Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną ekstrakcję płynu do mycia apoplast z liści roślin, używając francuskiej fasoli (Phaseolus vulgaris) jako przykładu modelu.

Streszczenie

Apoplast to odrębny zewnątrzkomórkowy przedział w tkankach roślinnych, który znajduje się poza błoną plazmatyczną i obejmuje ścianę komórkową. Komora apoplastyczna liści roślin jest miejscem kilku ważnych procesów biologicznych, w tym tworzenia ścian komórkowych, pobierania i eksportu składników odżywczych i wody przez komórki, interakcji między roślinami a endofitami oraz odpowiedzi obronnych na patogeny. Metoda infiltracji-odwirowania jest dobrze znana jako solidna technika analizy rozpuszczalnego składu apoplastów różnych gatunków roślin. Płyn otrzymywany tą metodą jest potocznie znany jako płyn do płukania apoplastów (AWF). Poniższy protokół opisuje zoptymalizowaną metodę infiltracji próżniowej i odwirowania do ekstrakcji AWF z Phaseolus vulgaris (fasola francuska) odmiany Tendergreen. Omówiono ograniczenia tej metody oraz optymalizację protokołu dla innych gatunków roślin. Odzyskany AWF może być wykorzystany w szerokim zakresie dalszych eksperymentów, które mają na celu scharakteryzowanie składu apoplastu i jego zmian w odpowiedzi na gatunki roślin i genotyp, rozwój roślin i warunki środowiskowe, lub określenie, w jaki sposób mikroorganizmy rosną w płynie apoplastowym i reagują na zmiany w jego składzie.

Wprowadzenie

Roślinny apoplast to przestrzeń międzykomórkowa, która otacza komórki roślinne. Jest to dynamiczne środowisko, w którym zachodzi wiele procesów metabolicznych i transportowych. Głównym składnikiem strukturalnym apoplastu jest ściana komórkowa, która jest składana i modyfikowana przez enzymy, białka strukturalne i metabolity znajdujące się w apoplastach. W zdrowych komórkach roślinnych apoplast jest na ogół utrzymywany w stanie kwaśnym, co pozwala na import aminokwasów, cukrów i innych składników odżywczych z apoplastu do cytoplazmy za pomocą symportu H^{+ 1}. Podczas transportu sacharozy sacharoza przemieszcza się ze źródeł fotosyntetycznych przez apoplast do naczynia krwionośnego; Sacharoza jest następnie transportowana przez potencjał osmotyczny utrzymywany przez inwertazy apoplastyczne rozszczepiające sacharozę w narządach zlewu². Cukry i inne składniki odżywcze mogą być również transportowane w górę i gromadzić się w jamach szparkowych poprzez strumień transpiracji³.

Apoplast reprezentuje również niszę środowiskową, gdzie wiele patogenów prowadzi swój pasożytniczy tryb życia. Bakteryjne patogeny roślinne mają zdolność namnażania się do dużych zagęszczeń w apoplastach, do których uzyskują dostęp przez naturalne otwory, takie jak aparaty szparkowe lub przez rany⁴. Wykazano, że stężenie aminokwasów i innych związków azotu w apoplastach pomidora jest wystarczające do zaspokojenia potrzeb żywieniowych patogenów bakteryjnych i grzybiczych^5,6. Pierwotne reakcje obronne wobec patogenów drobnoustrojów występują również w apoplastach, a mianowicie wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez zewnątrzkomórkowe peroksydazy i oksydazy oraz wzmacnianie ściany komórkowej poprzez sieciowanie i odkładanie kalozy⁷. Ściana komórkowa rośliny jest bogata w metabolity wtórne o działaniu przeciwdrobnoustrojowym; Charakter biochemiczny tych metabolitów wtórnych różni się w zależności od gatunku⁸.

W wyniku wyżej wymienionych i innych procesów, płyn apoplastyczny z liści zawiera różnorodne białka, cukry, kwasy organiczne, aminokwasy, metabolity wtórne, metale i inne kationy (np. Mg²⁺_, K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Fe^2/3+). Stężenia substancji rozpuszczonej w apoplaście pędów są kontrolowane w dużej mierze przez równowagę procesów transportowych zachodzących między apoplastem a ksylemem, łykiem i cytoplazmą⁹. Jednak reakcje metaboliczne i rozwój drobnoustrojów również zużywają lub wytwarzają substancje rozpuszczone apoplastyczne. Wiadomo, że skład apoplastu różni się w zależności od gatunku rośliny i genotypu oraz w odpowiedzi na zmieniające się warunki środowiskowe, w tym światło, odżywianie oraz stresy biotyczne i abiotyczne⁹. Badając skład apoplastu i jego zmiany, w tym takie właściwości, jak potencjał redoks i osmotyczny, pH, dostępność składników odżywczych/metabolitów i aktywność enzymatyczną, można uzyskać nowy wgląd w to, jak rośliny reagują na środowisko. Zrozumienie lub scharakteryzowanie zmian molekularnych zachodzących w roztworze apoplastu jest skomplikowane, ponieważ jest to przestrzennie ustrukturyzowany i dynamiczny przedział, w którym metabolity i / lub jony mogą być lotne, przejściowe lub związane ze ścianą komórkową i błoną plazmatyczną. Ponadto wymagane są różne techniki analityczne, aby objąć zakres różnych typów chemicznych.

