Artykuł metodologiczny

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

27.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52134

⸱

31 października 2014

 , 
1Department of Microbial Genetics, Interfaculty Institute of Microbiology and Infection Medicine Tübingen (IMIT), Faculty of Science, University of Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metodę rozszerzania startera opartą na fluorescencji, aby określić punkty początkowe transkrypcji na podstawie bakteryjnych transkryptów i przetwarzania RNA in vivo za pomocą automatycznego sekwenatora żelowego.

Streszczenie

Rozszerzenie startera oparte na fluorescencji (FPE) to metoda molekularna do określania punktów początkowych transkrypcji lub miejsc przetwarzania cząsteczek RNA. Osiąga się to poprzez odwrotną transkrypcję interesującego RNA przy użyciu specyficznych starterów znakowanych fluorescencyjnie, a następnie analizę powstałych fragmentów cDNA poprzez denaturację elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Jednocześnie na żelu przeprowadzana jest tradycyjna reakcja sekwencjonowania Sangera w celu zmapowania końców fragmentów cDNA na ich dokładne odpowiadające im zasady. W przeciwieństwie do 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), gdzie produkt musi zostać sklonowany, a wielu kandydatów zsekwencjonowanych, większość fragmentów cDNA generowanych przez wydłużenie startera może być jednocześnie wykryta w jednym przebiegu żelu. Ponadto cała procedura (od odwrotnej transkrypcji do końcowej analizy wyników) może zostać zrealizowana w ciągu jednego dnia roboczego. Dzięki zastosowaniu starterów znakowanych fluorescencyjnie można uniknąć stosowania niebezpiecznych odczynników znakowanych izotopami promieniotwórczymi, a czas przetwarzania jest skrócony, ponieważ produkty mogą być wykrywane podczas procedury elektroforezy.

W poniższym protokole opisujemy metodę rozszerzania startera fluorescencyjnego in vivo, aby niezawodnie i szybko wykryć końcówki 5' RNA, aby wydedukować punkty początkowe transkrypcji i miejsca przetwarzania RNA (np. przez składniki systemu toksyna-antytoksyna) w S. aureus, E. coli i innych bakteriach.

Wprowadzenie

Rozszerzanie startera1 jest metodą molekularną służącą do określania końców 5’ specyficznych cząsteczek RNA z rozdzielczością do jednego nukleotydu. Przewagą nad innymi metodami, takimi jak 5’-RACE (szybka amplifikacja końców cDNA), jest krótki czas analizy oraz możliwość łatwego badania mieszaniny cząsteczek RNA o różnej długości.

Metoda ta polega na poddaniu cząsteczek RNA reakcjom odwrotnej transkrypcji z użyciem specyficznych fluorescencyjnych starterów, co prowadzi do wytworzenia fragmentów cDNA o określonych długościach. Cząsteczki cDNA te są rozdzielane równolegle z tradycyjnymi reakcjami sekwencjonowania metodą Sangera2 na denaturujących żelach poliakrylamidowych i mogą być wykrywane dzięki ich fluorescencji wynikającej z zastosowania starterów znakowanych fluorescencyjnie. Następnie długości fragmentów cDNA są oceniane poprzez porównanie ich z drabiną sekwencjonującą, co umożliwia mapowanie końców 5’ RNA.

Tradycyjnie reakcje wydłużania starterów stosuje się wraz z izotopami promieniotwórczymi w celu wykrywania cząsteczek cDNA na kliszach rentgenowskich. Ze względu na zagrożenia dla zdrowia, problemy z utylizacją odpadów oraz łatwość obsługi, nowsze protokoły wykorzystują fluorescencję do detekcji wydłużenia starterów za pomocą automatycznych sekwenatorów, mimo że ich czułość jest nieco niższa. Dzięki zastosowaniu starterów znakowanych fluorescencyjnie można pominąć powtarzalną procedurę znakowania radioizotopowego, ponieważ startery fluorescencyjne są stabilne przez długi czas (w naszych doświadczeniach przez ponad rok).

Opisana tutaj metoda wykorzystuje zautomatyzowany sekwenator żelowy, jednak po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji do separacji i detekcji cDNA można użyć również sekwenatorów kapilarnych3. Równoległy charakter analizy żelowej umożliwia wykrycie nawet niewielkiej ilości rozszczepienia lub przetwarzania RNA. Kolejną zaletą jest wysoka rozdzielczość tej metody, która pozwala na wykrycie rozszczepienia lub przetwarzania terminalnego nawet jednej zasady.

