Artykuł metodologiczny

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

DOI:

10.3791/52109

⸱

25 listopada 2014

 ,  , 
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy sekcję rdzenia nerwowego w jamie brzusznej raka. Preparat składa się z dwóch ostatnich zwojów piersiowych (T4, T5) oraz łańcucha zwojów brzusznych (A1 do A6). Ten łańcuch zwojów obejmuje część ośrodkowego układu nerwowego (OUN), która napędza skoordynowaną lokomocję pleopodów (swimmerets): układ swimmeret. Od ponad pięciu dekad wiadomo, że u raków każdy pływak jest napędzany przez swój własny, niezależny wzór generujący jądro, które generuje rytmiczną naprzemienną aktywność 1-3. Neurony ruchowe unerwiające muskulaturę każdego pływaka tworzą dwie anatomicznie i funkcjonalnie odrębne populacje 4. Jeden z nich jest odpowiedzialny za retrakcję (skok mocy, PS) pływaka. Drugi napędza protrakcję (ruch powrotny, RS) pływaka. Neurony ruchowe układu pływackiego są w stanie spontanicznie wytworzyć fikcyjny wzorzec motoryczny, który jest identyczny ze wzorcem zarejestrowanym in vivo1.

Celem tego raportu jest wprowadzenie interesującego i wygodnego systemu modelowego do badania sieci generujących rytm i koordynacji niezależnych mikroukładów dla praktycznych kursów laboratoryjnych dla studentów. Dostarczony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące preparacji rdzenia nerwowego jamy brzusznej raka, przypinania izolowanego łańcucha zwojów, usuwania zwojów i rejestrowania fikcyjnego wzorca motorycznego pływaka zewnątrzkomórkowo z izolowanego układu nerwowego.

Dodatkowo, możemy monitorować aktywność neuronów pływaków zarejestrowanych wewnątrzkomórkowo z dendrytów. Tutaj również opisujemy pokrótce te techniki i podajemy kilka przykładów. Ponadto morfologię neuronów pływaka można ocenić za pomocą różnych technik barwienia. Tutaj podajemy przykłady wewnątrzkomórkowych (za pomocą jonoforezy) neuronów wypełnionych barwnikiem i zasypek basenów neuronów ruchowych pływaka. W naszym laboratorium używamy tego preparatu do badania podstawowych funkcji fikcyjnej lokomocji, wpływu sensorycznego sprzężenia zwrotnego na aktywność OUN oraz koordynacji między mikroobwodami na poziomie komórkowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pływaki raków pełnią funkcję kontroli postawy i biją rytmicznie, gdy zwierzęta płyną do przodu, wietrzą swoje nory lub samice napowietrzają swoje jaja 5, 6. Pływaki raka sygnałowego, Pacifastacus leniusculus, występują parami od drugiego do piątego segmentu brzusznego, z jedną kończyną po każdej stronie odwłoka 7. Ośrodkowy układ nerwowy sam wytwarza rytmiczny tupot motoryczny, który napędza ruch pływaka u nienaruszonego zwierzęcia, jak również w izolowanym preparacji rdzenia nerwowego. Gdy nie ma sensorycznego sprzężenia zwrotnego lub zstępującego bodźca, wytworzony rytmiczny wzorzec motoryczny nazywa się fikcyjną lokomocją1, 2. W systemie swimmeret ten wzorzec motoryczny nie różni się żadnym parametrem od aktywności pływaków mierzonej u nienaruszonego zwierzęcia.