Aby zbadać skład rozpuszczalnego apoplastu, zazwyczaj konieczne jest pobranie płynu z tkanki. Istnieje kilka metod ekstrakcji płynu apoplastowego z różnych tkanek, w tym nowo zaproponowana metoda pasków filtracyjnych¹⁰, ale najbardziej uznaną metodą ekstrakcji liści jest infiltracja-wirowanie. Technika ta została oceniona wcześniej^11-13 oraz Lohaus i wsp. 2001¹⁴ dostarczają dokładnej analizy wielu parametrów technicznych metody. Jak sugeruje nazwa, technika infiltracji i wirowania jest dwuetapową metodą, która zasadniczo polega na zastąpieniu apoplastycznej przestrzeni powietrznej wodnym płynem infiltracyjnym, który miesza się z natywnym płynem apoplastycznym, a następnie odzyskaniu mieszaniny infiltracji / płynu apoplastycznego poprzez delikatne odwirowanie liści. Ponieważ odzyskany płyn jest rozcieńczony i nie zawiera wszystkich związków obecnych w apoplastach (patrz poniżej), płyn ten jest powszechnie znany jako płyn do płukania apoplastów (AWF) lub czasami płyn do płukania międzykomórkowego, a nie płyn apoplastyczny. Technika infiltracji-wirowania jest łatwo skalowalna, co pozwala na generowanie pojedynczych lub zbiorczych próbek AWF o odpowiedniej objętości i poddawanie ich szerokiej gamie dalszych technik biochemicznych i analitycznych (np. elektroforeza białek, pomiar aktywności enzymów, NMR, wiele rodzajów chromatografii i spektrometria mas). Leaf AWF jest również przydatny jako pożywka naśladująca apoplast do badania interakcji mikroorganizmów kolonizujących rośliny z ich środowiskiem ⁵.

W poniższych protokołach opisujemy, jak przeprowadzić technikę infiltracji-wirowania przy użyciu Phaseolus vulgaris odmiany Tendergreen, oraz podajemy kilka przykładów dalszych analiz z naciskiem na metabolomikę. Co ważne, przedstawiono metody oceny jakości AWF wraz z poradami dotyczącymi optymalizacji procedury dla różnych typów liści.

Protokół

UWAGA: Wybór materiału wyjściowego liści i standaryzacja warunków wzrostu roślin jest kluczowa, ponieważ te czynniki mogą znacznie wpłynąć na jakość, zmienność i plon AWF (Rysunek 1). Parametry, które należy wziąć pod uwagę, przedstawiono w tabeli 1 i omówiono bardziej szczegółowo w dyskusji.

parametr	Przykładowe standaryzacje
	Phaseolus vulgaris (Phaseolus vulgaris)	Solanum lycopersicum	Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity)
Rodzaj skrzydła	Pierwsze prawdziwe liście, w pełni rozwinięte, zdrowe	2i 3 liście zaczynając od dołu, 4 największe listki pobrane Ulotka wierzchołkowa nie używana do ekstrakcji apoplastu	W pełni rozwinięte skrzydła rozety
Wiek rośliny	21 dni	7 - 9 tygodni	7 tygodni
Pora dnia	Okres w środku światła (12:00)	Okres w środku światła (12:00)	Okres w środku światła (12:00)
Nawilżenie	Wszystkie rośliny dobrze podlewane 1 godzinę przed zbiorami	Wszystkie rośliny dobrze podlewane 1 godzinę przed zbiorami	Wszystkie rośliny dobrze podlewane 1 godzinę przed zbiorami
światło	16 godzin światła, 400 μmol M-2 sec-1	16 godzin światła, 400 μmol M-2 sec-1	10 godzin światła (dzień krótki) od 2 tygodnia, 400 μmol m-2 sek-1
wilgotność	70%	70%	70%
temperatura	22 °C jasny, 18 °C ciemny	22 °C jasny, 18 °C ciemny	21 °C

Tabela 1. Przykłady znormalizowanych parametrów dla liści stosowanych w ekstrakcjach AWF.

1. Wytwarzanie płynu do prania Apoplast

UWAGA: Podczas tego protokołu niebezpieczne materiały zawierające patogeny mikrobiologiczne z zakażonych liści nie powinny być spłukiwane do kanalizacji; raczej powinny być stosowane odpowiednie procedury usuwania.