W odniesieniu do wykrywania rozszczepienia lub procesowania RNA, zazwyczaj wyróżnia się dwa różne typy wydłużania starterów. W jednym przypadku obróbka enzymatyczna jest przeprowadzana in vitro z użyciem oczyszczonego RNA i oczyszczonego enzymu, natomiast w drugim procesowanie zachodzi in vivo, a następnie oczyszcza się otrzymane RNA. W obu przypadkach RNA poddawane jest wydłużaniu starterów przeprowadzanemu in vitro, jednak w zależności od źródła RNA, metodę tę nazywa się wydłużaniem starterów in vitro lub in vivo. W prezentowanym tutaj protokole skupiamy się wyłącznie na wydłużaniu starterów in vivo ze względu na łatwość zastosowania (brak konieczności użycia oczyszczonych białek) oraz możliwość jednoczesnego określenia punktów startu transkrypcji i procesowania. Niemniej jednak wydłużanie starterów in vitro jest w zasadzie organizowane w ten sam sposób, a niniejszy protokół może służyć jako punkt wyjścia.

Metoda przedstawiona w niniejszym materiale może być zastosowana do wielu gatunków bakterii, o ile umożliwiają one przygotowanie kwasów nukleinowych o wysokiej czystości i wysokiej wydajności.

Badania w naszym laboratorium koncentrują się na zakresie regulacyjnym systemów toksyna-antytoksyna (TA-)4,5, w których szeroko stosowana jest metoda przedłużania startera. Systemy TA- to niewielkie elementy genetyczne występujące w genomach prokariotycznych, składające się ze stabilnego i endogennie aktywnego białka toksycznego oraz zazwyczaj niestabilnego białka lub RNA antytoksyny, która przeciwdziała toksyczności6,7. Aktywność toksyny jest czasem wywierana poprzez hamowanie replikacji, syntezy ściany komórkowej lub inne mechanizmy, lecz najczęściej odbywa się to poprzez aktywność RNazy8,9. Zazwyczaj specyficzność RNazy określa się poprzez przeprowadzenie różnych testów, z których jednym jest metoda przedłużania startera. Reakcje przedłużania startera są dobrze dostosowane do tego zastosowania, ponieważ mieszaninę fragmentów przeciętych i pełnowymiarowych można analizować jednocześnie w celu wyznaczenia ich końców 5’. Dzięki zastosowaniu mieszanych analiz przedłużania startera in vitro oraz in vivo można określić specyficzne cięcie RNazy toksyny, np. specyficzność sekwencji10-13.

Schemat metody elongacji startera: izolacja RNA, odwrotna transkrypcja, sekwencjonowanie metodą Sangera, elektroforeza w żelu.
Rycina 1. Przegląd procedury elongacji startera. Hodowle bakteryjne są inkubowane i traktowane zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Z komórek ekstrahuje się całkowite RNA, które następnie traktuje się DNazą I w celu usunięcia śladów DNA i poddaje reakcji odwrotnej transkrypcji z użyciem specyficznych dla celu fluorescencyjnych starterów DNA, co prowadzi do otrzymania cDNA. DNA genomowe lub plazmidy są ekstrahowane i następnie wykorzystywane w fluorescencyjnych reakcjach sekwencjonowania metodą Sangera w celu porównania wielkości z fragmentami cDNA. Produkty elongacji startera są rozdzielane wraz z produktami sekwencjonowania metodą Sangera w denaturującym żelu poliakryloamidowym z mocznikiem i analizowane za pomocą zautomatyzowanego lasera i mikroskopu. Zasada sekwencjonowania, która pokrywa się z prążkiem cDNA, stanowi ostatnią zasadę 5’ końca cDNA (niebieska strzałka). Więcej informacji w Fekete, et al. 3 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przegląd całej procedury wydłużania startera przedstawiono na Rysunku 1. W skrócie: komórki bakteryjne są hodowane, zbierane, a następnie pellet komórkowy poddawany lizie w celu ekstrakcji RNA. Oczyszczone RNA traktuje się DNazą I, aby usunąć ślady cząsteczek DNA, które mogłyby służyć jako matryce dla odwrotnej transkryptazy. Do RNA dodaje się specyficzne fluorescencyjne startery, które hybrydyzują z regionem zainteresowania, a następnie podlegają odwrotnej transkrypcji, w wyniku czego powstaje jednoniciowe komplementarne DNA (cDNA). Drabina sekwencyjna jest tworzona metodą tradycyjnego sekwencjonowania Sangera z wykorzystaniem fluorescencyjnych starterów i rozdzielana na denaturującym żelu poliakrylamidowym wraz z fragmentami cDNA powstałymi w wyniku wydłużania startera. Uzyskany żel analizuje się poprzez porównanie prążków fluorescencyjnych, co pozwala na identyfikację interesujących końców 5’. Punkty rozpoczęcia transkrypcji oraz miejsca procesowania są następnie oceniane indywidualnie poprzez porównania sekwencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysokowydajne przygotowanie RNA