Ruch każdego pływaka jest napędzany przez mikroukład, który znajduje się w jednym odpowiadającym mu hemiganglionie 1 - 3 i jest do niego ograniczony. W każdym mikroukładzie znajduje się jądro generujące wzór, które składa się z pięciu zidentyfikowanych interneuronów bez impulsów. Można je funkcjonalnie scharakteryzować jako inhibitor udaru siłowego (IPS) lub inhibitor udaru powrotnego (IRS) 8. Te interneurony IPS i IRS nie są endogennymi oscylatorami, a ich naprzemienna aktywność jest napędzana przez wzajemne hamowanie 9. Ponieważ te interneurony hamują neurony ruchowe pływaka bezpośrednio, generowany jest naprzemienny ruch PS-RS 10. Lokomocja wymaga jednak nie tylko generowania aktywności, ale także koordynacji różnych niezależnych mikroukładów. W systemie pływania taka koordynacja jest ustalana przez koordynujący mikroukład, który zapewnia, że kończyny są aktywne we właściwym czasie. Ten mikroobwód jest zbudowany przez trzy zidentyfikowane neurony w każdym segmencie 11-15.

Ten protokół po raz pierwszy dostarcza przewodnik krok po kroku, aby wyizolować łańcuch zwojów (T4 do A6, Rysunek 1). Pokazujemy, jak przypiąć izolowany rdzeń nerwowy w jamie brzusznej i usunąć każdy ganglion. W tym izolowanym preparacie układu nerwowego neurony odpowiedzialne za ruch pływaka są gotowe do wykorzystania w eksperymentach elektrofizjologicznych i morfologicznych. Druga część tego protokołu przedstawia główne cechy wzorca motorycznego pływaka. Obejmuje to przewodnik krok po kroku, jak zewnątrzkomórkowo rejestrować aktywność neuronów ruchowych pływaka. Aksony neuronów ruchowych RS wystają przez przednią gałąź nerwu N1, podczas gdy aksony neuronów ruchowych PS wystają przez tylną gałąź tego samego nerwu (ryc. 1) 4. Dlatego ich aktywność może być rejestrowana z tych gałęzi za pomocą różnicowych elektrod pinowych.

Diagram struktury neuronalnej i ilustracja z etykietami do badania anatomii, z podkreśleniem gałęzi nerwowych.
Rycina 1: Izolowany układ nerwowy od zwoju piersiowego 4 (T4) do zwoju brzusznego 6 (A6) i jego schematyczny schemat. T4: zwój piersiowy 4; T5: zwój piersiowy 5; A1, A2 ... A6 zwój brzuszny 1, gang brzuszny 2 ... gang brzuszny 6; N1: nerw N1; N2: nerw N2; N3: nerw N3; PS: skok mocy; RS: skok powrotny. Skróty kierunkowe: A = przedni; P = tylny.

Ta procedura preparacji i zademonstrowana technika elektrofizjologiczna są wygodne dla studentów studiów licencjackich i mogą uzupełniać praktyczne kursy fizjologii. Izolowany łańcuch zwojów został wykorzystany w wielu eksperymentach do badania funkcji układu nerwowego, koordynacji lub modulacji mikroobwodów pływaka 6, a także neuronalnej kontroli zachowań adaptacyjnych w lokomocji 16, 17. System pływania raków zapewnia zatem ogromną ilość interesujących możliwości nauczania lub szkolenia, które rozpoczynają się od sekcji brzusznego rdzenia nerwowego raków i zewnątrzkomórkowego zapisu fikcyjnego wzorca motorycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura sekcji jest zgodna z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 22 września 2010 r. (2010/63/UE).

1. Przygotowanie

  1. Uzyskać rak, Pacifastacus leniusculus (Dana), obojga płci o wielkości ≥8 cm. Upewnij się, że zwierzęta są żywotne, a brzuch i kończyny brzuszne są nienaruszone.
  2. Zwróć uwagę, aby sprawdzić pancerz i upewnić się, że ten naskórek jest twardy i sztywny. Zwierzęta przed i po linieniu mają miękki pancerz i nie nadają się do eksperymentów, ponieważ podczas procesu linienia zmienia się wiele parametrów (np. spadek aktywności lokomotorycznej).
  3. Zbierz wszystkie narzędzia i materiały użyte podczas preparacji, przypinania i zdejmowania osłony rdzenia nerwowego pokazane na rysunku 2 i wymienione w dostarczonych suplementach.

