Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania w dziedzinie anatomii, embriologii i biologii rozwoju w dużej mierze opierały się na wykorzystaniu organizmów modelowych. W celu zbadania rozwoju żywych zarodków często wykorzystuje się organizmy modelowe, takie jak kurczaki. Kurczak jest doskonałym organizmem modelowym ze względu na niski koszt i minimalną konserwację, jednak stanowi wyzwanie obserwacyjne, ponieważ jest zamknięty w nieprzezroczystej skorupce jajka. Aby prawidłowo oglądać zarodek w trakcie jego rozwoju, skorupa musi zostać przesklona lub usunięta. Opracowano zarówno techniki okienkowania, jak i ex ovo, aby pomóc naukowcom w badaniu rozwoju embrionalnego. Jednak każda z metod ma ograniczenia i wyzwania. Przedstawiamy tutaj prostą, zoptymalizowaną technikę hodowli ex ovo zarodków kurczaków, która umożliwia obserwację rozwoju embrionalnego od stadium HH 19 do późnych stadiów rozwoju (HH 40), kiedy rozwinęło się wiele narządów. Technika ta jest łatwa do zastosowania zarówno na zajęciach licencjackich, jak i w bardziej zaawansowanych laboratoriach badawczych, w których przeprowadza się manipulacje zarodkami.
Wprowadzenie
Hodowla ex ovo odegrała ważną rolę w badaniach nad rozwojem kurczaka1, 2. Ta metoda hodowli została wykorzystana do badania chorób neurologicznych, rozwoju kończyn, rozwoju twarzoczaszki oraz jako model do badania wad rozwojowych związanych z cukrzycą 3, 4, 5.
Istnieje wiele odmian techniki ex ovo. Najczęstszym podejściem jest użycie styropianowego kubka6,7,8 lub szklanej miski5. W tych metodach kubek lub miskę wykłada się folią spożywczą w celu kołysania zarodka, na kubku umieszcza się pokrywkę, a następnie zarodek umieszcza się w inkubatorze o odpowiedniej wilgotności6. Ta konfiguracja może być jednak trudna technicznie. Pierwszym wyzwaniem jest folia, która służy do kołysania zarodka. Ta chusta jest trudna w obróbce i często nie przylega zbyt dobrze do miseczki. Aby rozwiązać ten problem, wokół kubka umieszcza się elastyczną opaskę, która utrzymuje chustę na miejscu. Mimo to folia może się zsunąć, co jest śmiertelne dla zarodka. Folia plastikowa może zostać rozerwana lub przebita kleszczami lub igłami, które mogą być używane podczas manipulacji i obserwacji zarodków. Wreszcie, ta konfiguracja nie jest zbyt stabilna i uczniowie mogą łatwo przewrócić kubki. Wysokość baniek sprawia również, że bardzo trudno jest umieścić zarodek pod mikroskopem stereoskopowym, który ma ograniczony obiektyw do wysokości sceny. Wyzwania te utrudniają studentom studiów licencjackich pracę z żywymi zarodkami piskląt w laboratoriach dydaktycznych, takich jak kursy zaawansowanej biologii rozwojowej.
Powyższe wyzwania w metodzie ex ovo sprawiły, że badacze zwrócili się ku metodzie okienkowej 9,10, aby przyjrzeć się rozwojowi embrionalnych piskląt. W tej technice w skorupce jaja nad zarodkiem wykonuje się otwór lub "okno". Otwór można ponownie uszczelnić taśmą lub woskiem9, aby umożliwić dalszy rozwój embrionalny. Chociaż metoda okienkowa ma pewne zalety, takie jak możliwość podglądu rozwoju embrionalnego i łatwa konserwacja, ta metoda ma również kilka ograniczeń. Po pierwsze, okno musi być dość duże, aby można było zobaczyć cały zarodek (szczególnie w późnych stadiach). Po drugie, duże okna są trudne do uszczelnienia; Niewłaściwe uszczelnienie doprowadzi do problemów ze sterylnością i przeżywalnością. Używanie stopionego wosku jako szczeliwa dodaje kolejny niewygodny i niechlujny krok do protokołu. Dlatego, chociaż metoda okienkowania może być idealna dla zarodków piskląt w młodych stadiach (HH 11 – HH 27), oglądanie całego zarodka w późnych stadiach nie jest łatwe.