  1. Izolacja RNA
    UWAGA: Do reakcji wydłużania startera potrzebne są wysokie stężenia całkowitego RNA. Zestawy do kolumn wirowych zazwyczaj nie dają ilości RNA niezbędnej do przeprowadzenia procesu (~5 - 16 µg w objętości 5 µl). Dlatego zaleca się oczyszczanie metodą ekstrakcji kwasem guanidynianem tiocyjanianu-fenolem-chloroformem, opisaną poniżej.
    UWAGA: Fenol jest rakotwórczy, toksyczny i żrący. Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów i pracować pod dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony!
    1. Hodować lub traktować komórki bakteryjne (w tym przykładzie S. aureus lub E. coli) zgodnie z potrzebami i zebrać poprzez 10 min wirowania przy 4 600 × g i 4 °C. Uwaga: Zazwyczaj zbieramy całkowitą wartość OD600 rzędu 20 - 70. Osady komórkowe można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C.
    2. Resuspender osad komórkowy w 1 ml roztworu kwasu guanidynianu tiocyjanianu-fenolu-chloroformu i przenieść do probówki zakręcanej o pojemności 2 ml zawierającej 0,5 ml szklanych kulek cyrkonowych/krzemionkowych o średnicy 0,1 mm.
    3. Lizować komórki trzy razy w homogenizatorze kulkowym (fast prep/bead beater) przy 6,5 m/s przez 30 s w trzech cyklach, chłodząc próbki na lodzie przez 5 min po każdym przebiegu. Uwaga: Zhomogenizowaną próbkę można przechowywać w -80 °C przez kilka tygodni.
    4. Inkubować lizat przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie dodać 200 µl chloroformu.
    5. Energicznie wstrząsać lub wiroksować próbkę przez 30 s w celu ekstrakcji RNA.
    6. Inkubować w RT przez 3 min, a następnie wirować przez 15 min przy 13 000 - 15 000 × g i 4 °C. Uwaga: Rozpuszczalniki rozdzielają się na dolną fazę organiczną (różową, zawiera białka), interfazę (białą, zawiera DNA) i górną fazę wodną (przezroczystą, zawiera RNA).
      UWAGA: Od tego kroku należy używać wyłącznie odczynników i naczyń plastikowych wolnych od RNaz!
    7. Przygotować świeże, wolne od RNaz probówki reakcyjne o pojemności 1,5 ml, odpowiednio je opisać i dodać do każdej około 500 µl 100% izopropanolu wolnego od RNaz (użyć objętości zbliżonej do objętości fazy wodnej z poprzedniej probówki).
    8. Trzymać probówkę pod kątem i przenieść fazę wodną (około 500 µl) do przygotowanych probówek za pomocą końcówek wolnych od RNaz. Nie zakłócać interfazy.
    9. Wytrącić RNA, odwracając probówki kilka razy i inkubując przez 10 min w RT.
    10. Wirować próbki przez 15 min przy 13 000 - 15 000 × g i 4 °C i usunąć nadsącz za pomocą pipety lub aspiracji (pompa wodna i butelka zasilająca). Nie zakłócać białego, przezroczystego osadu RNA na dnie.
    11. Dodać 1 ml 70-80% etanolu wolnego od RNaz (nie wiroksować) w celu przemycia. Uwaga: RNA w etanolu można przechowywać przez kilka tygodni w -20 °C.
    12. Wirować przez 5 min przy 7 500 × g i 4 °C i usunąć nadsącz za pomocą pipety lub najlepiej aspiracji.
    13. Suszyć osad RNA na powietrzu przez 15 - 30 min pod dygestorium. Nie przesuszyć, w przeciwnym razie osady mogą być trudne do ponownego rozpuszczenia.
    14. Resuspender osad w 50 µl ddH2O wolnej od RNaz lub buforze do przechowywania RNA.
