Wykorzystanie zmniejszonej interakcji kropelka-powierzchnia w celu optymalizacji transportu bioanalitów w cyfrowej mikrofluidyce

Podsumowanie

Opisano protokół produkcji i obsługi urządzeń do odwadniania pól (Field-DW), a także wstępne badania wpływu pól elektrycznych na zawartość kropel.

Streszczenie

Cyfrowa mikrofluidyka (DMF), technika manipulacji kropelkami, jest obiecującą alternatywą dla rozwoju platform "lab-on-a-chip". Często ruch kropel opiera się na zwilżaniu powierzchni, co jest bezpośrednio związane z zastosowaniem pola elektrycznego; Interakcje powierzchniowe sprawiają jednak, że ruch jest zależny od zawartości kropel, co ogranicza zakres zastosowań tej techniki.

Przedstawiono kilka alternatyw, aby zminimalizować tę zależność. Polegają one jednak na dodaniu dodatkowych związków chemicznych do kropelki lub jej otoczenia, które mogą potencjalnie wchodzić w interakcje z ugrupowaniami kropelkowymi. Wychodząc naprzeciw temu wyzwaniu, nasza grupa opracowała niedawno urządzenia Field-DW, które umożliwiają transport komórek i białek w DMF, bez dodatkowych dodatków.

Tutaj dostępny jest protokół produkcji i obsługi urządzenia, w tym elektroniczny interfejs do sterowania ruchem. Kontynuujemy również badania z urządzeniami, pokazując, że wielokomórkowe, stosunkowo duże organizmy modelowe mogą być również transportowane, prawdopodobnie nienaruszone przez pola elektryczne wymagane do działania urządzenia.

Wprowadzenie

Miniaturyzacja urządzeń pracujących z płynami ma ogromne znaczenie dla rozwoju platform "lab-on-a-chip". W tym kierunku w ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił znaczny postęp w dziedzinie mikrofluidyki, o różnorodnych zastosowaniach. ^1-5 W przeciwieństwie do transportu płynu w kanałach zamkniętych (mikrofluidyka kanałowa), DMF manipuluje kropelkami na układach elektrod. Jedną z najbardziej atrakcyjnych zalet tej techniki jest brak ruchomych części do transportu płynów, a ruch jest natychmiast zatrzymywany przez wyłączenie sygnałów elektrycznych.

Jednak ruch kropel zależy od ich zawartości, co jest z pewnością niepożądaną cechą dla uniwersalnej platformy "lab-on-a-chip". Kropelki zawierające białka i inne anality przyklejają się do powierzchni urządzenia, stając się nieruchome. Prawdopodobnie było to główne ograniczenie w poszerzaniu zakresu zastosowań DMF; ^6-8 alternatyw mających na celu zminimalizowanie niepożądanego zanieczyszczenia powierzchni polega na dodaniu dodatkowych związków chemicznych do kropli lub jej otoczenia, co może potencjalnie wpłynąć na zawartość kropli.

Wcześniej, nasza grupa opracowała urządzenie umożliwiające transport komórek i białek w DMF, bez dodatkowych dodatków (urządzenia Field-DW). ⁹ Osiągnięto to poprzez połączenie powierzchni opartej na sadzy świecy10 z geometrią urządzenia, która sprzyja toczeniu się kropli i prowadzi do siły działającej na kroplę w górę, co jeszcze bardziej zmniejsza interakcję kropla-powierzchnia. W tym podejściu ruch kropel nie jest związany ze zwilżaniem powierzchni. ¹¹

Celem opisanej poniżej metody szczegółowej jest wyprodukowanie urządzenia DMF zdolnego do transportu kropelek zawierających białka, komórki i całe organizmy, bez dodatkowych dodatków. Urządzenia Field-DW torują drogę dla w pełni kontrolowanych platform działających w dużej mierze niezależnie od składu chemicznego kropel.