Zestaw mikroskopu preparacyjnego z narzędziami chirurgicznymi do analizy próbek biologicznych; Zawiera źródło światła.
Rycina 2: Materiały i narzędzia używane do preparowania, przypinania i zdejmowania osłony rdzenia nerwowego.

(1) duże wiadro wypełnione lodem; (2) sól fizjologiczna z raków; (3) dozownik soli fizjologicznej; (4) mikroskop preparacyjny; (5) naczynie preparacyjne; (6) mocne nożyczki; (7) kleszcze (8) nożyczki sprężynowe; (9) szalka Petriego wyłożona przezroczystym sylgardem; (10) kołki mocujące; (11) źródło zimnej lampy.

2. Grube rozwarstwienie

  1. Znieczulenie zwierzęcia na lodzie przez 15 - 20 minut. Pierwszą część sekcji należy przeprowadzić na stole laboratoryjnym w pobliżu zlewu, ponieważ obejmuje ona etap wykrwawiania, a próbka musi być regularnie płukana solą fizjologiczną z raków podczas zabiegu.
  2. Trzymaj zwierzę brzuszną stroną do góry i użyj mocnych nożyczek, aby przeciąć oba pazury u podstawy w pobliżu klatki piersiowej (ryc. 3-1). Usuń lewy i prawy uropod (ryc. 3-2).
  3. Umieść zwierzę brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym wyłożonym czarnym sylgardem. Podnieś głowotułów, wkładając pod spód lód i przypnij brzuch do telsonu (ryc. 4A).
  4. Napełnij dozownik soli fizjologicznej ~60 ml schłodzonego soli rakowej. Przelej raki zimną solą fizjologiczną przez otwór pazura (ryc. 4B). Nadmiar soli fizjologicznej spłynie przez nacięcia u uropodów. Przykryj raki lodem podczas wykrwawiania
  5. Odetnij głowę zwierzęcia pojedynczym poprzecznym cięciem tuż za oczami zwierzęcia za pomocą silnych nożyczek (ryc. 5A). Usuń wszystkie nogi do chodzenia w pobliżu stawów podstawy, jak pokazano na rysunku 5B.
  6. Odizoluj brzuch z ostatnimi segmentami klatki piersiowej od reszty głowotułowia. Wykonaj pierwsze cięcie na poziomie drugich nóg do chodzenia (segment piersiowy 3), wkładając końcówkę nożyczek w otwór drugiej nogi do chodzenia i przecinając na przeciwną stronę. (Rysunek 6A-1).
  7. Przedłuż to pierwsze cięcie w obie strony przez głowotułów (ryc. 6A-2).
  8. Otwórz zwierzę, aby niektóre narządy wewnętrzne były widoczne. Popchnij wydatny gruczoł trawienny (ryc. 6B-3) do przedniej części próbki i użyj kleszczy, aby usunąć narządy rozrodcze z jamy brzusznej.
  9. Usuń przednią część głowotułowia (ryc. 6C). Użyj bocznych cięć, aby usunąć boczne części pancerza, które zakrywają skrzela, po obu stronach pozostałej klatki piersiowej (ryc. 6D-4). Usuń skrzela i spłucz próbkę zimną solą fizjologiczną.
  10. Kontynuować sekcję z przecięciem na całej długości płytki mostka, jak pokazano na rysunku 6E-5. Wykonaj to cięcie w maksymalnych pozycjach bocznych między pleuronem a pływakiem (Rysunek 6E czerwone oznaczenia). Kontynuuj po drugiej stronie z tym samym cięciem. Spłucz próbkę zimną solą fizjologiczną.
