Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52100

⸱

12 grudnia 2014

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół oczyszczania fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) poprzez ultrawirowanie z siatkówki świni/bydła przy użyciu homogenizacji i wirowania w gradionym smaku sacharozy. Protokół ten pozwala na przygotowanie dużych zapasów porcji POS, oznakowanych lub nieoznakowanych, które mogą być następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.

Streszczenie

Analiza jednej z istotnych funkcji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), fagocytoza zużytych starych dystalnych fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) może być przeprowadzona in vitro. Zewnętrzne segmenty fotoreceptorów ze stosami błoniastych dysków zawierających maszynerię fototransdukcji są stale odnawiane w siatkówce. Zużyte punkty sprzedaży są codziennie eliminowane przez komórki RPE. Komórki RPE gryzoni, świń/bydła i ludzi rozpoznają POS różnych gatunków w podobny sposób. Aby ułatwić przeprowadzanie dużych serii eksperymentów o niewielkiej zmienności, duży zapas POS można wyizolować z oczu świń i przechowywać w postaci zamrożonej w porcjach. Protokół ten wykorzystuje cechę fotopigmentów, które mają pomarańczowy kolor, gdy są przechowywane w ciemności. W przyćmionym czerwonym świetle siatkówki są zbierane w buforze z otwartych muszli ocznych przeciętych na pół. Zawiesina komórek siatkówki jest homogenizowana, filtrowana i ładowana do ciągłego gradientu sacharozy. Po odwirowaniu POS znajdują się w dyskretnym paśmie w górnej części gradientu, który ma charakterystyczny pomarańczowy kolor. POS są następnie zbierane, wirowane, ponownie zawieszane sekwencyjnie w myjących, zliczane i porcjowane. Uzyskany w ten sposób POS może być wykorzystany do oznaczania fagocytozy i analizy aktywacji, lokalizacji lub interakcji białek w różnych momentach po prowokacji POS. Alternatywnie, POS może być oznaczony fluoroforami, e. g., FITC, przed podaniem w celu późniejszego ilościowego określenia fluorescencji wiązania lub pochłaniania POS. Inne możliwe zastosowania obejmują wykorzystanie zmodyfikowanego POS lub prowokacji POS w połączeniu z warunkami stresowymi w celu zbadania wpływu stresu oksydacyjnego lub starzenia się na komórki RPE.

Wprowadzenie

W siatkówce widzenie jest wyzwalane przez izomeryzację światłoczułych cząsteczek zwanych opsynami, zanim zostanie przekształcone w sygnał, który może być przekazywany między neuronami aż do obszarów wzrokowych w mózgu. Cząsteczki te są osadzone w stosach błoniastych dysków przypominających naleśniki, które stanowią zewnętrzne części segmentowe komórek fotoreceptorowych (PR). Będąc narażonym na ciągłą ekspozycję na światło, a tym samym znaczny poziom stresu oksydacyjnego, PR stale odnawiają swoje zewnętrzne segmenty, aby ograniczyć potencjalne uszkodzenia oksydacyjne. Zewnętrzne segmenty fotoreceptorów są w bliskim kontakcie z mikrokosmkami wierzchołkowymi sąsiednich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Komórki RPE stanowią zewnętrzną część bariery krew-siatkówka i zapewniają liczne zadania, które są kluczowe dla zdrowia i funkcji fotoreceptorów1, takie jak tłumienie promieni świetlnych przez pigmenty melaniny, reizomeryzacja fotoreaktywnego składnika opsyny siatkówki, dostarczanie składników odżywczych i czynników wzrostu, udział w usuwaniu metabolitów PR.

