Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52109

⸱

25 listopada 2014

 ,  , 
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

Streszczenie

Tutaj pokazujemy sekcję rdzenia nerwowego w jamie brzusznej raka. Preparat składa się z dwóch ostatnich zwojów piersiowych (T4, T5) oraz łańcucha zwojów brzusznych (A1 do A6). Ten łańcuch zwojów obejmuje część ośrodkowego układu nerwowego (OUN), która napędza skoordynowaną lokomocję pleopodów (swimmerets): układ swimmeret. Od ponad pięciu dekad wiadomo, że u raków każdy pływak jest napędzany przez swój własny, niezależny wzór generujący jądro, które generuje rytmiczną naprzemienną aktywność 1-3. Neurony ruchowe unerwiające muskulaturę każdego pływaka tworzą dwie anatomicznie i funkcjonalnie odrębne populacje 4. Jeden z nich jest odpowiedzialny za retrakcję (skok mocy, PS) pływaka. Drugi napędza protrakcję (ruch powrotny, RS) pływaka. Neurony ruchowe układu pływackiego są w stanie spontanicznie wytworzyć fikcyjny wzorzec motoryczny, który jest identyczny ze wzorcem zarejestrowanym in vivo1.

Celem tego raportu jest wprowadzenie interesującego i wygodnego systemu modelowego do badania sieci generujących rytm i koordynacji niezależnych mikroukładów dla praktycznych kursów laboratoryjnych dla studentów. Dostarczony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące preparacji rdzenia nerwowego jamy brzusznej raka, przypinania izolowanego łańcucha zwojów, usuwania zwojów i rejestrowania fikcyjnego wzorca motorycznego pływaka zewnątrzkomórkowo z izolowanego układu nerwowego.

Dodatkowo, możemy monitorować aktywność neuronów pływaków zarejestrowanych wewnątrzkomórkowo z dendrytów. Tutaj również opisujemy pokrótce te techniki i podajemy kilka przykładów. Ponadto morfologię neuronów pływaka można ocenić za pomocą różnych technik barwienia. Tutaj podajemy przykłady wewnątrzkomórkowych (za pomocą jonoforezy) neuronów wypełnionych barwnikiem i zasypek basenów neuronów ruchowych pływaka. W naszym laboratorium używamy tego preparatu do badania podstawowych funkcji fikcyjnej lokomocji, wpływu sensorycznego sprzężenia zwrotnego na aktywność OUN oraz koordynacji między mikroobwodami na poziomie komórkowym.

Wprowadzenie

Pleopody raka służą do kontroli postawy i poruszają się rytmicznie, gdy zwierzęta płyną do przodu, wentylują swoje nory lub gdy samice napowietrzają jaja 5, 6. Pleopody raka sygnałowego, Pacifastacus leniusculus, występują w parach od drugiego do piątego segmentu odwłosa, z jedną kończyną po każdej stronie odwłosa 7. Ośrodkowy układ nerwowy samodzielnie generuje rytmiczny wzorzec ruchowy, który napędza ruch pleopodów zarówno u całego zwierzęcia, jak i w preparacie izolowanego sznura nerwowego. W przypadku braku sprzężenia zwrotnego z receptorów lub sygnałów zstępujących, generowany rytmiczny wzorzec ruchowy nazywany jest lokomocją fikcyjną 1, 2. W systemie pleopodów wzorzec ruchowy ten nie różni się pod żadnym względem od aktywności pleopodów mierzonej u całego zwierzęcia.