1. Wybierz aparaturę na podstawie rozmiaru liścia:
   1. Naciekać mniejsze liście (np. Arabidopsis, fasola) za pomocą strzykawki bezigłowej. Użyj kolby próżniowej, aby nacieknąć liście, które są zbyt duże, aby zmieścić się w strzykawce. Użyj metody kolby próżniowej, aby infiltrować wiele liści jednocześnie.
   2. Liście, które są zbyt duże dla dostępnej metody infiltracji, podziel na mniejsze sekcje za pomocą żyletki. Przed infiltracją dokładnie opłucz odcięte odcinki liści w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia cytoplazmatyczne, które wydzielają się z uszkodzonych komórek.
2. Naciek z liści za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml:
   1. Odłącz liść od rośliny na ogonku za pomocą żyletki. W przypadku liści złożonych, takich jak pomidor, oderwij ulotki od ogonka.
   2. Opłucz świeżo wycięty liść przez zanurzenie w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni liści. Osusz liść, delikatnie osuszając go chłonną chusteczką lub papierem.
   3. Zmierz masę liścia przed infiltracją.
   4. Ostrożnie zwinąć i/lub złożyć liść do strzykawki o pojemności 60 ml i napełnić strzykawkę wodą destylowaną (można użyć innych płynów infiltracyjnych, patrz dyskusja). Usunąć powietrze ze strzykawki, jednocześnie opuszczając tłok do oznaczenia około 40 ml.
   5. Przykryć końcówkę strzykawki palcem w rękawiczce lub kawałkiem Parafilm, a następnie wytworzyć podciśnienie wewnątrz strzykawki, pociągając tłok na zewnątrz do oznaczenia 60 ml. Powoli zwolnić tłok.
      UWAGA: Szybkie uwolnienie ciśnienia może spowodować lizę komórek i zanieczyszczenie cytoplazmatyczne.
   6. Odłączyć końcówkę strzykawki i wypuścić powietrze, a następnie ponownie podłączyć końcówkę i nacisnąć tłok dalej w dół, aby wytworzyć umiarkowane nadciśnienie.
   7. Powtarzaj kroki 1.2.5 - 1.2.6 aż do całkowitego naciekania liścia, co widać po ciemnym kolorze infiltrowanych obszarów.
   8. Usunąć liść ze strzykawki. Delikatnie, ale dokładnie osusz liść chłonnym papierem, aby usunąć płyn z powierzchni.
   9. Zmierz wagę infiltrowanego liścia. Oblicz różnicę w masie przed i po infiltracji, która jest bardzo zbliżona do objętości infiltracji.
3. Infiltracja liści przez kolbę próżniową:
   1. Odłącz liść od rośliny na ogonku za pomocą żyletki.
   2. Opłucz świeżo wycięty liść przez zanurzenie w wodzie destylowanej, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni liści. Osusz liść, delikatnie osuszając go chłonnym papierem.
   3. Zmierz masę liścia przed infiltracją.
   4. Umieść liść (lub liście, jeśli naciekają wiele liści) w kolbie bocznej o pojemności 250 ml lub większej zawierającej wodę destylowaną (można użyć innych płynów infiltracyjnych, patrz Dyskusja). Całkowicie przykryj liście płynem.
   5. Zastosować podciśnienie w kolbie. Delikatnie zamieszaj, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z liści. Ostrożnie i powoli zwolnij odkurzacz.
      UWAGA: Szybkie uwolnienie próżni może spowodować lizę komórek i zanieczyszczenie cytoplazmatyczne.
   6. Powtarzać krok 1.3.5 aż do całkowitego naciekania liścia, co widać po ciemnym kolorze naciekanych obszarów.
   7. Usunąć liść z kolby. Delikatnie, ale dokładnie osusz liść chłonnym papierem, aby usunąć płyn z powierzchni.
   8. Zmierz wagę infiltrowanego liścia. Oblicz różnicę w masie przed i po infiltracji, która jest bardzo zbliżona do objętości infiltracji.
4. Odzysk AWF przez odwirowanie:
   1. Umieść liść na kawałku parafilmu o szerokości 4 cali (10 cm). Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 5 ml (lub przedmiotu o podobnej wielkości) zwiń liść w Parafilm.
   2. Włożyć zwinięty liść z końcówką pipety do strzykawki o pojemności 20 ml. Ustaw wszystkie przycięte krawędzie liści skierowane do góry. Włożyć strzykawkę do czystej probówki z polietylenu lub poliwęglanu o pojemności 50 ml.
   3. Odwirować strzykawkę w probówce przez 10 minut przy 1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Oględziny liści po odwirowaniu powinny wykazać, że większość płynu infiltracyjnego została usunięta. Ciemniejsze zielone plamy wskazują, że wymagany jest dodatkowy czas wirowania.
   4. Odpipetować odzyskany AWF do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Objętość AWF powinna w przybliżeniu odpowiadać objętości infiltracji tego liścia; Jeśli objętość jest mniejsza, wymagany jest dodatkowy czas wirowania lub prędkość wirowania.
   5. Odwirować próbki AWF o masie 15 000 x g przez 5 minut w celu usunięcia wszelkich komórek lub cząstek stałych. Alternatywnie przepuść AWF przez filtr 0,22 μm, aby usunąć komórki i cząstki stałe.
   6. Odpipetować supernatant do świeżej probówki. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu przechowywania.
   7. Przechowywać próbki AWF w temperaturze -80 °C.

