Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Podsumowanie

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Streszczenie

Większości znanych chorób towarzyszą zaburzenia układu sercowo-naczyniowego. Badania nad złożonością wzajemnie oddziałujących szlaków aktywowanych podczas patologii sercowo-naczyniowych są jednak ograniczone ze względu na brak solidnych i fizjologicznie istotnych metod. W celu modelowania patologicznych zdarzeń naczyniowych opracowaliśmy test in vitro do badania interakcji między śródbłonkiem a krwią pełną. Test składa się z pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka, które mają kontakt z ludzką krwią pełną. Metoda wykorzystuje natywną krew bez antykoagulantu lub z bardzo małą jego ilością, umożliwiając badanie delikatnych interakcji między składnikami molekularnymi i komórkowymi obecnymi w naczyniu krwionośnym.

Zbadaliśmy funkcjonalność testu, porównując aktywację krzepnięcia przez różne objętości krwi inkubowane z ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej lub bez nich (HUVEC). Podczas gdy większa objętość krwi przyczyniała się do zwiększenia tworzenia kompleksów trombinowo-antytrombinowych (TAT), obecność HUVEC powodowała zmniejszoną aktywację krzepnięcia. Ponadto zastosowaliśmy analizę obrazu przyłączania leukocytów do HUVEC stymulowanego czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα) i stwierdziliśmy, że obecność komórek CD16 ⁺ jest znacznie wyższa na komórkach stymulowanych TNFα w porównaniu z komórkami niestymulowanymi po kontakcie z krwią. Podsumowując, test może być stosowany do badania patologii naczyniowych, w których interakcje między śródbłonkiem a przedziałem krwi są zaburzone.

Wprowadzenie

Metody analizy interakcji krwio-naczyniowych w chorobach sercowo-naczyniowych zazwyczaj obejmują eksperymenty badawcze na zwierzętach. Wyniki uzyskane w eksperymentalnych modelach zwierzęcych mogą mieć niewielki lub żaden wpływ na choroby u ludzi. ^1,2 W związku z tym potrzebne są dobre i wiarygodne modele in vitro do badania interakcji komórkowych między przedziałem krwi a komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych w systemie podobnym do ludzkiego. W związku z tym ustaliliśmy model komory komórkowej śródbłonka krwi. Opiera się to na wcześniej opisanym modelu używanym do badania interakcji między biomateriałami a ludzką krwią pełną.³ W przeciwieństwie do innych konfiguracji in vitro, w których zwykle dostępna jest ograniczona liczba oczyszczonych składników, tj. trombocytów, leukocytów lub komórek śródbłonka, obecny model obejmuje wszystkie składniki obecne w naczyniu krwionośnym.

Konfiguracja modelu komory komórek śródbłonka krwi jest zaprojektowana tak, aby umożliwić użycie świeżo pobranej ludzkiej krwi z niewielkim lub żadnym dodatkiem antykoagulantu. Krew przechowywana przez dłuższy czas nabiera tzw. zmian spichrzeniowych, w których rozpad erytrocytów może zakłócać delikatne interakcje między krwią a komórkami śródbłonka. ⁴

Aby uniknąć tworzenia się skrzepów podczas obchodzenia się z pełną krwią ex vivo, wymagane są albo wysokie dawki antykoagulantu, albo że cały materiał mający kontakt z krwią musi być nieaktywowany. Ponieważ powierzchnie nieaktywujące są rzadkością w środowisku laboratoryjnym, materiały mogą być alternatywnie wyposażone w warstwę ochronną z unieruchomionej heparyny. Ochronna warstwa unieruchomionej heparyny (zwanej dalej powierzchnią heparyny korlinowej (CHS)), która może być nakładana na większość materiałów, tworząc powierzchnię, na której może dojść do kontaktu z krwią bez powodowania aktywacji kaskady krzepnięcia. ⁵ Tak więc, dzięki wyposażeniu komór w CHS, model komory komórek śródbłonka krwi umożliwia stosowanie bardzo niskich stężeń antykoagulantu we krwi. Unikanie dodawania wysokich stężeń antykoagulantu do modelu komory śródbłonka krwi umożliwia badanie wrażliwych interakcji w obrębie naczynia krwionośnego, które w przeciwnym razie mogłyby być zamaskowane. ⁶