Ruch każdej odnóży pływakowych (swimmerets) jest sterowany przez mikroobwód, który znajduje się w jednym odpowiadającym mu hemiganglionie i jest do niego ograniczony 1 - 3. W każdym mikroobwodzie znajduje się jądro generujące wzorzec, które składa się z pięciu zidentyfikowanych niekolczastych interneuronów. Można je funkcjonalnie scharakteryzować jako inhibitory fazy pchnięcia (Inhibitor of Power Stroke, IPS) lub inhibitory fazy powrotu (Inhibitor of Return Stroke, IRS) 8. Interneurony IPS i IRS nie są oscylatorami endogennymi; ich naprzemienna aktywność jest napędzana przez wzajemne hamowanie 9. Ponieważ interneurony te bezpośrednio hamują neurony ruchowe odnóży pływakowych, generowany jest naprzemienny ruch PS-RS 10. Lokomocja wymaga jednak nie tylko generowania aktywności, ale także koordynacji różnych niezależnych mikroobwodów. W systemie odnóży pływakowych taka koordynacja jest zapewniana przez koordynujący mikroobwód, który gwarantuje, że kończyny są aktywne w odpowiednich momentach. Mikroobwód ten tworzą trzy zidentyfikowane neurony w każdym segmencie 11-15.

Niniejszy protokół po raz pierwszy przedstawia szczegółowy przewodnik po sekcji w celu wyizolowania łańcucha zwojów (od T4 do A6, Rysunek 1). Pokazujemy, jak przytwierdzić wyizolowany brzuszny sznur nerwowy i usunąć osłonkę z każdego zwoju. W tak przygotowanym izolowanym układzie nerwowym neurony odpowiedzialne za ruchy pływaków są gotowe do wykorzystania w eksperymentach elektrofizjologicznych i morfologicznych. Druga część protokołu prezentuje główne cechy wzorca ruchowego pływaków. Obejmuje ona instrukcję krok po kroku dotyczącą pozakomórkowej rejestracji aktywności neuronów ruchowych pływaków. Aksony neuronów ruchowych RS przebiegają przez przednią gałąź nerwu N1, natomiast aksony neuronów ruchowych PS przebiegają przez tylną gałąź tego samego nerwu (Rysunek 1) 4. W związku z tym ich aktywność można rejestrować z tych gałęzi za pomocą różnicowych elektrod szpilkowych.

Schemat anatomiczny Hydra oraz zdjęcie przedstawiające czułki i rozmieszczenie nerwów do badań strukturalnych.
Rycina 1: Izolowany układ nerwowy od zwoju piersiowego 4 (T4) do zwoju brzusznego 6 (A6) oraz jego schematyczna ilustracja. T4: zwój piersiowy 4; T5: zwój piersiowy 5; A1, A2 … A6 zwój brzuszny 1, zwój brzuszny 2 … zwój brzuszny 6; N1: nerw N1; N2: nerw N2; N3: nerw N3; PS: ruch roboczy (power-stroke); RS: ruch powrotny (return-stroke). Skróty kierunków: A = przedni; P = tylny.

Przedstawiona procedura sekcji oraz technika elektrofizjologiczna są odpowiednie dla studentów studiów licencjackich i mogą stanowić uzupełnienie praktycznych kursów fizjologii. Izolowany łańcuch zwojów był wykorzystywany w wielu eksperymentach do badania funkcji układu nerwowego, koordynacji lub modulacji mikroobwodów płetw pływanych 6, a także neuronalnej kontroli adaptacyjnego zachowania podczas lokomocji 16, 17. System płetw pływanych raków zapewnia zatem ogromną liczbę interesujących możliwości dydaktycznych i szkoleniowych, które rozpoczynają się od sekcji brzusznego sznura nerwowego raka i pozakomórkowej rejestracji fikcyjnego wzorca ruchowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsza procedura sekcji jest zgodna z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 22nd września 2010 r. (2010/63/EU).

1. Przygotowanie

  1. Pozyskać raki, Pacifastacus leniusculus (Dana), obu płci o rozmiarze ≥8 cm. Upewnić się, że zwierzęta są żywotne, a odwłok i odnóża brzuszne są nieuszkodzone.
  2. Należy starannie sprawdzić pancerz, upewniając się, że kutykula jest twarda i sztywna. Zwierzęta w fazie przed- i popierścieniowaniu mają miękki pancerz i nie nadają się do eksperymentów, ponieważ podczas procesu linienia zmienia się wiele parametrów (np. spadek aktywności lokomocyjnej).
  3. Przygotować wszystkie narzędzia i materiały wykorzystywane podczas sekcji, przypinania i odsłaniania sznura nerwowego, przedstawione na Rysunku 2 oraz wymienione w dołączonych suplementach.