Ponadto, komórki RPE eliminują zużyte POS i przetwarzają swoje komponenty, co jest codziennym zajęciem, które jest regulowane przez rytm dobowy siatkówki ssaków2,3. Odprawa szopy POS jest absolutnie niezbędna do przetrwania PR. Po całkowitym zniesieniu gromadzą się zanieczyszczenia POS i PR ulegają degeneracji, powodując szybką utratę wzroku4,5. Jeśli profil rytmiczny zostanie utracony i zastąpiony ciągłą aktywnością, wady PR i RPE kumulują się w wieku6 lat. Dlatego bardzo ważne jest scharakteryzowanie molekularnej regulacji fagocytozy RPE in vitro, aby zrozumieć fenotypy związane z jej dysfunkcją. Co ciekawe, maszyneria molekularna w komórkach RPE jest bardzo podobna do tej używanej przez makrofagi do usuwania komórek apoptotycznych i obie są zależne od rozpoznania odsłoniętej fosfatydyloseryny na szczątkach fagocytarnych7-9. Mimo to komórki RPE i makrofagi inaczej regulują fagocytozę, ponieważ makrofagi decydują się na natychmiastową eliminację komórek apoptotycznych w czasie spotkania, podczas gdy komórki RPE rytmicznie pochłaniają POS tylko raz dziennie, pomimo ich stałego kontaktu z zewnętrznymi segmentami. Sugeruje to specyficzne mechanizmy regulacji, które nie są jeszcze w pełni poznane.

Wiele cząsteczek związanych z maszynerią fagocytarną RPE zostało zidentyfikowanych lub zweryfikowanych dzięki użyciu izolowanych testów POS i fagocytozy hodowli komórkowych. Receptor integryny alfavbeta5 zlokalizowany na powierzchni komórki wierzchołkowej RPE, w koordynacji ze swoim ligandem MFG-E8, wiąże się specyficznie z POS10-12, które są następnie internalizowane przez receptor kinazy tyrozynowej MerTK13-15. Wykazano, że receptor wymiatający CD36 uczestniczy w przyjmowaniu POS i wpływa na jego prędkość16,17 i może służyć jako czujnik utlenionych fosfolipidów na powierzchni POS18. Internalizacja wymaga rekrutacji białek związanych z cytoszkieletem F-aktyny, takich jak aneksyna 2,19, miozyna II20 i miozyna VIIA21,22. Natywne lub utlenione POS in vitro są również wykorzystywane do zrozumienia fenotypów starzenia się komórek RPE in vivo związanych z akumulacją słabo strawionego utlenionego POS23-28. Generacja komórek RPE pochodzących z komórek macierzystych zainicjowała nowe zastosowanie izolowanych POS, które są wykorzystywane do udowodnienia funkcjonalności komórek przed ich przeszczepieniem zwierzętom lub pacjentom29,30,27.

Po raz pierwszy opisany przez Moldaya i współpracowników w 198731 roku, protokół izolacji bydła POS łączy etap ultrawirowania homogenatów siatkówki na ciągłych gradientach sacharozy z obserwacją charakterystycznego pomarańczowego wyglądu niebielonego fotopigmentu siatkówki (przenoszącego 11-cis siatkówki). W ciągu ostatnich 10 lat, ze względu na środki ostrożności podjęte w celu zminimalizowania ryzyka choroby szalonych krów, stosowanie oczu świń stało się coraz bardziej widoczne. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak uzyskać duże ilości POS z oczu świń lub bydła, które mogą być porcjowane i przechowywane przez dłuższy czas. Eliminuje to konieczność przygotowania POS z oczu gryzoni, co wymaga użycia dużej liczby zwierząt na przygotowanie i test POS32,33,21,22. Ponadto podano szczegółowe informacje na temat etykietowania POS przed przechowywaniem przy użyciu cząsteczek fluorescencyjnych, aby określić ilościowo i wizualizować POS w uproszczony i porównywalny sposób dla niektórych zastosowań w porównaniu z etykietowaniem POS po teście fagocytozy32,10. Dlatego te duże zapasy pozwalają na powtarzalność i łatwość użycia w wielu różnych typach eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten eksperyment z izolacją POS jest czasochłonny i może zająć do 12 godzin, jeśli POS jest oznaczony przed przechowywaniem. Protokół został zaadaptowany z artykułu opublikowanego przez R.S. Moldaya i współpracowników w 1987 r.31 i zmodyfikowany przez S.C. Finnemanna i współpracowników w 1997 r.