2. Testy na skażenie cytoplazmatyczne

1. Próbki AWF należy przechowywać na lodzie, aby zminimalizować reakcje enzymatyczne (np. proteolizę) i wykonywać testy natychmiast po zakończeniu etapów wirowania.
   UWAGA: W przypadku oznaczania metabolitów próbki można natychmiast zamrozić po ekstrakcji i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
2. Protokół testu dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) znajduje się w ^{punkcie 15}; w przeciwnym razie należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oznaczania MDH.
3. Standardowy protokół testu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PDH) znajduje się w ^{punkcie 16}; w przeciwnym razie należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oznaczania G6PDH.
4. Do ilościowego oznaczania metabolitów cytoplazmatycznych, takich jak glukozo-6-fosforan (G-6-P), należy użyć GC-MS, jak opisano w kroku 5. W przeciwnym razie użyj dostępnego w handlu zestawu do bezpośredniego oznaczania G-6-P.

3. Obliczanie współczynnika rozcieńczenia apoplastu

1. Przygotować dwie objętości płynu infiltracyjnego użytego powyżej w kroku 1.2.4 lub 1.3.4 (np. woda destylowana). Do jednego roztworu dodać proszek indygotyny do końcowego stężenia 50 μM, do drugiego nic nie dodawać.
2. Zmierzyć absorbancję 200 μl roztworu infiltracji indygotyny przy 610 nm (OD₆₁₀) roztworu infiltracji indygotyny za pomocą czytnika płytek. Skorygować tę wartość, odejmując OD₆₁₀ z 200 μl roztworu infiltracyjnego bez indygokarminu. Zastąp tę skorygowaną wartość jako_{infiltrację OD 610} do poniższego równania.
3. Wykonać co najmniej trzy powtórzone infiltracje liści, jak powyżej (krok 1.2 lub 1.3) z obydwoma roztworami infiltracyjnymi (z indygotyną i bez niej).
4. Po infiltracji opłucz liście w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie pozostałości indygo karminu obecne na zewnętrznych powierzchniach.
5. Kontynuuj wirowanie jak powyżej (krok 1.4).
6. Określić średni OD₆₁₀ z 200 μl ekstrakcji AWF indygotyny. Skoryguj tę wartość, odejmując średnią wartość OD₆₁₀ wynoszącą 200 μl AWF wolnego od indygotyny. Zastąp tę skorygowaną wartość jako OD_610AWF w poniższym równaniu.
7. Obliczyć współczynnik rozcieńczenia (tj. rozcieńczenie krotne) na podstawie skorygowanych wartości absorbancji jako:
   Współczynnik rozcieńczenia apoplast = OD_610infiltrat / (OD_610infiltrat - OD_610AWF)
8. Pomnóż wartości stężenia lub aktywności z AWF przez współczynnik rozcieńczenia, aby oszacować stężenie/aktywność w płynie apoplastycznym w planta.

4. Koncentracja AWF do pełnej wytrzymałości przez liofilizację

1. Włącz liofilizator i pozwól mu ustabilizować się przy temperaturze i ciśnieniu roboczym.
2. Zbierz żądaną ilość świeżych lub przechowywanych próbek AWF.
3. Rozprowadzić próbki równomiernie w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml.
4. Określ objętość rozpuszczonej rekonstytucji:
   Objętość rozpuszczenia = objętość przed liofilizacją / współczynnik rozcieńczenia apoplastu
5. Przy zamkniętych pokrywkach zamroź probówki w ciekłym azocie.
6. Przenieść zamrożone probówki do jednego lub więcej schłodzonych naczyń do liofilizacji. Podczas przenoszenia rurek załóż pokrywę na taką, która została przebita ostrym przedmiotem, aby umożliwić wymianę gazową.
7. Podłączyć naczynia do liofilizatora i całkowicie liofilizować próbki.
8. Wyjąć próbki z maszyny i rozpuść AWF, dodając obliczoną ilość wody destylowanej.
9. Założyć nieprzewierconą pokrywę i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.

5. Analiza metabolitów metodą chromatografii gazowej Spektrometria mas¹⁷

1. Odpipetować 200 μl AWF do probówki o pojemności 1,5 ml
2. Dodać 700 μl metanolu zawierającego 10 μg/ml rybitolu jako wzorzec wewnętrzny.
3. Podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min.
4. Wirować przez 10 minut przy 11 000 x g.
5. Przenieść 700 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
6. Dodać 375 μl zimnego chloroformu i wirować przez 10 sekund.
7. Dodać 500 μl dH₂O i wirować przez 10 sekund.
8. Wirować przez 15 minut przy 2 200 x g.
9. Przenieść 150 μl górnej warstwy wodnej do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie całkowicie wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.
10. Rozpuścić próbki w 30 μl pirydyny zawierającej 20 mg/ml chlorowodorku metoksyaminy.
11. Inkubować w temperaturze 70 °C, energicznie wstrząsając przez 2 godziny.
12. Dodać 50 μl MSTFA (N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamidu).
13. Inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 30 minut.
14. Przenieść próbki do szklanych fiolek zgodnych z GC-MS.
15. Przeprowadzić analizę GC-MS próbek. Patrz Lisec et al. 2009¹⁷, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji i wydajności sprzętu GC-MS.