Układ mikroskopowy z narzędziami do mikrodysekcji; obejmuje stereomikroskop, skalpel i szalkę Petriego.
Rycina 2: Materiały i narzędzia używane do dysekcji, przypinania i usuwania osłon sznura nerwowego.

(1) duże wiadro wypełnione lodem; (2) sól fizjologiczna dla raków; (3) dozownik soli fizjologicznej; (4) mikroskop sekcyjny; (5) naczynie sekcyjne; (6) mocne nożyczki; (7) pęseta (8) nożyczki sprężynowe; (9) szalka Petri wyłożona przezroczystym Sylgardem; (10) szpilki mocujące; (11) zimne źródło światła.

2. Sekcja makroskopowa

  1. Zanurzyć zwierzę w lodzie na 15 - 20 min w celu znieczulenia. Pierwszą część sekcji przeprowadzić na blacie laboratoryjnym w pobliżu zlewu, ponieważ obejmuje ona etap eksanguinacji, a preparat musi być regularnie płukany solą fizjologiczną dla raków podczas procedury.
  2. Trzymając zwierzę stroną brzuszną do góry, za pomocą mocnych nożyczek odciąć obie szczypce u ich nasady w pobliżu klatki piersiowej (Rysunek 3-1). Usunąć lewy i prawy uropod (Rysunek 3-2).
  3. Umieścić zwierzę stroną brzuszną do góry w naczyniu sekcyjnym wyłożonym czarnym sylgardem. Unieść cefalotoraks, wsuwając pod niego lód, i przypiąć odwłok w miejscu telsonu (Rysunek 4A).
  4. Napełnić dozownik ok. 60 ml schłodzonej soli fizjologicznej dla raków. Przepłukać raka zimną solą fizjologiczną przez otwór po szczypcach (Rysunek 4B). Nadmiar soli fizjologicznej wypłynie przez nacięcia w uropodach. Podczas eksanguinacji przykryć raka lodem.
  5. Zdekapitować zwierzę jednym poprzecznym cięciem tuż za oczami, używając mocnych nożyczek (Rysunek 5A). Usunąć wszystkie odnóża kroczące w pobliżu stawów nasadowych, zgodnie z Rysunkiem 5B.
  6. Odizolować odwłok z ostatnimi segmentami torakalnymi od reszty cefalotoraksu. Wykonać pierwsze cięcie na poziomie drugiej pary odnóży kroczących (segment torakalny 3), wsuwając końcówkę nożyczek w otwór drugiej nogi kroczącej i tnąc aż do przeciwległej strony (Rysunek 6A-1).
  7. Przedłużyć to pierwsze cięcie na obie strony przez cefalotoraks (Rysunek 6A-2).
  8. Rozwarć zwierzę, aby odsłonić organy wewnętrzne. Przesunąć wyraźnie widoczną gruczoł trawienny (Rysunek 6B-3) do przedniej części preparatu i za pomocą pęsety usunąć organy rozrodcze z jamy brzusznej.
  9. Usunąć przednią część cefalotoraksu (Rysunek 6C). Wykonać cięcia boczne, aby usunąć boczne części karapaksy pokrywające skrzela po obu stronach pozostałego toraksu (Rysunek 6D-4). Usunąć skrzela i wypłukać preparat zimną solą fizjologiczną.
  10. Kontynuować sekcję, wykonując cięcie wzdłuż całej długości płytki sternalnej, jak wskazano na Rysunku 6E-5. Wykonać to cięcie w maksymalnych pozycjach bocznych między pleuronem a pleuropodami (Rysunek 6E, czerwone oznaczenia). Powtórzyć to samo cięcie po drugiej stronie. Wypłukać preparat zimną solą fizjologiczną.
