Artykuł metodologiczny

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

DOI:

10.3791/52101

⸱

2 listopada 2014

 , 
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowego obrazowania poklatkowego żywych embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy. Program rozwojowy odpowiedzialny za budowę wysoce uporządkowanej, złożonej struktury ślimaka ssaków trwa około dziesięciu dni. W celu zbadania zmian w ekspresji genów w tym okresie i ich reakcji na manipulacje farmaceutyczne lub genetyczne, konieczne jest długoterminowe obrazowanie. Wcześniej obrazowanie na żywo było zazwyczaj ograniczone przez żywotność eksplantowanej tkanki w wilgotnej komorze na szczycie standardowego mikroskopu. Trudności w utrzymaniu optymalnych warunków do wzrostu kultur w odniesieniu do wilgotności i temperatury nałożyły ograniczenia na długość eksperymentów obrazowych. Mikroskop zintegrowany ze zmodyfikowanym inkubatorem do hodowli tkankowych zapewnia doskonałe środowisko do długotrwałego obrazowania na żywo. W tej metodzie pokazujemy, jak ustalić embrionalne eksplantaty ślimaka myszy i jak używać mikroskopu inkubatora do przeprowadzania obrazowania poklatkowego przy użyciu zarówno jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania zachowania typowego eksplantatu ślimakowego w dniu embrionalnym (E) 13 i Sox2, markera komórek prosensorycznych ślimaka, przez 5 dni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ślimak ssaków jest wysoce uporządkowanym, złożonym organem. U myszy, pomiędzy wyłonieniem się prymitywnego ucha wewnętrznego z pęcherzyka usznego w dniu E11 a zakończeniem programu rozwojowego we wczesnych stadiach posturodzeniowych, zachodzi wiele fal sygnalizacji komórkowej i skoordynowanych zmian w ekspresji genów. Od podstawy do wierzchołka przewodu ślimakowego biegnie nabłonek czuciowy wykrywający dźwięk, czyli narząd Cortiego. Rozwój narządu Cortiego jest doskonale kontrolowany w taki sposób, że pod koniec rozwoju będzie on składał się z pojedynczego rzędu wewnętrznych komórek rzęsatych, trzech rzędów zewnętrznych komórek rzęsatych przeplatanych pięcioma rzędami komórek podporowych (dwa rzędy komórek filarowych, trzy rzędy komórek Deitera)1. Odchylenie od tej precyzyjnej kolejności powoduje utratę słuchu, co podkreśla znaczenie badania genezy i wzorca nabłonka czuciowego2.

Hodowla in vitro ślimaka embrionalnego myszy jest niezbędnym narzędziem w badaniu mechanizmów rozwoju narządu Cortiego. Technika ta została opracowana w 1974 roku i w ciągu ostatnich 40 lat była wykorzystywana do wyjaśnienia wielu mechanizmów, za pomocą których określa się nabłonek czuciowy i ustanawia się narząd Cortiego3. Ślimak jest złożonym narządem o dynamicznych procesach rozwojowych; Manipulacja może trwać nawet siedem dni, aby zamanifestować1. Na przykład, po dodaniu inhibitorów GSK 3β do hodowli eksplantatów ślimaka w temperaturze E13, optymalny okres inkubacji w celu zaobserwowania silnego działania związku wynosi sześć dni4.

Obrazowanie na żywo rozwijającego się ślimaka pozwala na badanie zmian w morfologii organu Cortiego, zmian w ekspresji genów, śledzenia migrujących, proliferujących lub umierających komórek, a także pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wyników działania środków farmaceutycznych i zakłócania szlaków sygnałowych. Do tej pory obrazowanie ślimaka na żywo było wykonywane głównie przy użyciu mikroskopii konfokalnej do obrazowania małych obszarów narządu Cortiego w krótkich okresach czasu5-8, ale technika ta ma ograniczenia ze względu na żywotność eksplantatu. W obrazowaniu wpływu długoterminowych manipulacji na powolne procesy rozwojowe kluczowe znaczenie ma środowisko obrazowania. Zazwyczaj konfokalny system obrazowania na żywo wykorzystuje nawilżone plastikowe pudełko, które umieszcza się na mikroskopie. Ciepło i wilgoć mogą uciekać przez szczeliny w komorze inkubacyjnej, gdzie stykają się ze stołem mikroskopu, przez okna dostępu, przez otwory na zawiasach oraz przez szczeliny wokół różnych części mikroskopu, takich jak obiektyw lub źródło światła. Nie jest to optymalne dla utrzymania zdrowych eksplantatów przez więcej niż dwa lub trzy dni.