Tutaj prezentujemy również symulacje pokazujące, że pomimo wysokiego napięcia wymaganego do działania urządzenia, spadek napięcia na kropli stanowi niewielki ułamek przyłożonego napięcia, co wskazuje na znikomy wpływ na bioanality wewnątrz kropli. W rzeczywistości wstępne testy z Caenorhabditis elegans (C. elegans), nicieniem używanym do różnych badań w biologii, pokazują, że robaki pływają bez zakłóceń po przyłożeniu napięcia.

Protokół

UWAGA: W procedurach opisanych poniżej, zawsze należy przestrzegać wytycznych bezpieczeństwa w laboratorium. Szczególne znaczenie ma bezpieczeństwo podczas pracy z wysokim napięciem (> 500 V) i obchodzeniu się z chemikaliami.

1. Pokrycie przewodzącego podłoża sadzą ze świecy

1. Pokrój miedziany metal na prostokąty (75 x 43 mm, grubość 0,5 mm). Wyczyść każde podłoże miedziane przez zanurzenie w wytrawiaczu miedzi na około 30 sekund, umyj wodą z kranu przez około 20 sekund i osusz papierem.
   UWAGA: W przypadku korzystania z poniższej metody 1 zmień wymiary na 75 x 25 mm, aby zmieściły się w urządzeniu.
2. Zapaloną świecę parafinową należy przeciągnąć pod miedzianym podłożem na 30–45 sekund, aby uzyskać w przybliżeniu jednolitą powłokę sadzy (o grubości około 40 μm). Utrzymuj podłoże na wysokości ~1 cm wewnątrz płomienia. Nie dotykaj delikatnej powierzchni sadzy.

2. Ochrona warstwy sadzy za pomocą powłoki

UWAGA: Warstwa sadzy jest bardzo delikatna i musi być pokryta dla ochrony. Sugerowane są tutaj dwie proste alternatywy (metody 1 i 2 poniżej), ale obecnie opracowywane są bardziej niezawodne protokoły.

1. Metoda 1
   1. Załadować próbkę do metalowego parownika lub systemu napylania. Postępując zgodnie z procedurami operacyjnymi systemu, opróżnij komorę i rozpocznij kontrolowane osadzanie złota na warstwie sadzy (150–200 nm). Poczekaj, aż urządzenie ostygnie do temperatury pokojowej.
   2. Zanurz metalizowane podłoże w roztworze 1-dodekanetiolu (1% v/v, w 95% etanolu, klasa ACS/USP) przez 10 minut w okapie chemicznym. Następnie, trzymając urządzenie pod kątem zbliżonym do 60°, delikatnie umyj powierzchnię tylko kilkoma kropelkami etanolu. Pozostaw urządzenia do wyschnięcia na noc.
2. Metoda 2
   1. W kapturze chemicznym, natychmiast po pokryciu podłoża sadzą i gdy podłoże jest jeszcze ciepłe od płomienia świecy, należy umieścić kilka kropelek fluorowanej cieczy po jednej stronie podłoża i przechylić podłoże pod kątem bliskim 90°. Umieść więcej kropel i pozwól im toczyć się po całej powierzchni sadzy.
      UWAGA: Gdy kropla spadnie na miejsce, sadza zostanie zmyta z tego obszaru. Niech kropelki fluorowanej cieczy rozprzestrzenią się tak bardzo, jak to możliwe.
   2. Piecz podłoże na gorącej płycie (160 °C przez 15 min) w okapie chemicznym.
   3. Przed użyciem pozostaw podłoże na noc w temperaturze pokojowej. Przechowywać przez czas nieokreślony.