    15. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis lub kuwety kwarcowej (i konwencjonalnego fotometru), a następnie przystąpić do trawienia DNazą I.
  2. Trawienie RNA za pomocą DNazy I w celu usunięcia śladów DNA
    UWAGA: Ponieważ DNA może działać jako fałszywa matryca w reakcji odwrotnej transkrypcji (wydłużania startera), należy je usunąć z próbki. Dostępnych jest wiele metod usuwania DNA z roztworów RNA, które zazwyczaj opierają się na trawieniu DNazą. Poniżej opisano prostą, ale skuteczną i ekonomiczną metodę usuwania DNA.
    1. Podgrzać łaźnię wodną do 37 °C.
    2. Wymieszać związki wymienione w Tabeli 1 w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
    3. Inkubować mieszaninę przez 1 h w 37 °C w łaźni wodnej, a następnie przystąpić bezpośrednio do ekstrakcji fenolem/chloroformem. Uwaga: Inaktywacja termiczna DNazy I nie jest zalecana, ponieważ może to doprowadzić do degradacji RNA.
  3. Ekstrakcja RNA fenolem/chloroformem po trawieniu DNazą I
    UWAGA: RNA musi zostać oczyszczone w celu usunięcia wolnych nukleotydów, fragmentów DNA i komponentów buforu z trawienia DNazą I. Ekstrakcja fenolem/chloroformem pozwala na wysoką odzyskalność i stężenie próbki RNA, dlatego została opisana poniżej. Można stosować również inne metody oczyszczania RNA, o ile spełniają one te wymagania.
    1. Podzielić 500 µl mieszaniny po trawieniu DNazą I na dwie próbki po 250 µl w probówkach reakcyjnych o pojemności 2 ml.
    2. Dodać 1 objętość (250 µl) kwaśnego roztworu P/C/I (fenolu nasyconego wodą, chloroformu i izopentanolu w stosunku 25:24:1, pH 4,5 - 5).
      UWAGA: Roztwór P/C/I jest rakotwórczy, toksyczny i żrący. Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów i pracować pod dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony!
    3. Energicznie wiroksować lub umieścić na platformie do wiroksowania przez 1 - 3 min.
    4. Wirować przez 30 min przy 13 000 - 15 000 × g i 4 °C.
    5. Zebrać górną fazę (wodną) i przenieść do nowej probówki (250 µl).
    6. Dodać 1/9 objętości (28 µl) 3 M octanu sodu pH 5,2.
    7. Dodać 2,5-3 objętości czystego etanolu (700 µl).
    8. Wymieszać krótko w wiroksatorze i pozostawić w -80 °C na 30 min lub w -20 °C na 2 - 3 h. W razie potrzeby przechowywać RNA przez noc (O/N) w -20 °C.
    9. Wirować przez 30 - 60 min przy 13 000 - 15 000 × g i 4 °C.
    10. Usunąć nadsącz za pomocą pipety lub aspiracji.
    11. Przemyć osad, dodając 1 ml 70% etanolu na osad. Nie wiroksować próbki.
    12. Wirować próbkę przez 5 min przy 13 000 - 15 000 × g i 4 °C.
    13. Usunąć nadsącz za pomocą pipety lub aspiracji.
    14. Suszyć osad na powietrzu pod dygestorium. W razie potrzeby przechowywać osad w -20 °C przez noc (O/N).
    15. Rozpuścić osad w 30 µl H2O traktowanej DEPC poprzez wiroksowanie przez 2 min i użyć tego roztworu do rozpuszczenia osadu z odpowiadającej mu drugiej probówki na próbkę (30 µl roztworu na jedną parę ekstrakcji).
    16. Zmierzyć stężenie RNA i upewnić się, że przekracza ono 1 µg/µl w celu zastosowania w wydłużaniu startera dla mRNA o średniej ekspresji.
    17. W razie potrzeby przechowywać RNA w -20 °C przez kilka tygodni do kilku miesięcy.