  11. Pozostałą sekcję przeprowadzić pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść odwłok raka brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym wyłożonym czarnym sylgardem i wypełnionym solą fizjologiczną z raków tak, aby przykrył próbkę.
    UWAGA: Poniższe kroki (2.12–4.8) zawierają instrukcje kierunkowe, które dotyczą praworęcznych eksperymentatorów. W kolejnych krokach (2.12-6.8) ważne jest, aby w regularnych odstępach czasu, co 20-30 minut, wymieniać sól fizjologiczną na raki zimną solą fizjologiczną, aby utrzymać zdrowy układ nerwowy.
  12. Przymocuj próbkę za pomocą szpilek do owadów z tyłu na telsonie i z przodu na resztkach pancerza. Umieść próbkę tak, aby telson był skierowany w lewo i był równoległy do krawędzi stołu.
  13. Użyj grubych kleszczy w lewej ręce, aby złapać otwór na nogę do chodzenia (Rysunek 7A) i otwórz próbkę (Rysunek 7B biała strzałka). Zidentyfikuj duże dwa pasma mięśni zginacza grzbietowego (ryc. 7B-1 i C-1) i przetnij ich brzuszną podstawę, jak pokazano na rycinie 7B.
  14. Zidentyfikuj tętnicę mostkową (ryc. 7C-2), która schodzi od grzbietowej (serce) do brzusznej, w 4. segmencie piersiowym. Tętnica ta leży tuż nad rdzeniem nerwowym (ryc. 7C-3), zanim wystaje pod rdzeń nerwowy, tworząc tętnicę brzuszną.
  15. Przeciąć tętnicę mostkową. Jak pokazano na rysunku 7C, najpierw podnieś tętnicę za pomocą jednego ostrza nożyczek i tnij tylko wtedy, gdy widoczny jest brzusznie zlokalizowany rdzeń nerwowy.
  16. Zamocuj mięśnie zginaczy grzbietowych z przodu (po prawej stronie). Należy to zrobić w maksymalnie rozciągniętej pozycji za pomocą szpilek, aby nie blokowały widzenia, a próbka pozostała rozciągnięta. Kiedy pasma mięśni grzbietowych są unieruchomione (ryc. 8-1), widoczne są pierwsze zwoje brzuszne, A1 i A2, z powiązanymi nerwami N1, N2 i N3 (ryc. 8).
  17. Użyj kleszczy w lewej ręce, aby chwycić próbkę za jeden otwór nóg do chodzenia. Podczas kolejnych etapów sekcji delikatnie pociągnij, aby próbka była otwarta.
  18. Przeciąć nerwy N3 w najbardziej oddalonym miejscu od rdzenia nerwowego. (Rysunek 8-3).
  19. Przetnij mięśnie zginaczy w pobliżu brzusznego apodemu, jak pokazano na rysunku 8-4. Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia nerwowego ani nerwów N2.
  20. Powtórz kroki 2.18 i 2.19 dla nerwów N3 i mięśni zginaczy pozostałych zwojów brzusznych od A2 do A5.
  21. W ostatnim zwoju brzusznym, A6, odetnij mięśnie zginaczy grzbietowych od brzusznego apodemu, a próbka powinna wyglądać tak, jak pokazano na rycinie 9.
  22. Przetnij płytkę mostka z tyłu nerwów A6 (ryc. 9-1) i zachowaj część brzuszną (ryc. 9-2). Odrzuć część grzbietową z mięśniami zginaczy (ryc. 9-3). Przymocuj płytkę mostka z przodu za pomocą szpilek przez otwory nóg chodzących i z tyłu do A6.