  11. Pozostałą część sekcji przeprowadzić pod mikroskopem sekcyjnym. Umieścić odwłok raka stroną brzuszną do góry w naczyniu sekcyjnym wyłożonym czarnym sylgardem i wypełnionym solą fizjologiczną dla raków w ilości pokrywającej preparat.
    UWAGA: Następne kroki (2.12–4.8) zawierają instrukcje kierunkowe przeznaczone dla osób praworęcznych. W kolejnych krokach (2.12-6.8) ważne jest regularne wymienianie soli fizjologicznej dla raków co 20-30 min na zimną sól, aby utrzymać układ nerwowy w dobrym stanie.
  12. Utrzymać preparat za pomocą szpilek entomologicznych z tyłu przy telsonie i z przodu przy pozostałościach karapaksy. Umieścić preparat tak, aby telson był skierowany w lewo i znajdował się równolegle do krawędzi stołu.
  13. Używając grubej pęsety w lewej ręce, chwycić preparat przez otwór po nodze kroczącej (Rysunek 7A) i rozciągnąć go (Rysunek 7B, biała strzałka). Zidentyfikować dwie duże grzbietowe pasma mięśni zginaczy (Rysunek 7B-1 oraz C-1) i odciąć ich brzuszną podstawę, jak pokazano na Rysunku 7B.
  14. Zidentyfikować tętnicę sternalną (Rysunek 7C-2), która schodzi z części grzbietowej (serca) do brzusznej w 4tym segmencie torakalnym. Tętnica ta znajduje się bezpośrednio nad sznurem nerwowym (Rysunek 7C-3), zanim przejdzie pod niego, tworząc tętnicę brzuszną.
  15. Przeciąć tętnicę sternalną. Jak pokazano na Rysunku 7C, najpierw unieść tętnicę jednym ramieniem nożyczek i przeciąć ją dopiero wtedy, gdy widoczny będzie położony brzusznie sznur nerwowy.
  16. Utrzymać grzbietowe mięśnie zginacze z przodu (po prawej stronie). Należy to zrobić w maksymalnym rozciągnięciu za pomocą szpilek, aby nie zasłaniały widoczności, a preparat pozostał rozciągnięty. Po unieruchomieniu grzbietowych pasm mięśniowych (Rysunek 8-1) widoczne są pierwsze zwoje brzuszne A1 i A2 wraz z powiązanymi nerwami N1, N2 i N3 (Rysunek 8).
  17. Używając pęsety w lewej ręce, chwycić preparat w jednym z otworów po odnóżach kroczących. Podczas kolejnych kroków sekcji delikatnie ciągnąć, aby utrzymać preparat w rozwartej pozycji.
  18. Przeciąć nerwy N3 w miejscu najdalej oddalonym od sznura nerwowego (Rysunek 8-3).
  19. Odciąć mięśnie zginacze blisko apodemy brzusznej, jak pokazano na Rysunku 8-4. Należy uważać, aby nie uszkodzić sznura nerwowego ani nerwów N2.
  20. Powtórzyć kroki 2.18 i 2.19 dla nerwów N3 i mięśni zginaczy pozostałych zwojów brzusznych od A2 do A5.
  21. Przy ostatnim zwoju brzusznym A6 odciąć grzbietowe mięśnie zginacze od apodemy brzusznej; preparat powinien wyglądać tak, jak na Rysunku 9.
  22. Przeciąć płytkę sternalną za nerwami A6 (Rysunek 9-1) i zachować część brzuszną (Rysunek 9-2). Odrzucić część grzbietową z mięśniami zginaczami (Rysunek 9-3). Utrzymać płytkę sternalną z przodu szpilkami przez otwory po odnóżach kroczących oraz z tyłu przy A6.