Zwierzęta były traktowane zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokoły zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Karola Darwina z Uniwersytetu Pierre and Marie Curie-Paris 06 oraz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Fordham.

1. Ogólna konfiguracja

  1. Zdobądź 80 świeżych oczu świni lub krowy tak świeżych jak najszybciej po uboju i przechowuj je w chłodzie w ciemności. Przekaż instrukcje dostawcy, aby firma postępowała w ten sam sposób. Ten protokół jest zoptymalizowany dla 80 oczu. Aby postępować z większą liczbą oczu i uzyskać większe zapasy (np. ze 160 oczu), podwój ilość roztworu i wykonaj 2 rundy ultrawirowania; próbki z puli na późniejszym etapie pobierania (zob. etap 2.2.2).
  2. Ustaw na ławce czerwoną lampę safelight, wkładki chłonne, chusteczki (tabela materiałów). Przygotuj 15-centymetrowe naczynia i worki na zagrożenia biologiczne do zbierania odpadów (niewykorzystane części oczu, ciało szkliste...). Noś obcisły fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze rękawów i gogle.
  3. Środki ostrożności:
    1. Wstępnie schłodź wszystkie roztwory, a następnie utrzymuj je w chłodzie podczas wszystkich etapów. Utrzymuj oczy i pochyłości w chłodzie na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.
    2. Oczy i pobrane tkanki należy trzymać w ciemności tak długo, jak to możliwe, aż do etapu pobierania po ultrawirowaniu, aby uniknąć fotowybielania pigmentów wizualnych i utraty pomarańczowo-różowego koloru aktywnej formy fotopigmentów.

