Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Podsumowanie

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Streszczenie

Większości znanych chorób towarzyszą zaburzenia układu sercowo-naczyniowego. Badania nad złożonością wzajemnie oddziałujących szlaków aktywowanych podczas patologii sercowo-naczyniowych są jednak ograniczone ze względu na brak solidnych i fizjologicznie istotnych metod. W celu modelowania patologicznych zdarzeń naczyniowych opracowaliśmy test in vitro do badania interakcji między śródbłonkiem a krwią pełną. Test składa się z pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka, które mają kontakt z ludzką krwią pełną. Metoda wykorzystuje natywną krew bez antykoagulantu lub z bardzo małą jego ilością, umożliwiając badanie delikatnych interakcji między składnikami molekularnymi i komórkowymi obecnymi w naczyniu krwionośnym.

Zbadaliśmy funkcjonalność testu, porównując aktywację krzepnięcia przez różne objętości krwi inkubowane z ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej lub bez nich (HUVEC). Podczas gdy większa objętość krwi przyczyniała się do zwiększenia tworzenia kompleksów trombinowo-antytrombinowych (TAT), obecność HUVEC powodowała zmniejszoną aktywację krzepnięcia. Ponadto zastosowaliśmy analizę obrazu przyłączania leukocytów do HUVEC stymulowanego czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα) i stwierdziliśmy, że obecność komórek CD16 ⁺ jest znacznie wyższa na komórkach stymulowanych TNFα w porównaniu z komórkami niestymulowanymi po kontakcie z krwią. Podsumowując, test może być stosowany do badania patologii naczyniowych, w których interakcje między śródbłonkiem a przedziałem krwi są zaburzone.

Wprowadzenie

Metody analizy oddziaływań naczyniowo-krwawych w chorobach układu sercowo-naczyniowego zazwyczaj opierają się na eksperymentalnych badaniach na zwierzętach. Wyniki uzyskane w badawczych modelach zwierzęcych mogą jednak mieć niewielkie znaczenie lub nie mieć go wcale w odniesieniu do chorób ludzi.^1,2 W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na dobre i niezawodne modele in vitro do badania oddziaływań komórkowych pomiędzy komponentem krwi a komórkami śródbłonka naczyniowego w systemie przypominającym ludzki. Opracowaliśmy zatem model komory z komórkami śródbłonka krwi. Opiera się on na wcześniej opisanym modelu stosowanym do badania oddziaływań między biomateriałami a pełną krwią ludzką.³ W przeciwieństwie do innych układów in vitro, w których zazwyczaj dostępna jest ograniczona liczba oczyszczonych komponentów, t.j. trombocytów, leukocytów lub komórek śródbłonka, niniejszy model obejmuje wszystkie komponenty występujące w naczyniu krwionośnym.

Konstrukcja modelu komory z komórkami śródbłonka naczyniowego została zaprojektowana w taki sposób, aby umożliwić wykorzystanie świeżo pobranej krwi ludzkiej z niewielką ilością dodanego przeciwkrzepliwego leku lub całkowicie bez niego. Krew przechowywana przez dłuższy czas ulega tzw. uszkodzeniom magazynowym, w których rozpad erytrocytów może zakłócać subtelne interakcje między krwią a komórkami śródbłonka.⁴

Aby uniknąć powstawania skrzepów podczas manipulacji pełną krwią ex vivo, wymagane są albo wysokie dawki przeciwzakrzepowych, albo zastosowanie materiałów nieaktywujących w całym obszarze kontaktu z krwią. Ponieważ powierzchnie nieaktywujące są rzadko spotykane w środowisku laboratoryjnym, materiały można alternatywnie wyposażyć w ochronną warstwę unieruchomionej heparyny. Ochronna warstwa unieruchomionej heparyny (dalej określana jako powierzchnia heparynowa Corline (CHS)) może być naniesiona na większość materiałów, tworząc powierzchnię, na której kontakt z krwią nie powoduje aktywacji kaskady krzepnięcia.⁵ Dzięki wyposażeniu komór w CHS, model komory komórek śródbłonka naczyniowego umożliwia stosowanie bardzo niskich stężeń przeciwzakrzepowych w krwi. Uniknięcie dodawania wysokich stężeń przeciwzakrzepowych w modelu komory śródbłonka naczyniowego pozwala na badanie subtelnych interakcji wewnątrz naczynia krwionośnego, które w przeciwnym razie mogłyby zostać zamaskowane.⁶