3. Precyzyjna sekcja

  1. Umieść preparat pod mikroskopem tak, aby część przednia była skierowana w głąb, a część tylna w stronę krawędzi stołu.
  2. Użyj pincety, jak pokazano na Rysunku 10A, aby usunąć najbardziej przednie części sternów cefalotorakalnych.
    UWAGA: Zwoje piersiowe i powiązane z nimi nerwy są częściowo przykryte przez mięśnie nóg i sterny cefalotorakalne. Sterny cefalotorakalne tworzą szkielet, który oddziela od siebie bocznie położone jamy nóg chodnych oraz od jamy przyśrodkowej, w której znajduje się brzuszny sznur nerwowy.
  3. Przetnij mięśnie pomiędzy pozostałymi strukturami egzoszkieletu, zgodnie ze wskazówkami na Rysunku 10B-1 i B2. Użyj pincety, aby uchwycić i unieść przedni koniec brzusznego sznura nerwowego (Rysunek 10C).
    UWAGA: Sznur nerwowy zostanie uszkodzony w tym procesie, dlatego należy unikać wielokrotnego chwytania go pincetą.
  4. Przetnij bocznie nerwy piersiowe, jednocześnie unosząc sznur nerwowy (Rysunek 10C-3). Pozostaw te nerwy w odpowiedniej długości do przypięcia. Usuń ściśniętą część łańcucha zwojów, którą uchwycono pincetą, odcinając wszystkie tkanki przed T4 (Rysunek 10C-4).
  5. Umieść preparat częścią przednią po lewej stronie i ustaw ostrość na A1. Przetnij nerwy N1 i N2 segmentu A1 na odpowiednią długość (maks. 1 cm), aby umożliwić ich przypięcie.
  6. Ustaw ostrość na A2 i zidentyfikuj nerwy N1, N2 i N3 tego segmentu (Rysunek 11). Nerwy N1 zwojów brzusznych A2-A5 znajdują się pomiędzy dwiema kutykularnymi fałdami sternów w każdym segmencie (Rysunek 11A-1) i są przykryte mięśniami. Wykonaj jedno cięcie wzdłuż tylnej kutykularnej fałdy sternum. Rozpocznij od bocznej krawędzi odwłoka i kieruj się ku linii środkowej, jak pokazano na Rysunku 11A.
  7. Jeśli docelowy nerw N1 jest nadal przykryty tkanką, jak pokazano na Rysunku 11B (czerwona strzałka), przetnij wiązkę mięśniową, ale tym razem przed obiema kutykularnymi fałdami sternów i nerwem N1 (Rysunek 11B-2).
  8. Przetnij nerw N1 jak najdalej dystalnie (Rysunek 11C-3). Nerw N1 jest w pełni widoczny, a możliwe jest zidentyfikowanie gałęzi przedniej i tylnej (Rysunek 11C).
  9. Przejdź do przeciwległego nerwu N1 i najpierw przetnij mięśnie wzdłuż tylnej kutykularnej fałdy sternum, zaczynając od strony przyśrodkowej, w pobliżu zwoju (Rysunek 11D). Jeśli nerw jest nadal przykryty tkanką, przetnij wiązkę mięśniową, ale tym razem przed obiema kutykularnymi fałdami sternów i nerwem N1, analogicznie do Rysunku 11B-2. Przetnij nerw N1 jak najdalej dystalnie.
  10. Przetnij nerwy N2 tego zwoju na odpowiednią długość (ok. 0,5 cm) do przypięcia.
  11. Powtórz kroki 3.7-3.11 dla nerwów segmentów A3-A5.
  12. Przetnij nerwy zwoju A6 jak najdalej dystalnie (Rysunek 12A). Użyj pincety, aby uchwycić kilka nerwów A6, unieść ten zwój i rozpocząć izolowanie łańcucha zwojów od płyty sternalnej.
  13. Podnosząc sznur nerwowy, delikatnie pociągnij go w kierunku przednim, jak zademonstrowano na Rysunku 12B (biała strzałka). W miarę unoszenia poszczególnych zwojów usuwaj tętnicę brzuszną, która może być przytwierdzona do strony brzusznej sznura nerwowego (Rysunek 12C). Kontynuuj tę sekwencję (delikatnego) pociągania i cięcia, aż sznur nerwowy zostanie całkowicie odizolowany.
  14. Przenieś odizolowany łańcuch zwojów do szalki Petriego wyłożonej przezroczystym sylgardem i wypełnionej roztworem soli fizjologicznej dla raka (Rysunek 12D).