2. Działania protokołu

  1. Przygotuj roztwory i gradienty:
    1. Całkowicie rozmrozić bulion z tauryny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Przygotować wszystkie roztwory z roztworów podstawowych (Tabela 1, Roztwory podstawowe) i dokładnie wymieszać sacharozę z innymi składnikami, używając mieszadła magnetycznego dla każdego roztworu.
      1. Przygotować 15 ml roztworu homogenizacyjnego do końcowego stężenia 20% sacharozy, 20 mM octanu tris o pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glukozy i 5 mM tauryny.
      2. Przygotować 25% roztwór sacharozy do końcowego stężenia 25% sacharozy (przy użyciu 70% sacharozy), 20 mM octanu tris pH 7,2, 10 mM glukozy i 5 mM tauryny.
      3. Przygotować 60% roztwór sacharozy do końcowego stężenia 60% sacharozy (przy użyciu sacharozy w proszku), 20 mM octanu tris o pH 7,2, 10 mM glukozy i 5 mM tauryny.
      4. Przygotować roztwór Wash 1 do końcowego stężenia 20 mM octanu tris, pH 7,2 i 5 mM tauryny.
      5. Przygotować roztwór Wash 2 do końcowego stężenia 10% sacharozy, 20 mM octanu tris, pH 7,2 i 5 mM tauryny.
      6. Przygotować roztwór Wash 3 do końcowego stężenia 10% sacharozy, 20 mM fosforanu sodu o pH 7,2 i 5 mM tauryny.
    3. Ustabilizować ekspres gradientowy na mieszadle magnetycznym i włożyć mieszadło do komory najbliżej wyjścia, do którego zostanie wprowadzony 60% roztwór. Użyj odciętej końcówki pipety P200 umieszczonej na wyjściu rurki, aby uzyskać odpowiednią prędkość odlewania.
    4. Delikatnie odlać gradienty liniowe, rozcieńczając i mieszając 60% roztwór sacharozy z 25% roztworem, używając 12 ml z każdego roztworu (tj. łącznie 6 probówek na 80 oczu) we wstępnie schłodzonych probówkach ultrawirówek. Dobrze wymieszaj stopniowo rozcieńczający 60% roztwór sacharozy. Ustal prędkość przepływu gradientowego, wlewając roztwór płynnie i niezbyt szybko.
      UWAGA: Aby uzyskać ciągły, liniowy gradient, należy utrzymać otwór końcówki pipety dokładnie na powierzchni roztworu przez cały proces tworzenia gradientu.
    5. Pozostaw gradienty na lodzie na około 1 godzinę w celu stabilizacji. Utrzymuj gradienty w chłodzie do momentu załadowania. Nie potrząsaj rurkami, aby zapobiec zakłóceniu gradientu.
  2. Pobieranie tkanek:
    1. Zbieraj tkanki w przyćmionym czerwonym świetle. Weź oko w jedną rękę i szturchnij przód krawędzią żyletki, trzymając oko z dala (aby uniknąć rozpryskiwania; Rysunek 1). Użyj żyletki, aby przeciąć przednią gałkę oczną na 2 połówki (rogówka plus co najmniej 5 mm w twardówce). Zdejmij soczewkę i odwróć muszlę oczną na lewą stronę, tak aby można ją było trzymać na czubku jednego palca, odsłaniając w ten sposób siatkówkę.
    2. Używając żyletki pod kątem, delikatnie zeskrob siatkówkę, łatwo odrywając się i wyglądając jak różowawa warstwa, z powierzchni tapety i przeciąć głowę nerwu wzrokowego (ryc. 1). Zebrać wszystkie siatkówki w 2 probówkach po 50 ml, z których każda zawiera 15 ml roztworu homogenizacyjnego na lodzie.
    3. Homogenizacja siatkówki:
      1. Energicznie wstrząsać zawiesiną ręcznie przez 2 minuty w celu przerwania różnych warstw komórek, oderwania POS od reszty komórki PR, fragmentacji POS i homogenizacji zawiesiny siatkówki.
      2. Przefiltruj 3x przez podwójną warstwę czystej gazy, aby usunąć duże fragmenty tkanek i zebrać przepływ do czystych probówek o pojemności 50 ml (Rysunek 1). Zawiesina siatkówki jest dość gruba, aby zmaksymalizować wydajność, delikatnie dociśnij gazę, aby uwolnić pozostałe rozdrobnione tkanki po każdej filtracji.
  3. Izolacja fragmentu zewnętrznego segmentu fotoreceptora (POS):
    1. Delikatnie ułóż surowy preparat siatkówki, około 6 - 7 ml na probówkę, na 6 x 30 ml probówek ultrawirówek, z których każda zawiera 24 ml świeżo schłodzonej, ciągłej sacharozy o 25-60% gradiencie (ryc. 1). Zrównoważyć przeciwległe rury odpowiednio do używanego wirnika. Ultrawirować przy 106 000 x g przez 50 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć większość roztworu powyżej pomarańczowo-różowego pasma w górnej jednej trzeciej gradientu przez aspirację (Rysunek 2A). Zbierz pomarańczowo-różową opaskę z odciętą końcówką P1000 do zlewki. Wyrzuć resztę po neutralizacji za pomocą wybielacza (odpady biologiczne).
    3. Rozcieńczyć ~4 - 5 objętościami lodowatego roztworu Wash 1. Rozdzielić na tyle probówek o pojemności 30 ml, ile potrzeba. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucić sklarowany sklarowany osad.