Model komory z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych składa się z dwóch komór utworzonych przez przymocowanie plastikowych cylindrów (wysokość: 8 mm; promień: 9 mm) do plastikowego szkiełka mikroskopowego. Górne krawędzie cylindrów są wyposażone w rowki, w których znajdują się gumowe pierścienie O-ring służące do uszczelnienia komór przy szkiełku do hodowli komórkowej. Komory są wypełnione krwią tylko częściowo, ponieważ powietrze pozostawione wewnątrz utrzymuje krew w ruchu podczas późniejszej rotacji komór w pozycji pionowej (Rysunek 1).

Aby ocenić funkcjonalność modelu, przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem komory całkowicie pokrytej CHS lub ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC). Przebadano dwie oddzielne objętości krwi i zmierzono tworzenie kompleksów trombiny z antytrombiną (TAT), będących pośrednim markerem krzepnięcia, za pomocą testu ELISA. Następnie, poprzez analizę obrazu, oceniono wpływ objętości krwi oraz stymulowanych czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα) komórek śródbłonka na rekrutację leukocytów.

Rycina 1. Konfiguracja modelu komory komórek śródbłonka naczyniowego. (A) Schematyczny rysunek komory krwi wykonanej z PMMA widziany z góry. (B) Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka są hodowane na szkiełkach z komorą jednodobową. Świeża ludzka krew pełna jest dodawana do dwóch komór na szkiełku mikroskopowym. Komory oraz wszystkie materiały używane do manipulacji krwią są pokryte ochronną powłoką HS. Po usunięciu ścianek szkiełka do hodowli komórkowej, komórki są ustawiane przylegać do krwi, a system zostaje zamknięty za pomocą zacisków. (C) Komory komórek śródbłonka są następnie inkubowane w rotacji w temperaturze 37 °C. Następnie reakcje w przedziale krwi można analizować metodą ELISA, a komórki śródbłonka analizować za pomocą mikroskopii.

Protokół

UWAGA: Krew została pobrana od zdrowych osób za pomocą otwartego systemu nakłucia żyły za zgodą Komisji Etycznej w Uppsali (Zezwolenie nr 2008/264).

1. Komórki rozsiewające

1. Hodowla pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w kolbach T75 pokrytych 1% żelatyną o pH PBS 7,4.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby T75 zawierającej HUVEC (lub inny rodzaj pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka) i przemyć komórki 2,1 mM EDTA w PBS pH 7,4. Odłączyć komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując przez 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C.
3. Zebrać komórki, przepłukując kolbę 9 ml 10% FBS w PBS o pH 7,4 i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki w temperaturze 735 x g przez 5 minut.
4. Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce mikronaczyniowej do wzrostu komórek śródbłonka (EC GMMV) i policzyć komórki w komorze Bürkera. Wysiewać 21 000 komórek/^cm2 w 1-dołkowych szkiełkach hodowlanych i inkubować w temperaturze 37 °C. HUVEC będzie zlewać się po 1-2 dniach hodowli. Codziennie monitoruj morfologię i konfluencję komórek pod mikroskopem świetlnym.

2. Przygotowanie krwi pełnej

1. Wszystkie sztuczne powierzchnie, które będą miały kontakt z krwią, należy przygotować podwójną warstwę unieruchomionej heparyny (CHS) zgodnie z zaleceniami producenta. Materiały powlekane CHS chronione przed kurzem mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy bez utraty funkcji.
2. Użyj nakłucia żyły w systemie otwartym, aby pobrać krew od zdrowego dawcy na krótko (<30 min) przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze śródbłonka krwi. Połączyć igłę podskórną (18 G x 50 mm) z silikonową rurką pokrytą CHS (średnica wewnętrzna: 2 mm) przed ostrożnym pobraniem krwi do probówki o pojemności 50 ml z powłoką CHS. Uzupełnij krew heparyną niefrakcjonowaną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,75 j.m./ml. Delikatnie wymieszaj krew, odwracając probówkę 2-3 razy.