Tutaj opisujemy ulepszoną i prostą technikę hodowli ex ovo 11, która pozwala uniknąć konieczności stosowania zaawansowanego technologicznie sprzętu, jest łatwa w obsłudze pod mikroskopem stereoskopowym, daje embrionowi wystarczające wsparcie do wykonywania mikroskopijnych manipulacji i umożliwia badaczom obserwowanie wzrostu zarodka w całości aż do późniejszych etapów rozwoju (do HH 40-41). Dzięki tym postępom w technice ex ovo jednostki uzyskują dostęp do pełniejszego zrozumienia rozwoju embrionalnego. Na przykład wzrost w późniejszych stadiach pozwala jednostkom obserwować procesy rozwojowe, które nie zachodzą do tego momentu, takie jak kostnienie, rozwój piór oraz zaawansowany rozwój kończyn i oczu. Cały zarodek i błony pozazarodkowe oraz naczynia krwionośne są wyraźnie widoczne. Można również przeprowadzić bardziej zaawansowane badania, takie jak manipulacje embrionalne (tj. wszczepianie kulek nasączonych inhibitorami lub wprowadzanie barier między warstwami tkanek), a naukowcy są wtedy w stanie zaobserwować efekt manipulacji w zarodkach w późniejszym stadium.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Wszystkie materiały eksploatacyjne są wymienione w Tabeli 1.
1. Przechowywanie zarodków kurczaka
- Jaja kurze szczepu Gallus gallus inkubować poziomo w temperaturze 37oC przy wilgotności około 40% i obracać jaja raz lub dwa razy dziennie. Obracanie jaj jest ważne, aby zapobiec przyleganiu zarodka do skorupki jaja.
- Nie należy obracać jaja w ciągu 24 godzin przed założeniem hodowli, ponieważ w przeciwnym razie zarodek będzie zlokalizowany brzusznie w stosunku do masy żółtkowej i zostanie uszkodzony po otwarciu jaja w kroku 3. Ponadto jaja należy przechowywać w temperaturze 4 stopniCnie dłużej niż tydzień przed inkubacją, aby "zatrzymać" rozwój, ale nie jest to idealne rozwiązanie.
2. Inscenizacja zarodków kurczaka
- Przygotować zarodki kurczaka za pomocą stołu do postoju Hamburger i Hamilton12. Idealnym etapem do rozpoczęcia hodowli ex-ovo jest faza HH 19-20 (około 3 dni inkubacji), ponieważ następuje to krótko po tym, jak głowa obraca się w temperaturze 53 hpf.
Uwaga: Stadium HH 19-20 charakteryzuje się następującymi cechami morfologicznymi: somity są rozszerzone na większość ogona, jednak sam koniec ogona pozostaje niesegmentowany, pączek ogonowy jest zwinięty, omocznik jest mały i ma ograniczone unaczynienie, pąki nóg są większe niż pąki skrzydeł, a oczy są bezbarwne lub mają szarawy odcień.
3. Usuwanie zarodka z powłoki
- Przed wyjęciem zarodka ze skorupy spryskaj ją 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Nie obracaj szybko jaja, ponieważ może to uszkodzić zarodek.
- Uważając, aby nie zmienić orientacji jaja, ostrożnie rozbij jajo na dolnej stronie (tj. stronie, która była brzuszna podczas inkubacji) i wypuść zarodek do sterylnej łodzi do ważenia (88 x 88 x 23 mm). Przetrzyj łodzie wagowe 70% etanolem. Sprawdź zarodek, aby upewnić się, że worek z żółtkiem nie jest uszkodzony. Jeśli żółtko pękło, wyrzuć zarodek, ponieważ nie przeżyje.