    4. Zawiesić granulki w 10 ml roztworu Wash 2 i wirować w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut, jak opisano powyżej. Zawiesić granulki w 15 ml Wash 3 i ponownie wirować w temperaturze 3 000 x g przez 10 min. Połącz zawiesiny z kilku granulek, aby zmniejszyć liczbę probówek potrzebnych przed odwirowaniem w roztworach Wash 2 i Wash 3.
  4. Porcjowanie POS bez etykietowania:
    1. Zawieś ponownie POS w 10 - 20 ml DMEM. Rozcieńczyć wstępnie 10 μl w 490 μl DMEM (1:50) i policzyć wydłużone oraz wirowane POS w komorze do liczenia komórek (rysunek 2B). Obliczanie wydajności i stężenia w cząstkach POS na ml.
      UWAGA: Wydajność jest różna, w zależności głównie od wieku i rasy świń/krów oraz wielkości oczu, np. dobry preparat waha się od 5 - 8 x 109 POS od 80 oczu świni.
    2. Zdecyduj o końcowej objętości DMEM (zwykle 10 - 20 ml) i dodaj sacharozę, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5% sacharozy.
    3. Przygotować porcje o pożądanej wielkości, np. 5 x 107 POS na probówkę na 2 ml objętości do ponownego zaparcia w 96-dołkowym eksperymencie przy 40 μl/basenik. Wirować 1 porcję przez 5 minut przy 2,300 x g przy RT i ocenić wielkość granulki. Przygotuj różne wielkości porcji dla różnych objętości aplikacji, ponieważ POS NIE powinien być dwukrotnie zamrażany i rozmrażany.
    4. Zamrażać porcje POS w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Podwielokrotności są stabilne przez wiele miesięcy. W naszych rękach nieoznakowane lub oznaczone POS mogą być przechowywane przez co najmniej rok.
  5. Etykietowanie i porcjowanie POS:
    UWAGA: Zazwyczaj używamy FITC do oznaczania POS do ilościowego oznaczania testów fagocytozy, ale w zależności od potrzeb można również stosować inne barwniki.
    1. Zawiesić 1 fiolkę 10 mg FITC o stężeniu 2,5 mg/ml w 0,1 M buforze węglanowym o pH 9,5, mieszając 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 o pH 8,4 z 1,4 ml 0,1 M Na2CO3 pH 11,5 (Tabela 2, roztwory podstawowe). Obracaj przez 1 godzinę przy natężeniu obrotowym, chroniąc przed światłem i wiruj przez 5 minut z maksymalną prędkością, aby osadzać niezawieszone ciała stałe FITC.
    2. Zawiesić osad POS w 10 ml roztworu Wash 3 (lub DMEM) i dodać 2 ml roztworu FITC na 80 oczu. Przechowuj resztki FITC zamrożone w temperaturze -80 °C. Obracaj przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze RT. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
    3. Przemyć oznakowany POS dwukrotnie roztworem Wash 3, jak opisano w sekcji 2.3.4, a następnie raz lub dwa razy w DMEM, aż prawie nie będzie widać wolnego FITC we frakcji sklarowanej nad osadem. Ponownie zawieś POS w DMEM i postępuj jak w przypadku nieoznakowanego POS do liczenia i porcjowania (sekcja 2.4).
  6. Korzystanie z POS w eksperymentach:
    1. Rozmrozić POS w RT i trzymaj je w ciemności tak bardzo, jak to możliwe, jeśli są oznaczone fluorescencyjnie. Wirować przez 5 minut przy 2 300 x g przy RT. Odessać supernatant.
    2. Natychmiast ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości roztworu do oznaczania, zgodnie z zaleceniami doświadczenia. W przypadku różnych godzin wyzwania POS, przechowuj zawieszony POS w RT w ciemności między punktami czasowymi przez kilka godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Połączenie liniowego gradientu sacharozy i ultrawirowania umożliwia rozdzielenie różnych składników zawiesiny siatkówki w zależności od ich gęstości. Cięższe, większe zanieczyszczenia siatkówki oraz komórki RPE opadają na dno lub w okolice dna gradientu (Rysunek 2A). Lżejsze POS oraz lżejsze pojedyncze komórki lub fragmenty komórek siatkówki migrują w postaci oddzielnych prążków, osiągając górną połowę gradientu pod koniec procesu wirowania. Dzięki przechowywaniu oczu i próbek w ciemności aż do zakończen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Trzy etapy lub warunki są kluczowe dla zoptymalizowanego oczyszczania: jakość odlewu gradientowego i delikatna manipulacja rurkami gradientowymi, utrzymywanie tkanek w chłodzie i ciemności do etapu pobierania, siła wstrząsania homogenatów siatkówki w celu uzyskania właściwej izolacji POS od reszty komórki PR. Jeśli pojawią się jakieś problemy z prawidłowym widzeniem pomarańczowego paska, najprawdopodobniej są one spowodowane jednym z trzech powyższych powodów (patrz również drugi akapit sekcji Wyniki ). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses/Jeunes Chercheurs do EFN), Fondation Voir et Entendre i Fondation Bettencourt Schueller (Stypendia dla Młodych Badaczy dla EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, stałe stanowisko dla EFN) oraz The National Eye Institute of the National Institutes of Health (R01-EY13295 do SCF). Ponadto Institut de la Vision jest finansowany przez Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique i Départment de Paris.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Specyficzny materiał/Wyposażenie