3. Model komory śródbłonka krwi

1. Wykonać komory krwionośne (Rysunek 1A; widok z góry) z akrylowego polimetakrylanu metylu (PMMA) składające się z dwóch cylindrów (wysokość 8 mm i promień 9 mm), które są przyklejone do szkiełka PMMA (25 x 75 mm). Dopasuj krawędzie cylindrów skierowane do góry za pomocą gumowych pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym, aby uszczelnić komorę krwi względem szkiełek ze szklanymi szkiełkami z hodowanymi komórkami śródbłonka (rysunek 1B). Następnie obrócić komory krwi połączone ze szkiełkiem hodowlanym z komórkami śródbłonka w pozycji pionowej (ryc. 1C).
2. Za pomocą końcówki pipety z powłoką CHS przenieś 1,5 ml krwi do każdej komory pokrytej CHS, uważając, aby nie aktywować krwi.
3. Przenieść 1 ml krwi do probówek mikrowirówkowych zawierających 30 μl 0,34 M_{K 3}EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mM_{K 3}EDTA w celu oznaczenia początkowych stężeń białek osocza przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA). Ostrożnie wymieszaj krew i trzymaj probówki na lodzie.
4. Usuń plastikowe ścianki szkiełek do hodowli komórkowych zgodnie z instrukcjami producenta i ostrożnie umyj komórki w PBS o pH 7,4. Upewnij się, że następnie usunąłeś jak najwięcej płynu ze szkiełek. Nie pozwól, aby komórki wyschły.
5. Umieść szkiełko na komorach krwi, tak aby komórki były skierowane w stronę krwi. Zabezpiecz szkiełko, umieszczając zacisk wokół komory komórek śródbłonka krwi. Użyj plastikowego szkiełka dla dodatkowego wsparcia, aby uniknąć pęknięcia szkiełka do hodowli komórkowych podczas umieszczania zacisku.
6. Zamocować komorę komórek śródbłonka krwi na obracającym się kole (o średnicy 40 cm) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Obracaj każdą komorę na kole z prędkością 0,5 x g przez 30 minut.
7. Po inkubacji zdemontuj komorę komórek śródbłonka krwi. Umyj szkiełka hodowlane w PBS pH 7,4 i utrwal komórki w lodowatym 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut. Przenieść 1 ml krwi z każdej komory do probówek mikrowirówkowych zawierających 30 μl 0,34 M_{K 3}EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mM_{K 3}EDTA i delikatnie wymieszać probówki. Trzymaj probówki na lodzie.
8. Odwirować probówki o stężeniu 4,560 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść osocze krwi do nowych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej analizy.

4. Analiza interakcji śródbłonka krwi

1. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne za pomocą mysiego anty-ludzkiego CD16, a następnie wtórnego kozła anty-mysiego Alexa 488 i falloidyny-TexasRed. Wykonuj każdy etap barwienia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i myj szkiełka w PBS pH 7,4 między każdym etapem. Przeciwbarwić jądra DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Analizuj składniki krwi związane z komórkami śródbłonka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak CellProfiler.
2. Określić ilościowo reakcje w komorze krwi za pomocą testu ELISA trombina-antytrombina (TAT) zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi próbek osocza.
3. Użyj odpowiednich narzędzi statystycznych, np. niesparowanego testu t, aby przeanalizować dane.

Wyniki

Konieczność powlekania CHS

Aby zmierzyć reakcje w krwi pełnej specyficzne dla tych wywoływanych przez komórki śródbłonka, wszystkie materiały użyte do komory z komórkami śródbłonka krwi muszą zostać pokryte warstwą CHS przed użyciem. Rycina 2A (po lewej) przedstawia niepokrywaną komorę po 30 min kontaktu z krwią, w której widoczny jest wyraźny skrzep. Z kolei opracowanie komory za pomocą CHS (Rycina 2A, po prawej) chroni krew przed niekontrolowaną aktywacją, zapewniając, że wyniki wynikają z oddziaływań między komórkami śródbłonka a krwią.