4. Przytwierdzanie sznura nerwowego do szalki Petriego

UWAGA: Do unieruchomienia sznura nerwowego należy użyć małych szpilek wyciętych z drutu ze stali nierdzewnej (patrz materiały uzupełniające). Pęsetą należy dotykać wyłącznie zakończenia nerwu, unikając uciskania konektywów lub zwojów.

  1. Przytwierdź łańcuch zwojów szpilkami w linii prostej, delikatnie go rozciągając.
  2. Ułóż sznur nerwowy w szalce Petriego stroną grzbietową do góry (Rysunek 13, czarna linia). Stronę brzuszną zwojów można rozpoznać po wypukłości; strona grzbietowa jest płaska. Przytwierdź nerwy piersiowe do boków szalki. Kontynuuj z nerwami A6, rozciągając sznur nerwowy wzdłuż jego osi podłużnej.
  3. Przytwierdź szpilkami nerwy A1 pod kątem 90° względem sznura nerwowego.
  4. Przejdź do A2 i przytwierdź nerwy N2 pod kątem 35–45° względem sznura nerwowego (Rysunek 1A).
  5. Rozdziel gałęzie przednia i tylna nerwów N1 przed ich przytwierdzeniem, zgodnie z instrukcją na Rysunku 14. Użyj dwóch par precyzyjnych pęset, aby jedną pęsetą chwycić gałąź przednią, a drugą gałąź tylną nerwu N1. Należy uważać, aby chwytać jedynie najbardziej dystalne końce gałęzi nerwowych. Następnie ostrożnie je rozciągnij.
  6. Przytwierdź gałąź przednią nerwu N1 pod kątem 90° względem sznura nerwowego (Rysunek 1A). Przytwierdź gałąź tylną nerwu N1 pomiędzy przednią gałęzią N1 a nerwem N2.
  7. Powtórz kroki 4.4–4.6 dla nerwów zwojów A3–A5. Podczas unieruchamiania sznura nerwowego rozciągaj go zarówno w kierunku podłużnym, jak i poprzecznym.

5. Usuwanie osłonek z zwojów

  1. Ustaw preparat w taki sposób, aby dłonie eksperymentatora zawsze spoczywały na stabilnej powierzchni, co zapobiegnie drżeniu. Aby odsłonić zwoje, oświetl sznur nerwowy od dołu.
  2. Skup się na dowolnym zwoju brzusznym od A1 do A5. Używając precyzyjnych nożyczek sprężynowych, wykonaj niewielkie cięcie boczne przez osłonkę zwoju, za zwojem i pomiędzy nerwami N2 a N3 (Rycina 15A czerwona strzałka).
  3. Chwyć osłonkę zwoju za pomocą bardzo precyzyjnej pęsety i przetnij ją poprzecznie nad koneksjami, jak pokazano na Rycynie 15A-1. Należy uważać, aby nie ścisnąć ani nie przeciąć sznura nerwowego nożyczkami.
  4. Nadal trzymając i unosząc osłonkę zwoju pęsetą, kontynuuj cięcie wzdłuż bocznych krawędzi zwoju (Rycina 15B-2 i -3). Usuń osłonkę. Alternatywnie przypnij ją po obu stronach koneksji w taki sposób, aby była unieruchomiona, ale sznur nerwowy nie był uciśnięty.
  5. Powtórz kroki 5.2-5.4 dla wszystkich zwojów brzusznych od A1 do A5.
  6. Odsłoń zwoje piersiowe oraz zwój A6 w podobny sposób. Aby odsłonić A6, zacznij przed zwojem i posuwaj się w kierunku tylnym. Przypnij osłonkę zwoju A6 do tylnego końca łańcucha zwojów.