Definiujemy 'mikroskop inkubatorowy' jako odwrócony mikroskop zamknięty wewnątrz standardowego inkubatoraCO2, a nie inkubator zbudowany wokół mikroskopu. Mikroskop w inkubatorze wydłuża czas trwania eksperymentu w taki sposób, że zamiast obrazowania przez dwa lub trzy dni, próbki mogą być obrazowane przez okres do dwóch tygodni. Mikroskop w inkubatorze zapewnia doskonałe środowisko do wzrostu i różnicowania komórek, przy minimalnych zakłóceniach hodowli eksplantatów i standardowych kontrolowanych warunkach. W badaniach, które odbywają się przez wiele dni, często stosuje się codzienne pobieranie próbek obrazowych, wyjmując je z inkubatora i przenosząc do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Chociaż takie podejście może być skuteczne, wyjęcie szalek z inkubatora powoduje stres we wrażliwej rozwijającej się tkance. Zmiany kwasowości podłoża hodowlanego i wahania temperatury spowodowane wyjęciem z inkubatora mogą skutkować nieoptymalnym rozwojem i niezdrowym stanem tkanek. Obrazowanie tego samego obszaru w tej samej płaszczyźnie ogniskowej i w tej samej orientacji w każdym punkcie czasowym jest niezwykle trudne. Dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego systemu w inkubatorze możliwe jest utrzymanie zdrowych tkanek, zbieranie obrazów w większej liczbie punktów czasowych i zapewnienie, że ten sam obszar zostanie uchwycony w każdej klatce. W ostatnich latach opracowano kilka zintegrowanych inkubatorów tkanek pod mikroskopem, które okazały się przydatne nie tylko w praktyce klinicznej9, ale także w badaniach nad komórkami macierzystymi i nowotworami10,11.

Tutaj prezentujemy protokół długoterminowego obrazowania na żywo embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy. Używamy zautomatyzowanego systemu mikroskopowego wewnątrz standardowego inkubatoraCO2, który ma możliwość rejestrowania obrazów wielu próbek w określonych punktach czasowych. System składa się z odwróconego mikroskopu umieszczonego wewnątrz inkubatora. Próbki są umieszczane na obrotowym podium, które umożliwia obrazowanie wielu próbek w każdym punkcie czasowym. Oświetlenie, przechwytywanie obrazu i obracanie podestu są kontrolowane przez zautomatyzowany system obsługiwany przez oprogramowanie Metamorph. Ustawiając procedurę obrazowania za pomocą oprogramowania operacyjnego, możemy ustawić eksperyment tak, aby trwał do dwóch tygodni przy minimalnej interwencji człowieka. W tym przykładzie używamy zarówno jasnego pola, jak i fluorescencji, aby pokazać wielkoskalowy wzrost i rearanżację ślimaka, a konkretnie regionu prosensorycznego. W tym eksperymencie ślimaki zostaną wypreparowane od myszy reporterowych Sox2EGFP w dniu embrionalnym E13. Zostaną założone kultury in vitro, a następnie zobrazowane w ciągu pięciu dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka myszy została pobrana od myszy Sox2EGFP-reporter 12 utrzymywanych i uśpionych zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Hodowla ślimaków embrionalnych