Wyniki

Typowe wyniki ekstrakcji AWF przeprowadzanej na zdrowym 3-tygodniowym P. vulgaris cv. Liście Tendergreen, przy użyciu wody destylowanej jako płynu infiltracyjnego, są pokazane w Tabeli 2. Młode liście P. vulgaris są podatne na infiltrację, a przy zastosowanej tutaj prędkości wirowania (1000 x g) usunięcie większości płynu infiltracyjnego przez odwirowanie można zaobserwować bezpośrednio, gdy liście powracają do swojego pierwotnego zielonego koloru. Masa świeżych liści P. vulgaris wynosiła średnio 1,1 x g przed infiltracją i dawała 0,5 ml AWF na gram świeżej masy. Stężenie białka w AWF określono na 0,18 ± 0,08 mg/ml przy użyciu standardowego testu białka Bradforda. Współczynnik rozcieńczenia dla tych liści, obliczony przez pomiar rozcieńczenia indygotyny, wynosił 2,3 ± 0,3 razy. Powyższe wartości mogą się znacznie różnić w zależności od gatunku i wymagane są eksperymenty pilotażowe w celu określenia plonu AWF na gram świeżej masy liścia, a także stężenia białka AWF i współczynnika rozcieńczenia, których można oczekiwać dla danego typu liścia.

Uszkodzenie integralności komórek może wystąpić zarówno podczas etapu infiltracji, jeśli zmiany ciśnienia są zbyt szybkie, jak i podczas etapu wirowania, jeśli siła odśrodkowa jest zbyt duża. W związku z tym konieczne jest oznaczenie próbek AWF pod kątem markerów zanieczyszczenia cytoplazmatycznego; Idealnie byłoby, gdyby przeprowadzanych było wiele niezależnych testów. W tym miejscu wyniki trzech możliwych testów przedstawiono w tabeli 2. W dobrze przeprowadzonych ekstrakcjach P. vulgaris AWF, G6PDH był niewykrywalny za pomocą standardowego testu enzymatycznego. Jest to zgodne z innymi raportami, w których aktywność G6PDH staje się wykrywalna dopiero powyżej progowej siły odśrodkowej¹². Natomiast wyjściowy poziom aktywności dehydrogenazy jabłczanowej (2,5 U/ml) był wykrywalny we wszystkich próbkach AWF P. vulgaris przy użyciu standardowego testu metabolicznego. Zwiększenie siły odśrodkowej powyżej progu 1 000 x g spowodowało zwiększenie aktywności MDH (wyniki nie pokazane). Ponieważ wiadomo, że apoplast z innych gatunków zawiera endogenną aktywność MDH¹⁸, wykryta tutaj ilość jest uważana za rzeczywistą aktywność apoplastyczną, a znaczny wzrost powyżej tego poziomu podstawowego wskazuje na zanieczyszczenie. Metabolity, które uważa się za głównie cytoplazmatyczne, takie jak hekso-6-fosforany, mogą być również wykorzystywane do oceny zanieczyszczenia AWF. W tym przypadku analiza GC-MS wykryła zerowe lub śladowe poziomy G-6-P w ekstrakcjach AWF. Natomiast w przekrojach korzeni kukurydzy ciętej G-6-P wykryto po ekstrakcji AWF przy wszystkich prędkościach wirowania i zwiększano stężenie przy wyższych prędkościach, co wskazuje na zanieczyszczenie cytoplazmatyczne¹⁰.

Analiza metabolitów przez GC-MS liścia AWF P. vulgaris zazwyczaj daje 40 - 60 możliwych do zidentyfikowania metabolitów i mniej więcej taką samą liczbę niezidentyfikowanych związków (Rysunek 2). Kwasy organiczne, cukry proste i aminokwasy stanowią większość możliwych do zidentyfikowania metabolitów, jednak wtórne metabolity roślinne zostały również wykryte i określone ilościowo na podstawie AWF¹¹. Kilka przykładowych pików z tych różnych klas cząsteczek jest oznaczonych na rysunku 2. Dalsze techniki analityczne mają zastosowanie do tych próbek AWF w celu ilościowego oznaczania różnych cząsteczek, na przykład: ICP-MS, NMR, HPLC, spektroskopia absorpcji atomowej, spektrometria mas białek.

Składnik białkowy apoplastu jest również reprezentowany w AWF, jak pokazano w żelu SDS-PAGE Coomassie Brilliant Blue na rysunku 3. Enzymy apoplastyczne są odpowiedzialne między innymi za syntezę ściany komórkowej i tworzenie zewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu. Badania proteomiczne AWF różnych gatunków zidentyfikowały dziesiątki pojedynczych białek i wykazały, że składnik białkowy apoplastu reaguje na stres środowiskowy^13,19. Idealnie ekstrakt z AWF powinien być wolny od zanieczyszczeń białkami cytoplazmatycznymi, takimi jak Rubisco; Jednak w praktyce jest to trudne do osiągnięcia. Obecność pasma białka Rubisco na poziomie ~53 kDa po SDS-PAGE zapewnia kolejny test jakościowy dla integralności próbek AWF. Na przykład próbka załadowana na tor 2 na rysunku 3 zawiera większą ilość zanieczyszczenia Rubisco niż na torze 1.