6. Pozakomórkowe rejestracje z neuronów ruchowych

  1. Przygotować wszystkie narzędzia i materiały wykorzystywane do rejestracji zewnątrzkomórkowej przedstawione na Rysunku 16B i wymienione w suplementach. Przegląd układu rejestracyjnego pokazano na Rysunku 16A. Uruchomić całą aparaturę elektroniczną wykorzystywaną w tym eksperymencie (Rysunek 16C), aby wzmacniacze mogły się rozgrzać przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem pomiarów. Włączyć komputer i uruchomić oprogramowanie do rejestracji.
  2. Umieścić łańcuch zwojów na stole mikroskopowym i oświetlić od dołu. Wprowadzić elektrodę rejestrującą do sylgardu w pobliżu docelowego nerwu, a elektrodę referencyjną w pozycji bliskiej, ale bocznej względem zwojów (Rysunek 17A i B). Zagiąć docelowy nerw wokół elektrody rejestrującej (Rysunek 17C).
  3. Lekko naciągnąć nerw, aby zapewnić kontakt między elektrodą a nerwem, i przypiąć go do boku (Rysunek 17D). Przymocować kable elektrod do stołu mikroskopowego za pomocą plasteliny, aby pozostały w pożądanej pozycji.
  4. Użyć strzykawki wypełnionej wazeliną i igły o rozmiarze 20 G (z zaokrągloną końcówką) (Rysunek 17E-3), aby odizolować docelowy nerw od roztworu kąpielowego. Najpierw nanieść odrobinę wazeliny na sylgard wokół elektrody rejestrującej. Wynikiem jest warstwa wazeliny pokrywająca sylgard w sąsiedztwie elektrody rejestrującej (Rysunek 17E-4). Należy uważać, aby nie nanosić wazeliny bezpośrednio na nerw i unikać pęcherzyków powietrza w tej warstwie.
  5. Uszczelnić elektrodę rejestrującą wazeliną z każdej strony aż do poziomu powierzchni soli fizjologicznej (Rysunek 17F).
  6. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich docelowych nerwów, których aktywność ma być monitorowana.
  7. Rozpocząć rejestrację. Użyć trybu akwizycji ciągłej lub bezprzerwowej oraz częstotliwości próbkowania 5 kHz. Ustawić wzmacniacz zewnątrzkomórkowy zgodnie z następującymi parametrami: wzmocnienie 1 000 (wzmocnienie sygnału 1 000 razy; należy pamiętać o uwzględnieniu tego parametru wzmocnienia w ustawieniach oprogramowania do akwizycji) oraz zakres filtra pasmowo-przepustowego od 300 Hz (odcięcie dolne) do 2 000 Hz (odcięcie górne).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dzięki jednoczesnym rejestracjom zewnątrzkomórkowym z neuronów RS i PS, neuronów ruchowych jednego zwoju, można monitorować naprzemienną aktywność tych pul neuronów ruchowych (Rysunek 18), co reprezentuje wzorzec fikcyjnej lokomocji.

Analiza sygnału neuronu, schemat z przebiegiem sygnału, badanie elektrofizjologiczne, aktywność neuronalna.
Rycina 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Anatomia raków i ich zwojów brzusznych została opisana wcześniej 5, 18, 19, 20 i zaleca się zapoznanie się z nimi przed preparacją, aby uniknąć przecięcia ważnych nerwów.