  1. Uzupełnij zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, mieszając 8,89 ml DMEM, 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 μl 100x suplementu N2 i 10 μl 10 mg/ml cyprofloksacyny. Uzupełnij Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), mieszając 495 ml HBSS z 5 ml 100% HEPES.
  2. Przygotuj naczynia z kulturą szklanego dna:
    1. W okapie z przepływem laminarnym zawiesić 200 μl substratu do ekstrakcji błony podstawnej w 5 ml DMEM. Przygotuj naczynia hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z dołkami 10 mm. Odpipetować 150 μl substratu/DMEM do środka każdego naczynia ze szklanym dnem. Szalki te mogą być używane po 40 minutach inkubacji lub mogą być przechowywane w inkubatorze CO2 w temperaturze 35 °C przez co najmniej tydzień.
      UWAGA: Naczynia ze szklanym dnem są używane z następujących powodów: aby zapewnić, że podstawa naczynia jest przezroczysta i odpowiednia do obrazowania, aby stworzyć studzienkę w środku naczynia, która pozwala eksplantatom osiedlić się w łatwym do zlokalizowania obszarze i wreszcie, aby po eksperymencie próbka mogła zostać przetworzona do barwienia immunologicznego i późniejszej analizy.
  3. Przygotuj stanowisko pracy i narzędzia:
    1. Włącz czystą ławkę z przepływem laminarnym i spryskaj ją 70% EtOH, aby stworzyć czystą przestrzeń roboczą. Namocz kleszcze, łyżki i czarną naczynie z elastomeru silikonowego 184 (mieszanka elastomeru silikonowego 184 (10 części), utwardzacza (1 część) i węgla drzewnego w proszku (2,5 g)) w 70% EtOH.
  4. Na czystym stanowisku pracy zbierz zarodki do eksperymentu. Zebrać zarodki odpowiedniej ciąży w lodowatym HBSS z dodatkiem 1% HEPES.
    1. Określ zewnętrzny lub widoczny narząd, który będzie wykazywał aktywność reporterową i zbadaj zarodki za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Zbierz zarodki, które wykazują aktywność reporterową w lodowatym HBSS uzupełnionym 1% HEPES, ponieważ są one przedmiotem eksperymentu.
  5. Zbierz kości skroniowe:
    1. Pracując szybko, używając chłodnego źródła światła i drobnych kleszczy, zbierz głowy szczeniąt. Uważaj, aby zapiąć kręgi szyjne i poniżej szczęki, aby uniknąć uszkodzenia kości skroniowych.
    2. Ostrożnie otwórz czaszkę. Usuń mózg, odetnij przód głowy i przenieś tylną czaszkę do świeżego, lodowatego HBSS uzupełnionego 1% HEPES w czystym naczyniu. Ostrożnie wypreparuj kości skroniowe w kształcie orzeszków ziemnych, uważając, aby utrzymać układ przedsionkowy w takcie.
  6. Wypreparuj ślimak:
    1. Przenieś kości skroniowe do czarnego naczynia pokrytego elastomerem silikonowym w lodowatym HBSS uzupełnionym 1% HEPES, przypnij przedsionkową część kości. Włóż szpilki do owadów pod skosem, aby ustabilizować kość skroniową i zrobić miejsce na kleszcze. Przypinanie jest kluczowym krokiem w tym procesie, ponieważ jeśli kość skroniowa może się zbytnio poruszać, bardzo trudno jest pobrać nienaruszony ślimak.
    2. Ostrożnie usuń chrząstkę otaczającą ślimak. Włóż jeden ząb kleszczy do chrząstki na zewnętrznej krawędzi podstawy ślimaka i wciśnij otwór w chrząstkę.
    3. Przypnij klapkę z boku, włóż ząb kleszczy i delikatnie oddziel dach kanału od chrząstki. Przypnij poziomo w poprzek góry i po przekątnej, a następnie ostrożnie zdejmij przednią część kapsułki. Włóż ząbek kleszczyków między pozostałą chrząstkę a kanalik i delikatnie odetnij ostatni odcinek. Wierzchołkowa powierzchnia ślimaka jest teraz odsłonięta.
    4. Zaczynając od podstawy, złap obszar, w którym dach kanału styka się z nabłonkiem ślimaka i otwórz przewód ślimakowy. Delikatnie zdejmij dach, przycinając w razie potrzeby, aż zostanie całkowicie usunięty. Odetnij wszelkie części membrany pozostawione po środkowej stronie kanału. Oczyść przewód z nadmiaru tkanki mezenchymalnej i odłącz przewód od układu przedsionkowego.
  7. Uprawa eksplantatów:
    1. Umieść eksplantat, powierzchnią świetlistą do góry, na środku naczynia hodowlanego ze szkła pokrytego podłożem, ostrożnie odciągnij cały płyn i pozostaw na dwie minuty. Dodaj kroplami 150 μl suplementowanego DMEM do eksplantatu, uważając, aby go nie zakłócić. Jeśli eksplant unosi się swobodnie, zmień położenie za pomocą kleszczy, ale należy uważać, aby eksplant osiadł na dnie naczynia, aby mógł przymocować się do podłoża.
    2. Umieść naczynia ze szklanym dnem na głębokiej szalce Petriego o średnicy 12 cm, z małym naczyniem ze sterylną wodą, aby utrzymać wilgotność. Umieścić kultury w inkubatorze o temperaturze 35 °C na noc, aby eksplant przyczepił się do podłoża i spłaszczył.