2. Reakcja wydłużania startera

  1. Projektowanie starterów
    UWAGA: Projektując startery do eksperymentu z wydłużaniem startera, należy przestrzegać ogólnych wytycznych dotyczących projektowania starterów do PCR (więcej informacji znajduje się w instrukcji dołączonej do automatycznego sekwenatora żelowego oraz w sekcji dyskusji w niniejszej pracy).
    1. W szczególności należy upewnić się, że startery (i) nie zawierają powtórzeń tych samych zasad, (ii) posiadają G lub C na końcu 3’, (iii) mają zrównoważony stosunek GC:AT, (iv) mają temperaturę przyłączania około 55 - 60 °C oraz (v) wiążą się co najmniej 50 bp, a najlepiej 100 bp w kierunku 3' od regionu zainteresowania, aby uzyskać wyraźne obrazy.
  2. Reakcja wydłużania startera
    UWAGA: Reakcja wydłużania startera (synteza cDNA) wymaga dużych ilości matrycowego RNA. Jeśli użyte ilości RNA będą zbyt niskie, sygnał może być zbyt słaby, aby go wykryć! Dlatego zalecamy puryfikację RNA zgodnie z powyższym opisem.
    UWAGA: OSTROŻNIE: Należy używać odczynników i naczyń plastikowych wolnych od RNaz!!!
    1. Rozgrzej termocykler do temperatury 95 °C i przeprowadź wszystkie kolejne etapy inkubacji w termocyklerze w celu ułatwienia pracy i zapewnienia powtarzalności.
    2. Wymieszaj składniki z Tabeli 2 w probówce do PCR dla każdej próbki RNA.
    3. Denaturuj próbki przez 1 min w temperaturze 95 °C.
    4. Umieść probówki na lodzie i chłodź przez 5 min, aby umożliwić hybrydyzację RNA i starterów.
    5. Ustaw termocykler na 47 °C.
    6. W międzyczasie przygotuj master mix do odwrotnej transkrypcji, zgodnie z opisem w Tabeli 3.
    7. Dodaj 4 µl master mixu do odwrotnej transkrypcji do każdej zhybrydyzowanej próbki RNA.
    8. Inkubuj probówki przez 1 hr w temperaturze 47 °C. Uwaga: Optymalna temperatura dla AMV RT to 42 °C, jednak wyższe temperatury pomagają przezwyciężyć struktury drugorzędowe cząsteczek RNA.
    9. Zatrzymaj reakcję, podgrzewając próbki do 95 °C przez 2 min.
      UWAGA: Formamid jest żrący, toksyczny i może być szkodliwy dla płodu. Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki materiałów, ostrożne obchodzenie się z odczynnikiem i stosowanie odpowiedniej ochrony!
    10. Dodaj 6 µl barwnika do nakładania z formamidem (95% (v/v) dejonizowany formamid, 10 mM EDTA, 0.05% (w/v) błękit bromofenolowy) i przechowuj przez noc (O/N) do dwóch tygodni w temperaturze -20 °C w ciemności.

3. Przygotowanie drabinki sekwencyjnej

UWAGA: Reakcja drabinki sekwencyjnej wymaga albo umiarkowanych ilości plazmidów, albo dużych ilości DNA genomicznego. W miarę możliwości zaleca się stosowanie plazmidów w reakcji sekwencjonowania ze względu na łatwość izolacji i wysoką intensywność sygnału. W innych przypadkach rutynowo stosujemy metodę zaadaptowaną od Marmura5,14 do przygotowania DNA genomicznego z komórek E. coli i S. aureus bez konieczności użycia fenolu. W zasadzie można zastosować każdą metodę, która pozwala na uzyskanie wysokiej ilości i czystości DNA genomicznego.