- Obserwuj zarodek, aby upewnić się, że jest zdolny do życia; serce bije, unaczynienie wydaje się normalne i nie ma żadnych widocznych nieprawidłowości. Upewnij się, że krawędzie łódki ważącej są suche.
- Za pomocą pipety upuść 40 μl penicyliny/streptomycyny (5 000 jednostek penicyliny, 5 mg streptomycyny na ml) na albuminę, aby zapobiec infekcji.
4. Przygotowanie komory wilgotnościowej
- Umieść mały stos chusteczek nawilżanych i/lub chłonną wkładkę wykonaną z bawełny na dnie sterylnego plastikowego pojemnika (12 x 12 x 6 cm) przetartego 70% etanolem.
- Dodać sterylną, destylowaną wodę, aby zwilżyć chusteczki i/lub bawełnę (około 150 ml wody).
5. Montaż kultury ex ovo
- Umieść łódkę ważącą zawierającą zarodek na wilgotnej wyściółce. Następnie umieść połowę kwadratowej sterylnej szalki Petriego (9,5 x 9,5 cm) na górze łodzi do ważenia, aby utworzyć luźną pokrywkę.
- Przykryj plastikowy pojemnik pokrywką. Dociśnij dwa rogi pokrywy, zapewniając częściowe uszczelnienie, które nadal pozwala na dobry przepływ powietrza wewnątrz komory.
- Ostrożnie umieścić zestaw w inkubatorze o temperaturze 37oC do pożądanego etapu.
- Umieść pojemniki z wodą w inkubatorze, aby pomóc kontrolować wilgotność, jeśli inkubator o kontrolowanej wilgotności jest niedostępny. Wysterylizuj całą wodę w komorach wilgotnościowych i inkubatorze i uzupełnij w razie potrzeby w okresie inkubacji. Idealna jest wilgotność 40%.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ta metoda ex ovo pozwala na obserwację embrionów od wczesnych etapów rozwoju (HH 19/20) do późnych etapów rozwoju (HH 40-41) (Rysunek 1A oraz 1B). Przygotowanie hodowli na etapie HH 19-20 zwiększa przeżywalność embrionów w kulturze. Przed obróceniem głowy (przed 53 hpf) przeżywalność w hodowli jest bardzo niska, a po etapie 21 embrion ma tendencję do silniejszego przylegania do skorupki podczas usuwania, przez co uzyskuje się mniej nienaruszonych embrionów. Ogólnie przeżywalność...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Uprawa ex ovo i okienkowanie mają zarówno zalety, jak i wyzwania. Tutaj porównujemy zalety i wyzwania związane z metodą kubka styropianowego ex ovo i metodą okienkowania z naszą zoptymalizowaną metodą ex ovo pokazaną tutaj. Nasza metoda umożliwia manipulację i łatwą obserwację zarodka pisklęcia w późnych stadiach rozwoju, a nasze udoskonalenia do tradycyjnej metody ex ovo 1, 2, 3 sprawiają, że jest ona dodatkowo bardzo łatwa w użyciu na zajęciach laboratoryjnych na studiach ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w odniesieniu do informacji przedstawionych w niniejszym manuskrypcie.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Paulowi Poirierowi, producentowi medialnemu z Uniwersytetu Mount Saint Vincent za jego pracę przy filmowaniu i edycji części wideo tego rękopisu. Dziękujemy Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (Natural Science and Engineering Research Council of Canada) za przyznanie finansowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Penicylina/Streptomycyna | Sigma | P4458 | Zrób małe porcje, aby uniknąć zamarzania/rozmrażania |
| Kwadratowa szalka | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Łódź wagowa | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Pojemnik Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Bibliografia
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