3. Dokładna sekcja

  1. Umieść próbkę pod mikroskopem z przednią częścią skierowaną na zewnątrz, a tylną częścią w kierunku krawędzi stołów.
  2. Użyj kleszczy, jak pokazano na rysunku 10A, aby usunąć najbardziej przednie części mostka głowotułowia.
    UWAGA: Zwoje piersiowe i związane z nimi nerwy są częściowo pokryte mięśniami nóg i mostkiem głowo-piersiowym. Mostek głowotułowia tworzy szkielet, który oddziela bocznie położone jamy nóg chodzących od siebie i od jamy przyśrodkowej, w której znajduje się brzuszny rdzeń nerwowy.
  3. Przeciąć mięśnie między pozostałymi strukturami egzoszkieletowymi, jak pokazano na rycinie 10B-1 i B2. Użyj kleszczy, aby chwycić i podnieść przedni koniec brzusznego rdzenia nerwowego (ryc. 10C).
    UWAGA: Rdzeń nerwowy zostanie uszkodzony w tym procesie, więc unikaj wielokrotnego podnoszenia rdzenia nerwowego.
  4. Przeciąć nerwy piersiowe bocznie, jednocześnie podnosząc rdzeń nerwowy (ryc. 10C-3). Utrzymuj te nerwy na odpowiedniej długości do przypięcia. Usuń ściśniętą część łańcucha zwojów, która została podniesiona kleszczami, odcinając całą tkankę przed T4 (ryc. 10C-4).
  5. Umieść próbkę przednią częścią po lewej stronie i skup się na A1. Przeciąć nerwy N1 i N2 z A1 na odpowiednią długość (maks. 1 cm), aby je przypiąć.
  6. Skoncentruj się na A2 i zidentyfikuj nerwy N1, N2 i N3 tego segmentu (ryc. 11). Nerwy N1 zwojów brzusznych A2-A5 znajdują się między dwoma fałdami kutykularnymi mostka w każdym segmencie (ryc. 11A-1) i są pokryte mięśniami. Wykonaj jedno cięcie wzdłuż tylnego zagięcia kutykularnego mostka. Zacznij od bocznej krawędzi brzucha i idź w kierunku linii środkowej, jak pokazano na rysunku 11A.
  7. Jeśli cel N1 jest nadal pokryty tkanką, jak pokazano na rysunku 11B (czerwona strzałka), przeciąć w poprzek pęczka mięśniowego, ale tym razem przed obiema fałdami kutykularnymi mostka i nerwu N1 (ryc. 11B-2).
  8. Przeciąć nerw N1 tak dystalnie, jak to możliwe (ryc. 11C-3). Nerw N1 jest w pełni widoczny, a gałąź przednia i tylna można zidentyfikować (ryc. 11C).
  9. Przejdź do nerwu przeciwległego N1 i najpierw przetnij mięśnie wzdłuż tylnego zagięcia kutykularnego mostka, zaczynając przyśrodkowo, w pobliżu zwoju (ryc. 11D). Jeśli nerw jest nadal pokryty tkanką, przeciąć w poprzek pęczka mięśniowego, ale tym razem przed obiema fałdami kutykularnymi mostka i nerwu N1, podobnie jak na rycinie 11B-2. Przeciąć nerw N1 tak dystalnie, jak to możliwe.
  10. Przytnij nerwy N2 tego ganglionu na odpowiednią długość (ok. 0,5 cm) do przypięcia.
  11. Powtórz kroki 3.7-3.11 dla nerwów A3-A5.
  12. Przetnij nerwy zwoju A6 tak dystalnie, jak to możliwe (ryc. 12A). Użyj kleszczy, aby chwycić wiele nerwów A6, aby podnieść ten ganglion i zacząć izolować łańcuch zwojów od płytki mostka.
  13. Podnosząc rdzeń nerwowy, pociągnij go delikatnie w kierunku przednim, jak pokazano na rysunku 12B (biała strzałka). Gdy poszczególne zwoje są podnoszone, usuń tętnicę brzuszną, która może być przyczepiona do brzusznej strony rdzenia nerwowego (ryc. 12C). Kontynuuj tę (delikatnie) sekwencję ciągnięcia-cięcia, aż rdzeń nerwowy zostanie całkowicie odizolowany.
  14. Przenieść izolowany łańcuch zwojów na szalkę Petriego wyłożoną przezroczystym sylgardem i wypełnioną solą fizjologiczną z raków (ryc. 12D).