Bardzo ważne jest, aby utrzymywać preparat w temperaturze poniżej 23 °C, aby zapobiec degradacji izolowanego rdzenia nerwowego. Można to łatwo osiągnąć, wymieniając roztwór do kąpieli co 20–30 minut zimną solą fizjologiczną z raków. W takich warunkach łańcuch zwojów może być używany do eksperymentów elektrofizjolog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Josowi Burgertowi za pomoc przy niektórych figurach. Jesteśmy wdzięczni Ingo Selbachowi (i grupie "Edelkrebsprojekt NRW") za jego wysiłki na rzecz zaopatrzenia laboratorium w zwierzęta doświadczalne. Dziękujemy Annie C. Schneider za korektę pierwszych wersji rękopisu. Badania te były wspierane przez grant Emmy Noether DFG SM 206/3-1 oraz grant na rozpoczęcie studiów Uniwersytetu w Kolonii dla kobiet.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-kanałowy wzmacniacz zewnątrzkomórkowy: MA 102 WzmacniaczElektroniklabor, Zoologie, Universitä t zu Kö ln, Niemcy
powietrznyTechnical Manufacturing Corporation
(TMC) jednostka AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		63-534
Axon Digidata 1440ADigitizerAxon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CADD1440A
duże wiadro 
Clampex & ClampfitpClamp 10, oprogramowanie do rejestracji i analizyMolecular Devices Design, Union City, CApClamps 10 Standardowe
źródło zimnej lampyz elastycznym światłowodem (wiązka światłowodowa) Mikroskopy Euromex holandia, Arnhem, BDLE.5211 & Komputer i monitor LE.5235
wyposażony w oprogramowanie rejestrujące
pojemnik i pipetę do odpadów płynnych 
sól fizjologiczna z raków zawiera (w mM): 5,4 KCl, 2,6 MgCl2, 13,5 CaCl2 i 195 NaCl, buforowane 10 mM zasadą Tris i 4,7 mM kwasem maleinowym; napowietrzane przez 3 godziny. Dostosować przy pH 7,4. 
dekstran, Texas Red (3000MW, utrwalany lizyną)barwnik fluorescencyjny, utrwalany lizynąLife Technologies GmbH, Darmstadt, NiemcyD3328
 (dł. x szer. x wys.) 15x7x5 cm; wyłożone czarnym silikonem
Kleszcze
mocowania klatki
(biologia, Dumont #5)Kleszcze: Biologia, końcówka 0,05 x 0,02 mm, długość 11cm, INOXFine Science Tools (FST), Niemcy11252-20
kleszcze (biologia, Dumont #55)Kleszcze: Biologia, końcówka 0,05 x 0,02 mm, długość 11cm, INOXFine Science Tools (FST), Niemcy11255-20
kleszczy (elektroniczne, Dumont #5)Kleszcze: standardowe, końcówka 0,1 x 0,06 mm, długość 11cm, INOXFine Science Tools (FST), Niemcy11251-20
wewnątrzkomórkowekapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna/wewnętrzna: 1mm/0,5mm), z filamentemSutter Instruments, Novato, CABF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoomMikroskop preparacyjny                                            Zoom 1x - 8xLeica, Niemcy10446298
lustro
plastelina
                                          Powiększenie 0,67x - 4,5xOlympus, Niemcy
szalka Petriego 94 x 16 mm; podszyte przezroczystym silikonemGreiner bio-one, Niemcy633180
nożyczki pierścienioweThoughCut, krawędź tnąca: ostra/, prosta: 13cmFine Science Tools (FST), Niemcy14054-13
nożyczki sprężynowe lub alternatywa: Nożyczki sprężynowe Vannaskrawędź tnąca: 8 mm, średnica końcówki: 0,2 mm, prosta: 10 cm lub krawędź tnąca 2,5 mm, średnica końcówki 0,075 mm, prosta: 8 cmFST), Niemcy15024-10 lub                  15000-08
student Vannas  nożyczki sprężynowe lub alternatywne:  Nożyczki sprężynowe Moriatnąca: 5mm, średnica końcówki: 0,35mm, prosta: 9cm lub krawędź tnąca: 5mm, średnica końcówki 0,1 mm, prosta: 8 cmFine Science Tools (FST), Niemcy91500-09 lub                    15396-00
sylgard184 Baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz; dla czarnego sylgardu dodaj węgiel aktywnyDow Corning, Midland, MI, USA
wypełniona wazeliną i wyposażona w igłę 20 gauche z zaokrągloną końcówką
stół, Naczynie rozwarstwiające do Faradaya stołowe mikroskopu do oświetlania preparatu od dołu Mikroskop preparacyjny Olympus SZ61  Narzędzia do nauki o naczyniu ( krawędź Strzykawka

Bibliografia

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45(2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekcja rakaizolacja sznura nerwowegousuwanie osłon zleglifikcyjny wzorzec ruchowyrejestracje wewnątrzkomórkowecentralne generatory wzorcówbadania elektrofizjologicznezległy brzuszne
System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.