Model komory komórek śródbłonka krwi składa się z dwóch komór utworzonych przez przymocowanie plastikowych cylindrów (wysokość: 8 mm; promień: 9 mm) do plastikowego szkiełka mikroskopowego. Krawędzie cylindrów skierowane do góry są wyposażone w rowki, które są wyposażone w gumowe pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym służące do uszczelniania komór względem szkiełka hodowli komórkowej. Komory są tylko częściowo wypełnione krwią, ponieważ powietrze pozostawione w komorze utrzymuje krew w ruchu, gdy komory są następnie obracane w pozycji pionowej (ryc. 1).

Aby ocenić funkcjonalność modelu, przeprowadziliśmy eksperymenty z komorą pokrytą całkowicie CHS lub komórkami śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Oznaczono dwie oddzielne objętości krwi, a tworzenie kompleksów trombiny antytrombinowej (TAT) (pośredniego markera krzepnięcia) mierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Następnie oceniliśmy wpływ objętości krwi i komórek śródbłonka stymulowanych czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα) na rekrutację leukocytów za pomocą analizy obrazu.

Rysunek 1. Ustawienie modelu komory komórkowej śródbłonka krwi. (A) Widok z góry: schematyczny rysunek komory krwi, wykonany z PMMA. (B) Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka są hodowane na szkiełkach w komorze 1-dołkowej. Świeżą ludzką krew pełną dodaje się do dwóch komór na szkiełku mikroskopowym. Komory i cały materiał używany do obchodzenia się z krwią są pokryte ochronną powłoką HS. Po usunięciu ścianek szkiełka do hodowli komórkowej, komórki są umieszczane przodem do krwi, a system jest zamykany. (C) Komory komórek śródbłonka krwi są następnie inkubowane rotacyjnie w temperaturze 37 °C. Następnie reakcje w przedziale krwi mogą być analizowane za pomocą testu ELISA, a komórki śródbłonka mogą być analizowane za pomocą mikroskopii.

Protokół

UWAGA: Krew została pobrana od zdrowych osób za pomocą otwartego systemu nakłucia żyły za zgodą Komisji Etycznej w Uppsali (Zezwolenie nr 2008/264).

1. Komórki rozsiewające

1. Hodowla pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w kolbach T75 pokrytych 1% żelatyną o pH PBS 7,4.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby T75 zawierającej HUVEC (lub inny rodzaj pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka) i przemyć komórki 2,1 mM EDTA w PBS pH 7,4. Odłączyć komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując przez 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C.
3. Zebrać komórki, przepłukując kolbę 9 ml 10% FBS w PBS o pH 7,4 i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki w temperaturze 735 x g przez 5 minut.
4. Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce mikronaczyniowej do wzrostu komórek śródbłonka (EC GMMV) i policzyć komórki w komorze Bürkera. Wysiewać 21 000 komórek/^cm2 w 1-dołkowych szkiełkach hodowlanych i inkubować w temperaturze 37 °C. HUVEC będzie zlewać się po 1-2 dniach hodowli. Codziennie monitoruj morfologię i konfluencję komórek pod mikroskopem świetlnym.

2. Przygotowanie krwi pełnej

1. Wszystkie sztuczne powierzchnie, które będą miały kontakt z krwią, należy przygotować podwójną warstwę unieruchomionej heparyny (CHS) zgodnie z zaleceniami producenta. Materiały powlekane CHS chronione przed kurzem mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy bez utraty funkcji.
2. Użyj nakłucia żyły w systemie otwartym, aby pobrać krew od zdrowego dawcy na krótko (<30 min) przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze śródbłonka krwi. Połączyć igłę podskórną (18 G x 50 mm) z silikonową rurką pokrytą CHS (średnica wewnętrzna: 2 mm) przed ostrożnym pobraniem krwi do probówki o pojemności 50 ml z powłoką CHS. Uzupełnij krew heparyną niefrakcjonowaną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,75 j.m./ml. Delikatnie wymieszaj krew, odwracając probówkę 2-3 razy.