4. Przypinanie pępowiny nerwowej do szalki Petriego

UWAGA: Użyj małych szpilek wyciętych z drutu ze stali nierdzewnej (zobacz dodatki), aby przypiąć sznur nerwowy. Dotykaj kleszczami tylko zakończenia nerwu i nie ściskaj łączników ani zwojów.

  1. Przypnij łańcuch zwojów w linii prostej, delikatnie rozciągając.
  2. Ułóż rdzeń nerwowy na szalce Petriego stroną grzbietową skierowaną do góry (ryc. 13, linia). Brzuszną stronę zwojów można rozpoznać po jej wypukłości; Strona grzbietowa jest płaska. Przypnij nerwy piersiowe po bokach. Kontynuuj z nerwami A6, rozciągając rdzeń nerwowy wzdłuż jego osi podłużnej.
  3. Wytnij nerwy A1 pod kątem 90° w stosunku do rdzenia nerwowego.
  4. Przejdź do punktu A2 i przymocuj nerwy N2 pod kątem 35–45° w stosunku do rdzenia nerwowego (ryc. 1A).
  5. Oddziel nerwy N1 w ich przedniej i tylnej gałęzi przed przypięciem, jak pokazano na rycinie 14. Użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby podnieść jedną parą kleszczy przednią, a drugą tylną gałąź nerwu N1. Uważaj, aby wybrać tylko najbardziej dystalne końce gałęzi nerwowych. Teraz ostrożnie je rozsuń.
  6. Przypnij przednią gałąź nerwu N1 pod kątem 90° w stosunku do rdzenia nerwowego (ryc. 1A). Przypnij tylną gałąź nerwu N1 między przednią gałęzią N1 a nerwem N2.
  7. Powtórz kroki 4.4–4.6 dla nerwów zwojów A3–A5. Podczas mocowania rdzenia nerwowego rozciągaj go zarówno w kierunku wzdłużnym, jak i poprzecznym.

5. Usuwanie zwojów nerwowych

  1. Umieść preparat w taki sposób, aby ręce eksperymentatora zawsze spoczywały na stabilnej płaszczyźnie, aby uniknąć drżenia. Aby usunąć pochwę, oświetl rdzeń nerwowy od dołu.
  2. Skoncentruj się na dowolnym zwoju brzusznym od A1 do A5. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby wykonać małe boczne nacięcie przez osłonkę zwoju, za ganglionem i między nerwami N2 i N3 (ryc. 15A czerwona strzałka).
  3. Podnieś osłonkę zwojową za pomocą bardzo cienkich kleszczy i przetnij poprzecznie w poprzek osłonki nad łącznikami, jak pokazano na rysunku 15A-1. Uważaj, aby nie ściskać ani nie przecinać pępowiny nerwowej nożyczkami.
  4. Nadal trzymając i podnosząc pochewkę ganglionu za pomocą kleszczy, kontynuuj przecinanie jej wzdłuż bocznych granic ganglionu (ryc. 15B-2 i -3). Zdejmij osłonę. Alternatywnie przypnij go do obu stron łączników w taki sposób, aby był zamocowany, ale rdzeń nerwowy nie był ściśnięty.
  5. Powtórz kroki 5.2-5.4 dla wszystkich zwojów brzusznych od A1 do A5.
  6. W podobny sposób należy usunąć zwoje piersiowe i zwój A6. Aby usunąć A6, zacznij od przodu zwoju i postępuj w kierunku tylnym. Przypnij osłonkę zwojową A6 do tylnego końca łańcucha zwojów.