2. Obrazowanie na żywo

  1. Wybierz próbki eksplantatów. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić stan każdego eksplantowanego ślimaka. Wybieraj tylko eksplantaty, w których kanał jest nienaruszony i przymocowany do szkła od podstawy do wierzchołka.
  2. Ustawić inkubator w temperaturze 35 °C z 5% CO2 w celu hodowli tkanki ślimakowej. Umieść kultury w mikroskopie inkubatora:
    1. Delikatnie odessać uzupełniony DMEM i zastąpić go co najmniej 500 μl świeżej pożywki. Do obrazowania do 6 dni lepsze jest 1-1,5 ml. W przypadkach, gdy eksplantaty są luźno przymocowane, odpipetuj pierścień pożywki wokół krawędzi naczynia. Ten dodatkowy płyn utworzy miniaturową "nawilżoną komorę" bez zakłócania eksplantatu, podczas gdy będzie on nadal przyczepiał się do matrycy.
      1. Alternatywnie, użyj pokryw naczyń na zawiasach, aby otworzyć pokrywki, podczas gdy naczynie pozostaje w swoim dopasowaniu w mikroskopie, jeśli konieczna jest wymiana odczynników w przerwach między pobieraniem obrazów. Pokrywy naczyń na zawiasach umożliwiają otwieranie pokrywek bez naruszania próbek lub wyjmowania naczyń z ich ustawień. Dzięki temu zachowane zostanie ich dokładne położenie dla kolejnych przechwyconych obrazów.
    2. Włóż naczynia ze szklanym dnem zawierające odpowiednie próbki do uchwytu na próbki. Mikroskop w tym przykładzie ma obrotową platformę, na której znajduje się osiem szalek na próbki o średnicy 35 mm.
    3. Pod pokrywą z przepływem laminarnym zastąp plastikowe pokrywki szklanymi pokrywkami i włóż naczynia do uchwytu na próbki. Umieść uchwyt na miskę na próbkę wewnątrz inkubatora, uważając, aby nie usunąć eksplantatów z dna naczynia ani nie naruszyć podłoża.
  3. Skonfiguruj procedurę obrazowania:
    1. Włącz mikroskop, lampę UV i kamerę, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania.
    2. Zlokalizuj próbki, wybierz obszar obrazowania, płaszczyznę ostrości i dostosuj czasy ekspozycji dla każdej potrawy po kolei. Wybierz płaszczyznę ostrości w zależności nie tylko od widoku eksplantatu w momencie rozpoczęcia, ale także mając na uwadze, jak tkanka będzie się poruszać i jak długo będzie trwał przebieg czasu.
    3. Ustawia stos Z wyśrodkowany wokół wybranej płaszczyzny ogniskowej w kanale fluorescencji. Ustaw częstotliwość i długość próbkowania dla eksperymentu. Częstotliwość próbkowania będzie ograniczona czasem potrzebnym na zebranie obrazów, więc należy ją określić po wybraniu pól widoku i ustawieniu stosu Z. W tym przypadku pobieranie próbek odbywa się co 30 minut przez pięć dni. Czas trwania eksperymentu może wynosić do 14 dni.
  4. Wygeneruj film:
    1. Pod koniec okresu poklatkowego otwórz pliki obrazów. W tym przypadku używane jest oprogramowanie Metamorph, które otwiera sekwencyjne punkty zbiórki. Klatka po klatce wybierz najlepszą płaszczyznę ogniskowej do pokazania interesującej nas populacji komórek.
    2. Przekonwertuj te obrazy na plik .avi lub wyeksportuj je jako montaż, aby wygenerować zestaw obrazów, które można otworzyć i przeanalizować w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu lub przekonwertować do wielu formatów za pomocą oprogramowania do przetwarzania wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy montaż (Rysunek 1) i film (Rysunek 2) pokazujący, jak typowy organotypowy eksplant ślimakowy będzie rósł, jeśli zostanie posiany na E13.5. Do wizualizacji obszaru prosensorycznego użyto myszy reporterskiej Sox2. Film ilustruje, że ślimak ulega wzrostowi, konwergencji i rozszerzeniu, komórki w bocznym obszarze zielonej domeny Sox2 nie wydają się dzielić wraz z rozszerzaniem się otaczającej go tkanki. Jest to cecha charakterystyczna narządu Cortiego; na E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka kwestii technicznych, które należy wziąć pod uwagę podczas zakładania kultur i ustawiania mikroskopu poklatkowego w celu uzyskania długotrwałego obrazowania.