3. Model komory śródbłonka krwi

1. Wykonać komory krwionośne (Rysunek 1A; widok z góry) z akrylowego polimetakrylanu metylu (PMMA) składające się z dwóch cylindrów (wysokość 8 mm i promień 9 mm), które są przyklejone do szkiełka PMMA (25 x 75 mm). Dopasuj krawędzie cylindrów skierowane do góry za pomocą gumowych pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym, aby uszczelnić komorę krwi względem szkiełek ze szklanymi szkiełkami z hodowanymi komórkami śródbłonka (rysunek 1B). Następnie obrócić komory krwi połączone ze szkiełkiem hodowlanym z komórkami śródbłonka w pozycji pionowej (ryc. 1C).
2. Za pomocą końcówki pipety z powłoką CHS przenieś 1,5 ml krwi do każdej komory pokrytej CHS, uważając, aby nie aktywować krwi.
3. Przenieść 1 ml krwi do probówek mikrowirówkowych zawierających 30 μl 0,34 M_{K 3}EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mM_{K 3}EDTA w celu oznaczenia początkowych stężeń białek osocza przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA). Ostrożnie wymieszaj krew i trzymaj probówki na lodzie.
4. Usuń plastikowe ścianki szkiełek do hodowli komórkowych zgodnie z instrukcjami producenta i ostrożnie umyj komórki w PBS o pH 7,4. Upewnij się, że następnie usunąłeś jak najwięcej płynu ze szkiełek. Nie pozwól, aby komórki wyschły.
5. Umieść szkiełko na komorach krwi, tak aby komórki były skierowane w stronę krwi. Zabezpiecz szkiełko, umieszczając zacisk wokół komory komórek śródbłonka krwi. Użyj plastikowego szkiełka dla dodatkowego wsparcia, aby uniknąć pęknięcia szkiełka do hodowli komórkowych podczas umieszczania zacisku.
6. Zamocować komorę komórek śródbłonka krwi na obracającym się kole (o średnicy 40 cm) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Obracaj każdą komorę na kole z prędkością 0,5 x g przez 30 minut.
7. Po inkubacji zdemontuj komorę komórek śródbłonka krwi. Umyj szkiełka hodowlane w PBS pH 7,4 i utrwal komórki w lodowatym 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut. Przenieść 1 ml krwi z każdej komory do probówek mikrowirówkowych zawierających 30 μl 0,34 M_{K 3}EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mM_{K 3}EDTA i delikatnie wymieszać probówki. Trzymaj probówki na lodzie.
8. Odwirować probówki o stężeniu 4,560 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść osocze krwi do nowych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej analizy.

4. Analiza interakcji śródbłonka krwi

1. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne za pomocą mysiego anty-ludzkiego CD16, a następnie wtórnego kozła anty-mysiego Alexa 488 i falloidyny-TexasRed. Wykonuj każdy etap barwienia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i myj szkiełka w PBS pH 7,4 między każdym etapem. Przeciwbarwić jądra DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Analizuj składniki krwi związane z komórkami śródbłonka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak CellProfiler.
2. Określić ilościowo reakcje w komorze krwi za pomocą testu ELISA trombina-antytrombina (TAT) zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi próbek osocza.
3. Użyj odpowiednich narzędzi statystycznych, np. niesparowanego testu t, aby przeanalizować dane.

Wyniki

Konieczność powłoki CHS

Aby zmierzyć reakcje w pełnej krwi specyficzne dla tych wywołanych przez komórki śródbłonka, wszystkie materiały użyte do komory komórek śródbłonka krwi muszą być przed użyciem pokryte powłoką CHS. Rycina 2A (po lewej) przedstawia niepokrytą komorę po 30 minutach kontaktu z krwią z wyraźnie widocznym skrzepem. Z drugiej strony traktowanie komory CHS (ryc. 2A, po prawej) chroni krew przed niekontrolowaną aktywacją, zapewniając, że wyniki są spowodowane interakcjami komórka śródbłonka - krew.