Wpływ objętości krwi w komorze

Aktywacja krzepnięcia jest bardziej prawdopodobna w krwi stojącej, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo oddziaływania między aktywowanymi czynnikami krzepnięcia. W modelu komory z komórkami śródbłonka naczyniowego krew pozostaje w ruchu dzięki cyrkulacji pęcherzyka powietrza wewnątrz komory. Aby określić wpływ zmian objętości krwi, a tym samym wielkości pęcherzyka powietrza, komorę powleczoną CHS połączono ze szkiełkiem przedmiotowym powleczonym CHS, które testowano z 1,5 ml lub 1,75 ml krwi pełnej przez 30 min. Objętość krwi bez ruchu wywołanego przez pęcherzyk powietrza jest 2,5 raza większa, gdy do komory dodano 1,75 ml krwi, w porównaniu do sytuacji, gdy użyto 1,5 ml krwi (Rysunek 2B). Zmierzone wartości TAT sugerowały zwiększone tworzenie TAT przy zwiększonej objętości krwi (Rysunek 2D). Gdy HUVEC (Rysunek 2C) inkubowano z 1,5 lub 1,75 ml krwi pełnej, nie odnotowano różnicy między obiema grupami, co sugeruje, że komórki śródbłonka mogą modulować aktywację krzepnięcia (Rysunek 2D).

Wpływ TNFα na rekrutację komórek krwi i aktywację krzepnięcia

Aby zbadać wpływ TNFα na rekrutację leukocytów, komórki HUVEC poddano działaniu 20 ng/ml TNFα na 4 h przed kontaktem z krwią. Kontakt z krwią – w ilości 1,5 ml lub 1,75 ml – kontynuowano przez 30 min, po czym szkiełka z hodowlą barwiono pod kątem obecności CD16 (Rycyna 2F), wykonano obrazowanie i ilościowo określono liczbę komórek CD16⁺. Rekrutacja komórek CD16⁺ wzrosła znacząco po traktowaniu TNFα (Rycyna 2E) z 100 do 256 komórek CD16⁺/mm² (p < 0,0001) przy użyciu 1,5 ml krwi oraz ze 172 do 378 (P < 0,0001) przy użyciu 1,75 ml krwi. Tworzenie kompleksów TAT zmierzono w odpowiadających im próbkach osocza krwi inkubowanej z komórkami traktowanymi TNFα lub nietraktowanymi (Rycyna 2G). Komórki stymulowane TNFα wywołały około dwukrotny wzrost liczby kompleksów TAT w porównaniu z komórkami nietraktowanymi.