Jako substrat do hodowli eksplantatów ślimakowych używamy macierzy błony podstawnej, ale podłoże powinno być dopasowane do typu komórki. Na przykład, aby zobrazować hodowle neuronów, lepszym rozwiązaniem może być zapewnienie powłoki fibronektyny. Temperaturę inkubacji i skład gazu należy również dobrać w zależności od rodza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję Willy'emu Sunowi za pomoc techniczną i Dr. Krisowi Gellynckowi za pomocne komentarze oraz trzem anonimowym recenzentom za konstruktywne rady. Praca ta została sfinansowana przez Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowane media Eagle firmy DulbeccoGibco12430Wiele marek produkuje ten
ekstrakt z membrany podstawnej Corning354230Matrigel. Alternatywne podobne produkty są dostępne u innych dostawców.
http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Zewnątrzkomórkowe+Macierz+Białka+ECM+i+Przyłączenie+Czynniki%28Nauki przyrodnicze%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000044Wiele marek produkuje to
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
HEPESGibco5630080Wiele marek produkuje to
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
100 x suplement N2Gibco17502-048Wiele marek produkuje to
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
CiprofloksacynaSigma Aldrich17850-5G-FWiele marek produkuje to
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
Zbilansowany roztwór soli HankaGibco14170161Wiele marek to produkuje. Przed użyciem należy go ponownie sprawdzić.
http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Szczypce do drobnych narzędzinaukowych11254-20Numer rozmiaru 5
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Curette Narzędzia Fine Science10080-05rozmiar 1 mm 
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Szpilki do owadówFine Science Tools26001-35Musi być ze stali nierdzewnej
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm plastikowe naczyniaCorning/Falcon351006Wiele marek produkuje ten
węgiel drzewnySigma Aldrich05105-250GWiele marek produkuje podobne przedmioty
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184 elastomer silikonowyDow / Corning SYLGARD® 184 ZESTAW ELASTOMERÓW SILIKONOWYCHPotrawy są przygotowywane domowo z kilkutygodniowym wyprzedzeniem. Elastomer silikonowy może pochodzić od dowolnego dostawcy.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-0-10-CWymiary naczynia są określone przez specyfikację systemu obrazowania.  średnica 35 mm, Szkiełko nakrywkowe 10mm nr 0 pasuje do Olympus Vivaview FL.
http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2
Mikroskop stereoskopowyZeiss Numer telefonu 495101-9804-000  Model Stemi 2000. Wiele marek produkuje podobne przedmioty
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Źródło zimnego światłaZeiss000000-1063-182Wiele marek produkuje podobne przedmioty
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Mikrosystemy LeicaSkontaktuj się z Leica microsystemsLeica M165-FC. Wiele marek produkuje podobne przedmioty
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Inkubator Mikroskop + oprogramowanie do obrazowaniaOlympusKontakt OlympusOdwrócona mikrokopa zamknięta w inkubatorze Co2. Mikroskop inkubatorowy Vivaview FL z autorskim oprogramowaniem do obrazowania Metamorpoh.
http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Czysta ławkaThermo Scientific51029701Wiele marek produkuje podobne przedmioty
http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
Inkubator CO2Thermo Scientific3310Wiele marek produkuje podobne przedmioty
http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Okap z przepływem laminarnymThermo Scientific51026651Wiele marek produkuje podobne przedmioty
http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
  2. Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
  3. Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
  4. Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
  5. Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
  6. Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6(2013).
  7. Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
  8. Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
  9. Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
  10. Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
  11. Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
  12. Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
  13. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura eksplantu limakamikroskop inkubatorowymysz z fluorescencyjnym reporteremlimak w 13 dniu embrionalnymekspresja markera Sox2mikroskopia w polu jasnymmikroskopia fluorescencyjnazautomatyzowana rutyna obrazowaniainkubator do hodowli tkanek

Powiązane artykuły