Wpływ objętości krwi w komorze

Aktywacja krzepnięcia jest bardziej prawdopodobna w przypadku zastoju krwi, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo interakcji między aktywowanymi czynnikami krzepnięcia. W modelu komory komórek śródbłonka krwi krew jest utrzymywana w ruchu dzięki cyrkulacji pęcherzyka powietrza wewnątrz komory. W celu określenia wpływu zmian w objętości krwi, a co za tym idzie również w wielkości pęcherzyków powietrza, komorę pokrytą CHS połączono ze szkiełkiem podstawowym pokrytym CHS, które badano z 1,5 ml lub 1,75 ml krwi pełnej przez 30 minut. Objętość krwi bez ruchu pęcherzyka powietrza jest 2,5 razy większa, gdy do komory dodaje się 1,75 ml krwi w porównaniu do gdy używa się 1,5 ml krwi (ryc. 2B). Zmierzone wartości TAT sugerowały zwiększone tworzenie TAT wraz ze zwiększoną objętością krwi (ryc. 2D). Gdy HUVEC (Figura 2C) inkubowano z 1,5 lub 1,75 ml krwi pełnej, nie zauważono różnicy między obiema grupami, co sugeruje, że komórki śródbłonka mogą modulować aktywację krzepnięcia (Figura 2D).

Wpływ TNFα na rekrutację komórek krwi i aktywację krzepnięcia

W celu zbadania wpływu TNFα na rekrutację leukocytów, HUVEC potraktowano 20 ng/ml TNFα na 4 godziny przed kontaktem z krwią. Kontakt z krwią - z 1,5 ml lub 1,75 ml krwi - kontynuowano przez 30 minut, po czym szkiełka hodowlane wybarwiono pod kątem CD16 (ryc. 2F), zobrazowano i określono ilościowo liczbę komórek CD16 ⁺. Rekrutacja komórek CD16 ⁺ znacznie wzrosła po leczeniu TNFα (Figura 2E) ze 100 do 256 komórek CD16 ⁺ /^mm2 (p < 0,0001) z 1,5 ml krwi i ze 172 do 378 (P < 0,0001) z 1,75 ml krwi. Tworzenie kompleksów TAT mierzono w odpowiednich próbkach osocza krwi inkubowanej z komórkami traktowanymi TNFα lub nieleczonymi (Figura 2G). Komórki stymulowane TNFα indukowały przybliżone podwojenie kompleksów TAT w porównaniu z komórkami nieleczonymi.