	Phaseolus vulgaris AWF
Objętość AWF (ml g-1 skrzydło FW)	0,49 ± 0,09
Zawartość białka (mg ml-1)	0,18 ± 0,08
Współczynnik rozcieńczenia	2,3 ± 0,3
Aktywność G6PDH (U ml-1)	Nie wykryto
Glc-6-P (mg ml-1)	Nie wykryto
Aktywność MDH (U ml-1)	2,5 ± 0,9

Tabela 2. Typowe wyniki ekstrakcji AWF z P. vulgaris cv. Tendergreen leaves.

Rysunek 1. Standardowy przebieg ekstrakcji apoplastowej. Liczby odnoszą się do kroków w protokole.

Rysunek 2. Przykładowy chromatogram GC-MS P. vulgaris cv. Tendergreen AWF.Ponumerowane przykładowe piki metabolitów to: 1-malonian, 2-fosforan, 3-bursztynian, 4-nieznany, 5-jabłczan, 6-asparagina, 7-rybitol (wzorzec wewnętrzny), 8-cytrynian, 9-glukoza, 10-inozytol, 11-kwas kawowy, 12-sacharoza.

Rysunek 3. Przykładowy żel barwiony SDS-PAGE Coomassie z P. vulgaris (wulgarny) Ekstrakty z liści AWF. Żel ten zapewnia porównanie składników białkowych dwóch ekstrakcji AWF, które różnią się stopniem zanieczyszczenia cytoplazmatycznego przez obfity enzym plastydialny Rubisco. Po ekstrakcji AWF obie próbki poddano wytrącaniu białka acetonowego w 4-krotnym nadmiarze (v/v) zimnego acetonu i rozpuszczano w wodzie w ilości jednej dziesiątej pierwotnej objętości. Pasy 1 i 2 zawierają 40 μg białka. Pasmo odpowiadające dużemu łańcuchowi Rubisco (~53 kDa) jest oznaczone strzałką. M_r: markery masy cząsteczkowej białka.

Dyskusja

Optymalizacja źródła tkanek roślinnych

Różnice biologiczne i techniczne mogą być duże podczas wykonywania ekstrakcji apoplastem, dlatego wysoce ustandaryzowany przepływ pracy jest pomocny w zwiększaniu ciągłości między eksperymentami (ryc. 1). Co ważne, źródło tkanki roślinnej musi być znormalizowane, w tym rodzaj liści, wiek liści, warunki wzrostu/środowiska i pora dnia (tabela 1). Istnieją duże różnice w łatwości, z jaką różne liście są infiltrowane, a następnie odzyskiwany przez odwirowanie; Różnice te są skorelowane z liczbą aparatów szparkowych, wielkością otworu i odpornością mezofilu^12,14. Nawet wśród różnych odmian P. vulgaris istnieją duże różnice w łatwości i wydajności procedury ekstrakcji AWF; na przykład liście użytej tutaj odmiany Tendergreen są bardziej podatne na ekstrakcję AWF tą metodą niż odmiana Canadian Wonder. W obrębie P. vulgaris pierwsze prawdziwe liście są największe i najłatwiejsze do infiltracji, co czyni je oczywistym wyborem do ekstrakcji apoplastycznej. Wykazano, że objętość powietrza i wody apoplastycznej zmienia się wraz z wiekiem liści u kilku gatunków, co prowadzi do różnic w zdolności ekstrakcji AWF^12,14. U P. vulgaris starsze liście stają się znacznie trudniejsze do infiltracji i dają mniej AWF po odwirowaniu; Dlatego liście zbierano po osiągnięciu pełnej ekspansji. Liście, które są trudne do infiltracji, wymagają następnie większych prędkości wirowania, aby odzyskać AWF. Dlatego należy dokładnie przesiać kilka różnych typów i odmian liści przed podjęciem decyzji o źródle tkanek do ekstrakcji AWF na dużą skalę.

Warunki wzrostu roślin muszą być również w jak największym stopniu ustandaryzowane w kontekście eksperymentu. Preferowane jest stosowanie szaf wzrostowych, ponieważ pozwalają one na utrzymanie stałej wilgotności, temperatury i natężenia światła. Zbiór liści powinien zawsze odbywać się o tej samej porze dnia, ponieważ stężenia metabolitów, enzymów itp. zmieniają się w ciągu całego cyklu dobowego¹⁴. Wreszcie, aby upewnić się, że wszystkie liście rośliny mają podobny nacisk turgoru, rośliny należy podlać na krótko przed (~1 godziną) zbiorami.