6. Nagrania zewnątrzkomórkowe z neuronów ruchowych

  1. Zbierz wszystkie narzędzia i materiały używane do nagrań zewnątrzkomórkowych pokazane na rysunku 16B i wymienione w suplementach. Ponadview konfiguracji nagrywania pokazano na rysunku 16A. Uruchom wszystkie urządzenia elektroniczne używane w tym eksperymencie (Rysunek 16C), tak aby amplifiery mogły się rozgrzać przez co najmniej 30 minut przed nagrywaniem. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie do nagrywania.
  2. Umieść łańcuch zwojów na stole mikroskopu i oświetl od dołu. Włóż elektrodę rejestrującą do sylgardu w pobliżu nerwu docelowego, a elektrodę odniesienia w miejscu pobliższym, ale z boku zwojów nerwowych (ryc. 17A i B). Zegnij nerw docelowy wokół elektrody rejestrującej (rysunek 17C).
  3. Lekko rozciągnąć nerw, aby zapewnić kontakt między elektrodą a nerwem i przypiąć go z boku (rys.17D). Przymocuj elektrod do stołu mikroskopu za pomocą plasteliny, aby pozostały w żądanej pozycji.
  4. Użyj strzykawki wypełnionej wazeliną i igły o rozmiarze 20 (z zaokrągloną końcówką) (ryc. 17E-3), aby odizolować nerw docelowy od roztworu do kąpieli. Najpierw nałóż trochę wazeliny na sylgard wokół elektrody nagrywającej. Rezultatem jest warstwa wazeliny pokrywająca sylgard w pobliżu elektrody rejestrującej (Rysunek 17E-4). Uważaj, aby nie wklepywać bezpośrednio w nerw i unikać pęcherzyków powietrza w tej warstwie.
  5. Uszczelnić elektrodę rejestrującą wazeliną ze wszystkich stron aż do poziomu powierzchni soli fizjologicznej (rysunek 17F).
  6. Powtórz tę procedurę dla wszystkich nerwów docelowych, których aktywność powinna być monitorowana.
  7. Rozpocznij nagrywanie. Użyj trybu akwizycji ciągłej lub bez przerw i częstotliwości próbkowania 5 kHz. Ustaw wzmacniacz zewnątrzkomórkowy na następujące parametry; wzmocnienie do 1 000 (wzmacnia sygnał 1 000 razy, należy zadbać o uwzględnienie tego parametru wzmocnienia w ustawieniach oprogramowania akwizycyjnego) oraz zakres filtra pasmowoprzepustowego od 300 Hz (dolnoprzepustowy) do 2 000 Hz (górnoprzepustowy).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki jednoczesnym nagraniom zewnątrzkomórkowym z RS i PS, neurony ruchowe jednego zwoju, naprzemienna aktywność tych pul neuronów ruchowych, mogą być monitorowane (Rysunek 18), reprezentując fikcyjny wzorzec lokomocji.

Analiza impulsów neuronalnych, diagram z oznaczonymi sygnałami RS, PS; Konfiguracja eksperymentalna i przebiegi.
Rysunek 18:

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomia raków i ich zwojów brzusznych została opisana wcześniej 5, 18, 19, 20 i zaleca się zapoznanie się z nimi przed preparacją, aby uniknąć przecięcia ważnych nerwów.