Rycina 2: Funkcjonalność modelu komory komórkowej śródbłonka krwi. (A) Komory z CHS lub bez CHS inkubowano z pełną krwią. Bez CHS skrzep tworzył się po 30 minutach. Pomiar kompleksów trombina-antytrombina (TAT), pośredniego markera krzepnięcia, we krwi inkubowanej bez CHS wynosił > 6 000 μg/ml. (B) Objętość krwi, która nie jest poruszana przez obracający się pęcherzyk powietrza, będzie się różnić w zależności od objętości krwi. Po dodaniu 1,5 ml krwi objętość ta wyniesie 0,3 ml, natomiast wzrośnie do 0,74 ml po dodaniu 1,75 ml. (C) HUVEC zobrazowany za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym wykazuje typową morfologię komórek śródbłonka zlewającej się monowarstwy przed kontaktem z krwią. (D) Wartości TAT dla komór całkowicie pokrytych CHS wykazują niewielką różnicę, gdy dodaje się różne objętości krwi. Dodanie 1,5 ml krwi dało 35 ± 11 μg/ml (n = 7) w porównaniu do 1,75 ml, co dało 85 ± 70 μg/ml TAT (n = 8). Różnica ta nie jest już obecna, gdy HUVEC są inkubowane z tymi samymi objętościami krwi; 66 ± 55 μg/ml dla 1,5 ml (n = 5) i 66 ± 29 μg/ml dla 1,75 ml (n = 7). (E) Kwantyfikacja liczby komórek CD16 ⁺ obecnych na niestymulowanych lub stymulowanych TNFα HUVEC po kontakcie z krwią. Liczba komórek CD16 ⁺ jest znacznie zwiększona w przypadku komórek stymulowanych TNFα inkubowanych z 1,5 ml (podstawowe: 100 ± 40 komórek/mm; TNFα: 256 ± 121 komórek/mm) lub 1,75 ml (podstawowe: 172 ± 67 komórek/mm; TNFα: 378 ± 185 komórek/mm) krwi pełnej. (F) Reprezentatywne obrazy niestymulowanego i stymulowanego TNFα HUVEC wybarwionego na obecność falloidyny (czerwony), CD16 (zielony) i DAPI (niebieski). Pasek skali = 250 μm. (G) Tworzenie kompleksów TAT jest w przybliżeniu podwajane przez komórki stymulowane TNFα w porównaniu z nieleczonymi komórkami inkubowanymi z krwią (1,5 ml: 2,1 ± 0,1 razy więcej TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 razy więcej TAT, n = 4). Wszystkie wartości są przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe; Wartości p obliczono za pomocą niesparowanych testów T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wielokrotne interakcje między krwią a ścianą naczynia są zwykle utrzymywane w stanie spoczynku ze względu na nieadhezyjny i przeciwzakrzepowy charakter śródbłonka. ⁷ Podczas stanów patologicznych obejmujących stan zapalny śródbłonek jest aktywowany, co skutkuje wzrostem ekspresji receptora adhezyjnego⁸ i zmniejszoną zdolnością do hamowania hemostazy. ⁹ Aktywacja systemów kaskadowych we krwi z kolei wzmacnia trombogenność śródbłonka, powodując dalszą zakrzepicę i rekrutację leukocytów. ¹⁰ Aby lepiej zrozumieć te delikatne interakcje między komórkami śródbłonka a krwią pełną, opracowaliśmy nowatorską metodę in vitro , w której hodowane komórki śródbłonka są umieszczane w kontakcie z krwią pełną. Według naszej wiedzy, nasza konfiguracja jest pierwszą, która pokazuje komórki śródbłonka inkubowane z pełną ludzką krwią bez lub z bardzo małą ilością antykoagulantu przez dłuższy czas.

Czułość tego systemu jest możliwa dzięki nakłuciu dożylnemu w systemie otwartym w połączeniu z ochronną warstwą unieruchomionej heparyny na wszystkich powierzchniach mających kontakt z krwią. Zastosowanie systemu otwartego podczas pobierania krwi zmniejsza aktywację systemów kaskadowych podczas nakłucia żyły, umożliwiając jednocześnie zastosowanie samodzielnie określonej ilości antykoagulantu. Dostępne na rynku probówki z ewakuowaną krwią mogą być jednak używane w zależności od zamierzonych punktów końcowych badania. Końcowe stężenie antykoagulantu dodawanego do większości dostępnych na rynku probówek z systemem zamkniętym może hamować wrażliwe i w inny sposób trudne do zbadania interakcje w konfiguracji. ⁶ Ochronna powierzchnia heparyny dodatkowo eliminuje aktywację krwi poprzez kontakt powierzchniowy z jakimikolwiek powierzchniami innymi niż komórki śródbłonka. ⁵ Rzeczywiście, inkubacja krwi pełnej uzupełnionej niewielką ilością niefrakcjonowanej heparyny w komorze bez ochrony CHS powodowała tworzenie się skrzepów.