Optymalizacja infiltracji i wirowania liści

Niepożądane zanieczyszczenie cytoplazmatyczne AWF spowodowane częściową lizą komórek nastąpi, jeśli naprężenia mechaniczne napotykane przez komórki są zbyt wysokie podczas etapów infiltracji lub wirowania. Dlatego procedura dla danego typu liścia powinna być zoptymalizowanym kompromisem między maksymalizacją plonu a minimalizacją zanieczyszczenia cytoplazmatycznego AWF. We wszystkich przypadkach należy stosować najniższą prędkość wirowania, przy której można odzyskać AWF, aby uniknąć ewentualnego mechanicznego uszkodzenia komórek liścia. Optymalizacja prędkości wirowania powinna być określona empirycznie dla każdego typu liścia poprzez monitorowanie odzyskanej objętości i zanieczyszczenia apoplastem w zakresie prędkości wirowania. Zaobserwowano, że aktywność enzymów markerowych, takich jak MDH, G6PDH i izomeraza glukozowo-fosforanowa, pozostaje niska do momentu przekroczenia progowej siły odśrodkowej, powyżej której aktywność ta gwałtownie wzrasta, prawdopodobnie z powodu wycieku cytoplazmatycznego^9,12,14. Zastosowanie Parafilmu jako podparcia na etapie wirowania, jak zauważyli Baker i in. 2012¹¹, może poprawić skuteczność ekstrakcji AWF i może zminimalizować mechaniczne uszkodzenia blaszki liściowej spowodowane nadmiernym fałdowaniem i ściskaniem. Ponadto zastosowanie Parafilmu poprawia wizualizację liścia po odwirowaniu, kiedy należy zbadać liść pod kątem uszkodzeń i kompletności ekstrakcji AWF.

Nouchi¹² opisuje optymalizację odzyskiwania AWF z ciętych odcinków liści ryżu, które są trudne do infiltracji i wymagają większych prędkości wirowania w celu zebrania AWF ze względu na ich małe otwory szparkowe. Lepsze zwilżanie powierzchni liści ryżu, poprzez wstępne namoczenie liści w wodzie destylowanej lub dodanie środka powierzchniowo czynnego do płynu infiltracyjnego, ułatwiło proces infiltracji. Wyższą prędkość wirowania (6 000 x g) zastosowano również podczas monitorowania zanieczyszczenia apoplastycznego¹². W przypadku stosowania wyciętych odcinków liści zawsze istnieje ryzyko, że zanieczyszczenie cytoplazmatyczne będzie bardziej rozpowszechnione, nawet przy intensywnym myciu miejsc rany; Dlatego ścięte liście powinny być używane tylko wtedy, gdy jest to konieczne.

W wielu badaniach jako płyn infiltracyjny stosuje się wodę destylowaną¹¹. Jednak do płynu infiltracyjnego można dodawać związki, takie jak sole lub, w celu poprawy ekstrakcji niektórych związków apoplastycznych, zwłaszcza białek¹³. Lohaus¹⁴ ocenił wpływ siły jonowej i osmotycznej na skład odzyskanego AWF i stwierdził, że jest on nieistotny. Zmiany pH pożywki infiltracyjnej mogą jednak wpływać na skład AWF¹⁴.

Ważne jest właściwe obchodzenie się z wyekstrahowanym płynem apoplastycznym i jego przechowywanie. Wykazano, że AWF zawiera obfitość proteaz i innych enzymów^13,20, a także lotnych związków organicznych. Dlatego, aby ograniczyć zmiany w składzie AWF po odzysku, zaleca się przechowywanie próbek na lodzie lub w inny sposób w temperaturze -80 °C. Ponadto testy enzymatyczne AWF należy wykonać jak najszybciej po ekstrakcji, aby ograniczyć inaktywację enzymów w wyniku proteolizy, przedłużonego rozcieńczania lub zamrażania i rozmrażania.

Proces infiltracji rozcieńcza płyn apoplastyczny i często konieczne jest określenie zakresu tego rozcieńczenia. Etap wirowania może również rozcieńczyć AWF wodą z przedziałów wewnątrzkomórkowych. Współczynnik rozcieńczenia jest potrzebny do oszacowania stężeń chemicznych apoplastów in vivo , gdy pomiary są wykonywane na AWF. Czynnik rozcieńczający jest również potrzebny do skoncentrowania AWF z powrotem do pełnej mocy, gdy jest on stosowany jako pożywka naśladująca apoplast dla drobnoustrojów - dopasowując w ten sposób stężenia metabolitów in vivo tak dokładnie, jak to możliwe. Istnieje kilka wariantów metody opisanej w kroku 4 do oznaczania współczynnika rozcieńczenia AWF poprzez pomiar rozcieńczenia związku znacznikowego dodanego do płynu infiltracyjnego. Dla wszystkich metod obliczenie rozcieńczenia AWF zakłada, że płyn infiltracyjny nie jest w znacznym stopniu wchłaniany lub rozcieńczany przez komórki liści podczas procesu odzyskiwania AWF. Założenie to zostało wcześniej zweryfikowane dla etapu infiltracji¹⁴ , ale nie zostało zweryfikowane dla etapu wirowania. Związek znacznikowy nie może być również wchłaniany, transportowany ani modyfikowany w apoplastach. Indygotyna jest najczęściej stosowanym i najdokładniej przebadanym barwnikiem używanym do obliczeń rozcieńczania AWF. Indygotyna wykazuje niską absorbancję żywicy kationowymiennej i izolowanych ścian komórkowych i wykazano, że nadaje się do obliczeń AWF w Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum i Glycine max^11,21,22. Jednak w przypadku niektórych rodzajów liści, np. ryżu i ogórka, indygotyna nie wydaje się być w pełni odzyskana po naciekaniu, co prowadziłoby do niedoszacowania współczynnika rozcieńczenia AWF^12,21. Brak odzysku indygotyny może wynikać z jego podatności na rozszczepienie w sulfonian izatyny przez ponadtlenek²³, o którym wiadomo, że jest wytwarzany w apoplastach, zwłaszcza pod wpływem stresu²⁴. Rozszczepienie indygotyny na sulfonian izatyny spowoduje utratę absorbancji przy 610 nm i wzrost przy 245 nm. Do tej pory nie zbadano, czy reakcja ta zachodzi w znacznym stopniu w apoplastach, czy też reakcja ta może zostać zahamowana przez dodanie zmiataczy ponadtlenkowych do płynu infiltracyjnego. Niebieski dekstran został użyty zamiast indygokarminy do ilościowego określenia czynnika rozcieńczenia AWF w liściach ryżu¹², chociaż nie zgłoszono jego stabilności i odzysku w AWF. Alternatywnie, zamiast barwników można użyć związków znakowanych radioizotopem, takich jak sorbitol [¹⁴C] lub inne mierzalne wzorce wewnętrzne, a spadek radioaktywności lub stężenia mierzyć i wykorzystywać do obliczania współczynnika rozcieńczenia w analogiczny sposób^11,14,25.