Rysunek 2: Funkcjonalność modelu komory komórek śródbłonka naczyniowego. (A) Komory z CHS lub bez CHS inkubowano z pełną krwią. Bez CHS po 30 min utworzył się skrzep. Pomiar kompleksów trombiny-antytrombiny (TAT), pośredniego markera krzepnięcia, w krwi inkubowanej bez CHS wyniósł > 6 000 μg/ml. (B) Objętość krwi, która nie jest wprawiana w ruch przez rotującą pęcherzykową warstwę powietrza, zmienia się w zależności od objętości dodanej krwi. Przy dodaniu 1,5 ml krwi objętość ta wynosi 0,3 ml, natomiast przy dodaniu 1,75 ml wzrasta do 0,74 ml. (C) Obrazy HUVEC wykonane za pomocą mikroskopii kontrastowej wykazują typową morfologię komórek śródbłonka w formie konfluencyjnej monowarstwy przed kontaktem z krwią. (D) Wartości TAT dla komór całkowicie pokrytych CHS wykazują niewielką różnicę przy dodaniu różnych objętości krwi. Dodanie 1,5 ml krwi skutkowało poziomem 35 ± 11 μg/ml (n = 7) w porównaniu do 1,75 ml, co skutkowało poziomem 85 ± 70 μg/ml TAT (n = 8). Różnica ta znika, gdy HUVEC są inkubowane z tymi samymi objętościami krwi: 66 ± 55 μg/ml dla 1,5 ml (n = 5) i 66 ± 29 μg/ml dla 1,75 ml (n = 7). (E) Ilościowe oznaczenie liczby komórek CD16⁺ obecnych na nieustymulowanych lub stymulowanych TNFα HUVEC po kontakcie z krwią. Liczba komórek CD16⁺ jest znacząco zwiększona w komórkach stymulowanych TNFα inkubowanych z 1,5 ml (bazalnie: 100 ± 40 komórek/mm; TNFα: 256 ± 121 komórek/mm) lub 1,75 ml (bazalnie: 172 ± 67 komórek/mm; TNFα: 378 ± 185 komórek/mm) pełnej krwi. (F) Reprezentatywne obrazy nieustymulowanych i stymulowanych TNFα HUVEC barwionych falloidyną (czerwony), CD16 (zielony) i DAPI (niebieski). Pasek skali = 250 μm. (G) Tworzenie kompleksów TAT jest w przybliżeniu dwukrotnie większe w komórkach stymulowanych TNFα w porównaniu do komórek nieleczonych inkubowanych z krwią (1,5 ml: 2,1 ± 0,1 razy więcej TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 razy więcej TAT, n = 4). Wszystkie wartości przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; wartości p obliczono za pomocą nieparzystych testów t. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wielokrotne interakcje między krwią a ścianą naczynia są zwykle utrzymywane w stanie spoczynku ze względu na nieadhezyjny i przeciwzakrzepowy charakter śródbłonka. ⁷ Podczas stanów patologicznych obejmujących stan zapalny śródbłonek jest aktywowany, co skutkuje wzrostem ekspresji receptora adhezyjnego⁸ i zmniejszoną zdolnością do hamowania hemostazy. ⁹ Aktywacja systemów kaskadowych we krwi z kolei wzmacnia trombogenność śródbłonka, powodując dalszą zakrzepicę i rekrutację leukocytów. ¹⁰ Aby lepiej zrozumieć te delikatne interakcje między komórkami śródbłonka a krwią pełną, opracowaliśmy nowatorską metodę in vitro , w której hodowane komórki śródbłonka są umieszczane w kontakcie z krwią pełną. Według naszej wiedzy, nasza konfiguracja jest pierwszą, która pokazuje komórki śródbłonka inkubowane z pełną ludzką krwią bez lub z bardzo małą ilością antykoagulantu przez dłuższy czas.

Czułość tego systemu jest możliwa dzięki nakłuciu dożylnemu w systemie otwartym w połączeniu z ochronną warstwą unieruchomionej heparyny na wszystkich powierzchniach mających kontakt z krwią. Zastosowanie systemu otwartego podczas pobierania krwi zmniejsza aktywację systemów kaskadowych podczas nakłucia żyły, umożliwiając jednocześnie zastosowanie samodzielnie określonej ilości antykoagulantu. Dostępne na rynku probówki z ewakuowaną krwią mogą być jednak używane w zależności od zamierzonych punktów końcowych badania. Końcowe stężenie antykoagulantu dodawanego do większości dostępnych na rynku probówek z systemem zamkniętym może hamować wrażliwe i w inny sposób trudne do zbadania interakcje w konfiguracji. ⁶ Ochronna powierzchnia heparyny dodatkowo eliminuje aktywację krwi poprzez kontakt powierzchniowy z jakimikolwiek powierzchniami innymi niż komórki śródbłonka. ⁵ Rzeczywiście, inkubacja krwi pełnej uzupełnionej niewielką ilością niefrakcjonowanej heparyny w komorze bez ochrony CHS powodowała tworzenie się skrzepów.