Pęcherzyk powietrza wewnątrz komory umożliwia mieszanie krwi podczas inkubacji z komórkami śródbłonka. Aby ocenić wpływ wielkości pęcherzyków powietrza, użyliśmy dwóch różnych objętości krwi. W tym modelu zmierzyliśmy podobne poziomy TAT niezależnie od wielkości pęcherzyków powietrza w komorach inkubowanych z HUVEC. TAT został jednak zwiększony dzięki mniejszemu rozmiarowi pęcherzyków powietrza w komorach w pełni poddanych działaniu CHS. To, zgodnie z wcześniej opisanymi właściwościami komórek śródbłonka¹¹, wskazuje na wpływ regulacyjny na zwiększoną aktywację krzepnięcia dostarczanej przez komórki śródbłonka, której brakuje w obojętnej komorze CHS. Pęcherzyk powietrza w systemie wytwarza przepływ po obróceniu komory. Rozmiar pęcherzyka będzie miał wpływ na siły w tym systemie obrotowym. Pokazują to nasze wyniki na rysunku 2D , gdzie mniejszy pęcherzyk tworzy wyższe wartości TAT, co oznacza zmniejszoną siłę działającą na krew, tj. ruch krwi w komorze jest mniejszy, a tym samym aktywacja systemu kaskadowego następuje w większym stopniu. Należy wspomnieć, że w tym systemie tworzymy przepływ wirujący, który będzie miał różną prędkość w poprzek komory, przy czym największa prędkość będzie przebiegać wzdłuż ścianek, a najmniejsza w środku. Nie jest to oczywiście optymalne środowisko pod względem naprężeń przepływowych i ścinających dla komórek śródbłonka, ale nadal mamy system dający stabilne i powtarzalne wyniki. Bardziej optymalne warunki obejmowałyby krążący przepływ laminarny przy braku turbulencji. Nie jest to jednak możliwe w przedstawionym tu modelu i według naszej wiedzy taki system nie jest obecnie dostępny. Chociaż na rynku dostępnych jest kilka układów mikroprzepływowych, które nie są możliwe do połączenia z pełną krwią bez dodatku antykoagulantu lub z niskim poziomem dodanego do systemu, co nie umożliwia właściwej czułej oceny interakcji między wszystkimi składnikami obecnymi we krwi i komórkach śródbłonka.

Ponadto zaobserwowano 2-krotny wzrost rekrutacji komórek krwi w kierunku HUVEC aktywowanego TNFα w połączeniu z podwojonym tworzeniem TAT niezależnie od objętości krwi. Weryfikuje to stabilność systemu modelowego, a także pokazuje możliwość zastosowania aktywowanego śródbłonka w połączeniu z krwią pełną. W przyszłości komora komórek śródbłonka krwi może być wykorzystywana do badania rekrutacji komórek krwi w kierunku aktywowanych komórek śródbłonka za pomocą różnych markerów ulegających ekspresji na komórkach w różnych warunkach i na różnych etapach aktywacji. Ponadto model może być stosowany w połączeniu ze środkami farmakologicznymi w celu oceny wpływu na stany zapalne.

Podsumowując, pokazujemy ogromne korzyści płynące z połączenia modelu komorowego z ludzką krwią i komórkami naczyniowymi w celu stworzenia kompletnego systemu in vitro dla człowieka do wykonywania odpowiednich badań chorób naczyniowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Można użyć dowolnego innego rodzaju pierwotnej ludzkiej komórki śródbłonka.
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV (ECGM MV)PromoCell		C-22120
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G-2500	Przygotuj 1% żelatyny w PBS, inkubuj 5 ml w T75 przez 15 minut i usuń przed hodowlą komórek.
Laboratorium Badań Enzymatycznych	TAT ELISA	TAT-EIA-C
Mysz anty-ludzka CD16	DAKO	F7011	Rozcieńczenie 1:100
Kozioł anty-mysz Alexa 488	Sondy molekularne	A11001	Rozcieńczenie 1:500
sondy molekularne	falloidyny-Texas	A22287	Rozcieńczenie 1:200
Sondy molekularne	DAPI	D1306	Rozcieńczenie 10 μ g / ml
EDTA		Sigma E-6758
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1-dołkowe szkiełka do hodowli komórkowych	BD Falcon	354101
Komory krwionośne	NA		NA Komora krwi może być wykonana z PMMA lub innego tworzywa sztucznego, które jest w stanie bind CHS
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparyna Powierzchnia (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Igła podskórna	Terumo	NN-1850R	Rozmiar: 18 G x 5 mm
Heparyna niefrakcjonowana (UFH)	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar 1709958		Przygotuj roztwór podstawowy 0,34 M w milliQ H2O
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon	80i
Mikroskop świetlny	Nikon	TS100
Oprogramowanie do analizy obrazu	Broad Institute	CellProfiler	Dostępne za darmo pod adresem www.cellprofiler.org