2 Ekspresdo komór Gradient z komorami 30 ml Rurki
silikonowe o średnicy 3 mmdo odlewania gradientowego
Mały rozmiar mieszadłamagnetycznego Mieszadło pasujące do komory gradientu Czerwona
lampaLampa inaktyniczna do preparacji w ciemne
probówki Ultra Clear 25 x 89 cmBeckman344058Probówki do ultrawirówek
PP Dąb Probówki kalenicoweNalgene3119-0050Probówki wirówkowe 30 ml
Optima LE-80KUltrawirówka Beckman Coulter365668SW
32Ti RotorBeckman Coulter369694Rotor obrotu do ultrawirówki
Avanti J-26 XPWirówka393124
JA-25.50 Rotor363058 redlic Beckman dowirówki Avanti J-26 XP
FITC Isomer ILife TechnologiesF-1906Barwnik
Inne materiały/urządzenia
Komora liczenia (np. Neubauer lub Malassez)
Ciemne wiadra na lód z pokrywkami
Wagi
Mieszadło magnetyczne i drążek
Mikrowirówka
37 ° C łaźnia
° C zamrażarka
Materiały eksploatacyjne
FartuchBezpieczeństwo i higiena pracy
Rękawice
Ochraniacze rękawów
Gogle
Wkładki
Worki i kosze
Ostrza Weck-PrepRozwarstwianieOstrza maszynki do golenia o szerokości 60 mm/2,25 cala Plastikowe
naczynie
Sterylne arkusze
Probówki 15 i 50 ml Typowemateriały eksploatacyjne
Mikroprobówki
Folia
gradientowy safelight do Beckman Coulter fluorescencyjnypodtrzymującychłodnicza wodna-80 laboratoryjny chłonnena śmieci Biohazard15 cmgazy aluminiowa

Bibliografia

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
  3. LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
  4. Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
  5. Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
  6. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  7. Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
  8. Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
  9. Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
  10. Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
  11. Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
  12. Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
  13. Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
  14. Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
  15. Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
  16. Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
  17. Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
  18. Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
  19. Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  20. Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
  21. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  22. Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
  23. Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
  24. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  25. Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
  26. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  27. Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
  28. Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
  29. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152(2009).
  30. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
  31. Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
  32. Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
  33. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  34. Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
  35. Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
  36. Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
  37. Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
  38. Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
  39. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  40. Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
  41. Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
  42. Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
  43. Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
  44. Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
  45. Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wirowanie w gradiencie sacharozyhomogenizacja tkanekkwantyfikacja fluorescencjicytometria przepływowaimmunoblottingizolacja POSfunkcja komórek RPE
Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.