3. Produkcja górnych elektrod (Na podstawie Abdelgawad et al.¹²)

1. Narysuj elektrody za pomocą oprogramowania do projektowania graficznego. Każda elektroda ma 2 mm długości, 0,3 mm szerokości, a odstęp między elektrodami wynosi 0,3 mm. Odstęp między stykami (do zatrzaśnięcia w złączu, patrz poniżej) wynosi 2,3 mm (rysunek 1).
2. Przytnij elastyczny laminat miedziany (o grubości 35 μm) do formatu Monarch (3.87 x 7.5 cala). Użyj innych rozmiarów, jeśli są zgodne z drukarką. Załaduj laminat do podajnika ręcznego drukarki kolorowej.
3. Upewnij się, że używasz "głębokiej czerni" lub "czerni rejestracyjnej" podczas drukowania na blasze miedzianej (patrz Abdelgawad i wsp.¹² dla szczegółów), aby umożliwić gęstszą warstwę czarnego atramentu na podłożu miedzianym, chroniąc wydrukowany wzór podczas trawienia. Pozostaw wydrukowane podłoże do całkowitego wyschnięcia na noc.
4. Wewnątrz okapu chemicznego rozgrzać (40 °C) zlewkę z 50 ml wytrawiacza miedziowego. Zanurz wydrukowany laminat w zlewce i delikatnie potrząsaj nim w roztworze przez około 10 minut. Czas trawienia zależy od roztworu wytrawiacza miedzi. Co kilka minut sprawdzaj korozję i sprawdzaj, czy wzór jest nienaruszony.
5. Ostrożnie umyj laminat wodą i usuń powłokę acetonem i etanolem z okapu chemicznego. Umyj jeszcze raz i delikatnie osusz laminat ręcznikiem papierowym.
6. Ostrożnie przymocuj laminat z elektrodami do szkiełka (75 x 25 mm, ~1 mm grubości), za pomocą taśmy dwustronnej. Unikaj kieszeni powietrznych.
7. Przymocuj warstwę perfluoroalkoksylowego PFA do elektrod za pomocą taśmy. Służy to zapobieganiu przypadkowemu kontaktowi elektrod z kroplą, która uszkadza górne elektrody w wyniku zwarcia.

4. Interfejs elektroniczny (obwód na rysunku 2)

1. przekaźniki i kondensatory C do uniwersalnej płytki drukowanej.
2. Zmontuj pozostałe 10 sterowników przekaźników na bezlutowej płytce stykowej dla obwodów elektronicznych.
3. Podłącz wejście sterownika każdego przekaźnika do kanału na tablicy sterowniczej.
4. Ostrożnie zatrzaśnij górne elektrody w złączu (Rysunek 3). Podłącz wyjście każdego sterownika przekaźnika do górnej elektrody, jak pokazano na rysunku. Zwróć uwagę, że między parą przewodów przekaźników znajduje się uziemiony styk złącza, aby zminimalizować szum elektryczny.
   UWAGA: Łącznik znajduje się na regulowanej platformie, aby kontrolować odległość (0.1–0.5 mm) między górnym i dolnym (pokrytym sadzą) podłożem.
5. Użyj programu do kontrolowania czasu dla aplikacji wysokiego napięcia (HV) (około 0.8 sekundy) do 4 elektrod w tym samym czasie, przesuwając 1 elektrodę w kierunku ruchu (tj. na 0.8 sekundy uruchom 1234; następnie 2345, 3456 itd., 0.8 sekundy dla każdej grupy, a następnie do tyłu, więc kropla porusza się również w przeciwnym kierunku).