Pęcherzyk powietrza wewnątrz komory umożliwia mieszanie krwi podczas inkubacji z komórkami śródbłonka. Aby ocenić wpływ wielkości pęcherzyków powietrza, użyliśmy dwóch różnych objętości krwi. W tym modelu zmierzyliśmy podobne poziomy TAT niezależnie od wielkości pęcherzyków powietrza w komorach inkubowanych z HUVEC. TAT został jednak zwiększony dzięki mniejszemu rozmiarowi pęcherzyków powietrza w komorach w pełni poddanych działaniu CHS. To, zgodnie z wcześniej opisanymi właściwościami komórek śródbłonka¹¹, wskazuje na wpływ regulacyjny na zwiększoną aktywację krzepnięcia dostarczanej przez komórki śródbłonka, której brakuje w obojętnej komorze CHS. Pęcherzyk powietrza w systemie wytwarza przepływ po obróceniu komory. Rozmiar pęcherzyka będzie miał wpływ na siły w tym systemie obrotowym. Pokazują to nasze wyniki na rysunku 2D , gdzie mniejszy pęcherzyk tworzy wyższe wartości TAT, co oznacza zmniejszoną siłę działającą na krew, tj. ruch krwi w komorze jest mniejszy, a tym samym aktywacja systemu kaskadowego następuje w większym stopniu. Należy wspomnieć, że w tym systemie tworzymy przepływ wirujący, który będzie miał różną prędkość w poprzek komory, przy czym największa prędkość będzie przebiegać wzdłuż ścianek, a najmniejsza w środku. Nie jest to oczywiście optymalne środowisko pod względem naprężeń przepływowych i ścinających dla komórek śródbłonka, ale nadal mamy system dający stabilne i powtarzalne wyniki. Bardziej optymalne warunki obejmowałyby krążący przepływ laminarny przy braku turbulencji. Nie jest to jednak możliwe w przedstawionym tu modelu i według naszej wiedzy taki system nie jest obecnie dostępny. Chociaż na rynku dostępnych jest kilka układów mikroprzepływowych, które nie są możliwe do połączenia z pełną krwią bez dodatku antykoagulantu lub z niskim poziomem dodanego do systemu, co nie umożliwia właściwej czułej oceny interakcji między wszystkimi składnikami obecnymi we krwi i komórkach śródbłonka.

Ponadto zaobserwowano 2-krotny wzrost rekrutacji komórek krwi w kierunku HUVEC aktywowanego TNFα w połączeniu z podwojonym tworzeniem TAT niezależnie od objętości krwi. Weryfikuje to stabilność systemu modelowego, a także pokazuje możliwość zastosowania aktywowanego śródbłonka w połączeniu z krwią pełną. W przyszłości komora komórek śródbłonka krwi może być wykorzystywana do badania rekrutacji komórek krwi w kierunku aktywowanych komórek śródbłonka za pomocą różnych markerów ulegających ekspresji na komórkach w różnych warunkach i na różnych etapach aktywacji. Ponadto model może być stosowany w połączeniu ze środkami farmakologicznymi w celu oceny wpływu na stany zapalne.

Podsumowując, pokazujemy ogromne korzyści płynące z połączenia modelu komorowego z ludzką krwią i komórkami naczyniowymi w celu stworzenia kompletnego systemu in vitro dla człowieka do wykonywania odpowiednich badań chorób naczyniowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Można użyć dowolnego innego rodzaju pierwotnej ludzkiej komórki śródbłonka.
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV (ECGM MV)PromoCell		C-22120
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G-2500	Przygotuj 1% żelatyny w PBS, inkubuj 5 ml w T75 przez 15 minut i usuń przed hodowlą komórek.
Laboratorium Badań Enzymatycznych	TAT ELISA	TAT-EIA-C
Mysz anty-ludzka CD16	DAKO	F7011	Rozcieńczenie 1:100
Kozioł anty-mysz Alexa 488	Sondy molekularne	A11001	Rozcieńczenie 1:500
sondy molekularne	falloidyny-Texas	A22287	Rozcieńczenie 1:200
Sondy molekularne	DAPI	D1306	Rozcieńczenie 10 μ g / ml
EDTA		Sigma E-6758
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1-dołkowe szkiełka do hodowli komórkowych	BD Falcon	354101
Komory krwionośne	NA		NA Komora krwi może być wykonana z PMMA lub innego tworzywa sztucznego, które jest w stanie bind CHS
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparyna Powierzchnia (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Igła podskórna	Terumo	NN-1850R	Rozmiar: 18 G x 5 mm
Heparyna niefrakcjonowana (UFH)	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar 1709958		Przygotuj roztwór podstawowy 0,34 M w milliQ H2O
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon	80i
Mikroskop świetlny	Nikon	TS100
Oprogramowanie do analizy obrazu	Broad Institute	CellProfiler	Dostępne za darmo pod adresem www.cellprofiler.org

.Czerwone