Ograniczenia techniki

Istnieje kilka zastrzeżeń dotyczących metody izolacji AWF metodą infiltracji i odwirowania. Po pierwsze, rozcieńczenie apoplastu podczas infiltracji może wywołać reakcję rośliny. Jeśli otaczające komórki liści wykryją zmniejszone stężenie niektórych składników płynu apoplastycznego, mogą zareagować wydalaniem dalszych metabolitów, zniekształcając interpretację stężeń metabolitów. W ocenie tego problemu zaobserwowano, że ani czas między infiltracją a odwirowaniem, ani umiarkowane różnice w sile jonowej płynu infiltracyjnego nie wpłynęły na skład wyekstrahowanego AWF^14,22. Dlatego uważa się, że wszelkie artefakty powstałe w wyniku rozcieńczenia apoplastu są minimalne.

Drugą potencjalną wadą jest to, że elucja AWF przez wirowanie nie wychwytuje wszystkich cząsteczek obecnych w apoplastach z kilku powodów. Niektóre związki, w szczególności kationy i białka, mogą być ściśle związane z ujemnie naładowaną ścianą komórkową i nie eluować za pomocą AWF¹³. Inne cząsteczki, takie jak białka, mogą być zbyt duże, aby skutecznie wymywać się z apoplastu przy stosowanych prędkościach wirowania¹⁴. Reaktywne formy tlenu są ważną klasą związków wytwarzanych w apoplastach, ale ze względu na krótkotrwały charakter tych związków i nieokreślone wymagania dotyczące ich produkcji, ich obecność nie jest dobrze wychwytywana przez ekstrakcję AWF. Nie wiadomo, jak dokładnie AWF odzwierciedla skład in vivo płynu apoplastowego i może się on różnić w zależności od gatunku.

Istnieje kilka testów określających zanieczyszczenie cytoplazmatyczne, ale żadne z nich nie jest powszechnie akceptowane. Testy głównie enzymów cytoplazmatycznych (np. G6PDH, izomerazy fosforanu heksozy, MDH) mają tę zaletę, że są łatwe do wykonania, ale mogą nie korelować dobrze z przeciekiem cytoplazmatycznym^14,18. Ocena metabolitów cytoplazmatycznych (np. fosforanów heksozy, chlorofilu) jest być może bardziej orientacyjna, ale jest mniej dobrze ugruntowana¹¹. Niemniej jednak każdy rodzaj testu może być przydatny do względnego oznaczania ilościowego zanieczyszczenia apoplastycznego między próbkami. Idealnie byłoby, gdyby w celu walidacji integralności próbki AWF zastosowano wiele niezależnych pomiarów.

Uznając swoje ograniczenia, opisana tutaj technika infiltracji-wirowania pozostaje prostą i solidną techniką w badaniu białek apoplastycznych, metabolitów pierwotnych i wtórnych oraz jonów nieorganicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do mikrowirówek Eppendorf	Eppendorf	22364111
żyletka	Fisher	12-640
Strzykawka 60 ml	Becton Dickinson	300865
Strzykawka 20 ml	Becton Dickinson	300613
4 calowa parafilm	Bemis	PM-996
kolba boczna	SciLabware	12972831
źródło
Końcówki do pipet 5 ml	Fisher	50-813-28
wirówka	Beckman Coulter	392932
Wahadłowy wirnik kubełkowy	Beckman Coulter	369702
indygo karmin	Sigma	I8130
czytnik mikropłytek	Tecan	Infinite 200
96-dołkowe	353072		Becton Dickinson
	SciQuip	Chrystus Mikrowirówka Alpha 2-4 LD
	biorad	166-0612EDU
Kwas szczawiooctowy	Sigma	O4126
D-glukozo-6-fosforan	Sigma	G7250
NADH		10128023001
MDH	Biovision	K654-100
G6PDH	Sigma	MAK015-1KT
Zestaw testowy G-6-P	Biovision	K657-100
rybitol	Sigma	A5502
metanol	Sigma	650471
chloroform	Sigma	472476
koncentrator próżniowy	Thermor Scientific	SC250EXP
chlorowodorek metoksyaminy	Sigma	226904
N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid	Sigma	394866