5. Wizualizacja i obsługa kropel

1. Do rejestrowania ruchu kropel służy system wizualizacji, który składa się z zestawu powiększenia 24X – 96X połączonego z kamerą CCD. Podłącz magnetowid do aparatu za pomocą S-video.
2. Odpipetować 4 μl kropli zawierającej C. elegans w pożywce na dnie podłoża pokrytego sadzą.
3. Doprowadzić górne elektrody do ~0,3 mm powyżej kropli. Kropla powinna znajdować się blisko środka, tuż poniżej piątej elektrody, dla łatwiejszej obsługi.
4. Włącz interfejs elektroniczny i wysokie napięcie (500 V_RMS) i wyreguluj odległość górnej elektrody od kropli, aż zacznie się poruszać. Nie pozwól, aby górne elektrody dotykały kropli.
5. Zbieraj dane, rejestrując liczbę udanych transferów kropel na urządzeniu w odpowiedzi na impulsy elektryczne. Udany eksperyment charakteryzuje się co najmniej 700 transferami kropel, czyli jednym transferem po każdym impulsie elektrycznym.
6. Zbieraj dane w sposób ciągły, aż kropla przestanie się poruszać w odpowiedzi na 5 do 10 impulsów.
   UWAGA: Gdy powierzchnia zaczyna ulegać degradacji, ruch można przywrócić, zbliżając górne elektrody do kropli.

Wyniki

Wcześniej wykorzystaliśmy urządzenia Field-DW do umożliwienia ruchu białek w DMF. W szczególności krople zawierające albuminy surowicy bydlęcej (BSA) mogły być przemieszczane przy stężeniu 2 000 razy wyższym niż zgłaszano wcześniej przez innych autorów (bez dodatków). Było to możliwe dzięki zredukowanej interakcji między kroplą a powierzchnią; Rycina 4 przedstawia kroplę zawierającą znakowaną fluorescencyjnie BSA (szczegóły eksperymentów znajdują się u Freire et al.⁹). Pierwsze zdjęci...

Dyskusja

Najważniejszym etapem protokołu jest ochrona warstwy sadzy, bezpośrednio związana z sukcesem w przemieszczaniu kropel. Metalizacja warstwy sadzy (metoda 1 powyżej) pozwala na blisko 100% sukcesu produkcyjnego. Jednak maksymalny czas pracy to około 10 minut; Możliwe, że frakcje kropelkowe zwilżają sadzę przez otwory w warstwie metalu. Pokrycie warstwy sadzy fluorowaną cieczą jest najłatwiejszą i najszybszą alternatywą i wymaga minimalnych zasobów, ale tylko 40–50% wytworzonych podłoży działa (maksymalnie 20 minut) — a pow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Świeca			Dowolna świeca parafinowa
System napylania	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Powlekarka do napylania Biurko V HP wyposażone w cel Au.
1-dodekanetiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Ciecz fluorowana: Przygotować żywicę Teflon-AF w Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), w celu utworzenia powłoki hydrofobowej.
Oprogramowanie do projektowania graficznego - Adobe Illustrator	Adobe Systems		Można również korzystać z innych programów.
Laminat miedziany	Dupont	LF9110
Xerox	Phaser 6360 lub podobny	Sprawdź zgodność z "głęboką czernią" lub "czernią rejestracyjną" (patrz tekst).
Wytrawiacz miedzi	Transen	CE-100
Folia perfluoroalkoksylowa (PFA)	McMaster-Carr	84955K22
Płytka stykowa	Allied Electronics	70012450 lub podobna	Wystarczająco duża, aby umożliwić montaż 10 sterowników.
Uniwersalna płytka drukowana	Allied Electronics	70219535 lub podobne
Złącze	Allied Electronics	5145154-8 lub podobne
Płytka sterująca i program sterujący (oprogramowanie LabView)	National Instruments	NI-6229 lub podobny
Wzmacniacz wysokonapięciowy	Trek	PZD700
Kondensatory C i C1, 100 nF, 60 V	Sojusznicze
Tranzystor T, NPN	Pokrewny
9350289 Dioda D, 1N4007	Allied
2660007 Przekaźnik	Sprzymierzeni
System wizualizacji	Edmund Optics	VZM 200i lub podobny	Powiększenie systemu 24X – 96X. Jest połączony z kolorową kamerą Hitachi KP-D20B 1/2 cala CCD.
Rejestrator	Sony	GV-D1000 NTSC lub podobny	Jest podłączony do aparatu za pomocą S-video.
Symulacje	COMSOL Multiphysics	V. 4.4

parafinowa Drukarka laserowa 88171838862527