj zamrożoną tkankę, aby trzymać ją na dnie probówki o pojemności 1,5 ml.
Primer-BLAST Narzędzie do projektowania podkładów	NCBI	n/a