Bardzo ważne jest, aby utrzymywać preparat w temperaturze poniżej 23 °C, aby zapobiec degradacji izolowanego rdzenia nerwowego. Można to łatwo osiągnąć, wymieniając roztwór do kąpieli co 20–30 minut zimną solą fizjologiczną z raków. W takich warunkach łańcuch zwojów może być używany do eksperymentów elektrofizjolog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Josowi Burgertowi za pomoc przy niektórych figurach. Jesteśmy wdzięczni Ingo Selbachowi (i grupie "Edelkrebsprojekt NRW") za jego wysiłki na rzecz zaopatrzenia laboratorium w zwierzęta doświadczalne. Dziękujemy Annie C. Schneider za korektę pierwszych wersji rękopisu. Badania te były wspierane przez grant Emmy Noether DFG SM 206/3-1 oraz grant na rozpoczęcie studiów Uniwersytetu w Kolonii dla kobiet.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-kanałowy wzmacniacz zewnątrzkomórkowy: MA 102 WzmacniaczElektroniklabor, Zoologie, Universitä t zu Kö ln, Niemcy
powietrznyTechnical Manufacturing Corporation
(TMC) jednostka AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		63-534
Axon Digidata 1440ADigitizerAxon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CADD1440A
duże wiadro 
Clampex & ClampfitpClamp 10, oprogramowanie do rejestracji i analizyMolecular Devices Design, Union City, CApClamps 10 Standardowe
źródło zimnej lampyz elastycznym światłowodem (wiązka światłowodowa) Mikroskopy Euromex holandia, Arnhem, BDLE.5211 & Komputer i monitor LE.5235
wyposażony w oprogramowanie rejestrujące
pojemnik i pipetę do odpadów płynnych 
sól fizjologiczna z raków zawiera (w mM): 5,4 KCl, 2,6 MgCl2, 13,5 CaCl2 i 195 NaCl, buforowane 10 mM zasadą Tris i 4,7 mM kwasem maleinowym; napowietrzane przez 3 godziny. Dostosować przy pH 7,4. 
dekstran, Texas Red (3000MW, utrwalany lizyną)barwnik fluorescencyjny, utrwalany lizynąLife Technologies GmbH, Darmstadt, NiemcyD3328
 (dł. x szer. x wys.) 15x7x5 cm; wyłożone czarnym silikonem
Kleszcze
mocowania klatki
(biologia, Dumont #5)Kleszcze: Biologia, końcówka 0,05 x 0,02 mm, długość 11cm, INOXFine Science Tools (FST), Niemcy11252-20
kleszcze (biologia, Dumont #55)Kleszcze: Biologia, końcówka 0,05 x 0,02 mm, długość 11cm, INOXFine Science Tools (FST), Niemcy11255-20
kleszczy (elektroniczne, Dumont #5)Kleszcze: standardowe, końcówka 0,1 x 0,06 mm, długość 11cm, INOXFine Science Tools (FST), Niemcy11251-20
wewnątrzkomórkowekapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna/wewnętrzna: 1mm/0,5mm), z filamentemSutter Instruments, Novato, CABF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoomMikroskop preparacyjny                                            Zoom 1x - 8xLeica, Niemcy10446298
lustro
plastelina
                                          Powiększenie 0,67x - 4,5xOlympus, Niemcy
szalka Petriego 94 x 16 mm; podszyte przezroczystym silikonemGreiner bio-one, Niemcy633180
nożyczki pierścienioweThoughCut, krawędź tnąca: ostra/, prosta: 13cmFine Science Tools (FST), Niemcy14054-13
nożyczki sprężynowe lub alternatywa: Nożyczki sprężynowe Vannaskrawędź tnąca: 8 mm, średnica końcówki: 0,2 mm, prosta: 10 cm lub krawędź tnąca 2,5 mm, średnica końcówki 0,075 mm, prosta: 8 cmFST), Niemcy15024-10 lub                  15000-08
student Vannas  nożyczki sprężynowe lub alternatywne:  Nożyczki sprężynowe Moriatnąca: 5mm, średnica końcówki: 0,35mm, prosta: 9cm lub krawędź tnąca: 5mm, średnica końcówki 0,1 mm, prosta: 8 cmFine Science Tools (FST), Niemcy91500-09 lub                    15396-00
sylgard184 Baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz; dla czarnego sylgardu dodaj węgiel aktywnyDow Corning, Midland, MI, USA
wypełniona wazeliną i wyposażona w igłę 20 gauche z zaokrągloną końcówką
stół, Naczynie rozwarstwiające do Faradaya stołowe mikroskopu do oświetlania preparatu od dołu Mikroskop preparacyjny Olympus SZ61  Narzędzia do nauki o naczyniu ( krawędź Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45(2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekcja rakaizolacja sznura nerwowegousuwanie os on zleglifikcyjny wzorzec ruchowyrejestracje wewn trzkom rkowecentralne generatory wzorc wbadania elektrofizjologicznezleg y brzuszne

Powiązane artykuły