  1. Izolacja DNA genomowego
    1. Hodować 10 ml komórek E. coli lub S. aureus przez noc w pożywce LB, BM5 lub TSB.
    2. Zebrać komórki poprzez wirowanie przez 10 min przy 4,600 × g w probówce typu Falcon 15 ml.
    3. Resuspender osad w 2 ml buforu P1, stosowanego w niektórych zestawach do mini-preparacji (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A).
    4. Lizować komórki przez 45 - 60 min z dodatkiem 20 - 40 µl lizostafiny (0.5 mg/ml, przechowywać w -20 °C). Uwaga: W przypadku komórek E. coli wstępną obróbkę enzymatyczną można pominąć lub zastosować lizozym.
    5. Dodać 100 µl nasyconego roztworu SDS (w 45% etanolu) do zawiesiny i inkubować przez 5 min w 37 °C.
    6. Dodać 650 µl 5 M NaClO4 i krótko wymieszać komórki na wortexie.
      UWAGA: Chloroform jest potencjalnym kancerogenem. Należy zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów i używać go pod dygestorium z odpowiednią ochroną!!!
    7. Dodać 3 ml mieszaniny chloroform/izopentanol (w stosunku 24:1) do mieszaniny i wstrząsać przez co najmniej 60 sek. Uwaga: Ciecz powinna przekształcić się w jednorodną białą emulsję.
    8. Wirować próbkę przez 10 min przy 4,600 × g w temperaturze pokojowej (RT), aby rozdzielić fazy.
    9. Ostrożnie przenieść klarowną górną fazę (wodną) do nowej probówki. Jeśli roztwór jest mętny, powtórzyć ekstrakcję chloroformem/izopentanolem. Zmierzyć objętość roztworu DNA i przygotować nową probówkę z dwiema objętościami etanolu (100%).
    10. Powoli zlać lub pipetować roztwór DNA do probówki zawierającej etanol. Uwaga: DNA powinno wytrącić się w postaci przezroczystych, gęstych splotów na dnie lub, po całkowitym odwodnieniu, jako pływająca biała grudka.
    11. Odzyskać DNA za pomocą haczyków wykonanych z szklanych pipet Pasteura (Rycina 2) i przemyć każdą próbkę dwukrotnie, zanurzając ją w osobnej probówce zawierającej 1 ml 70% etanolu.
    12. Umieścić haczyki pionowo w statywie i suszyć osad na powietrzu przez 60 min. W razie potrzeby przechowywać wysuszone DNA przez kilka dni w temperaturze pokojowej (RT).
    13. Rozpuścić DNA, odłamując szklane haczyki pokryte DNA i umieszczając je w probówce reakcyjnej 2.0 ml zawierającej 100 - 500 µl ddH2O. Dostosować objętość do końcowego stężenia DNA wynoszącego 1,000 - 1,500 ng/µl. Do jednej reakcji sekwencjonowania należy użyć 10 - 18 µg DNA genomowego.

Schemat próby płomieniowej do identyfikacji jonów metali, przedstawiający zmiany barwy płomienia po wprowadzeniu próbki.
Rysunek 2. Instrukcja wykonania „wędki” do wyławiania DNA. Należy umieścić końcówkę szklanej pipety Pasteura w płomieniu palnika Bunsena. Po kilku sekundach szkło zacznie się topić, tworząc na końcu mały haczyk. Należy szybko usunąć pipetę z płomienia i pozostawić do ostygnięcia na 1 min.

  1. Izolacja plazmidów
    1. Przygotować plazmidy przy użyciu standardowych zestawów do mini-preparacji i rozpuścić w buforze elucyjnym (10 mM Tris-Cl, pH 8.5). W zależności od wielkości plazmidu, użyć 100 - 500 ng plazmidu na jedną drabinę sekwencjonowania.
  2. Reakcja sekwencjonowania metodą Sangera
    UWAGA: Poniżej znajduje się prosty protokół z wykorzystaniem zestawu do sekwencjonowania z primerem znakowanym fluorescencyjnie i 7-deaza-dGTP, który sprawdza się w celu wydłużania primerów. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji zestawu do sekwencjonowania. Należy pamiętać, że w reakcji sekwencjonowania musi zostać użyty ten sam primer, co w reakcji wydłużania primera, aby uzyskać produkty o tej samej długości.
    1. Wymieszać 12 µl DNA genomicznego (~10 - 15 µg) z 1 µl DMSO i 1 µl primera znakowanego fluorescencyjnie (2 pmol/µl).
    2. Do każdego 1 µl z czterech mieszanin do reakcji sekwencjonowania (A, C, G lub T) dodać 3 µl mieszaniny DNA/DMSO/Primer.
    3. Umieścić próbki w termocyklerze i przeprowadzić następujący program PCR: 95 °C przez 2 min; 35 cykli: 95 °C przez 20 sec, 54 °C przez 20 sec, 70°C przez 30 sec; przechowywać w 4 °C do czasu analizy.
    4. Po zakończeniu programu wyjąć próbki z urządzenia, dodać 6 µl barwnika do nakładania i przechowywać na lodzie (krótkoterminowo) lub w -20 °C przez kilka dni lub tygodni.

4. Przygotowanie żelu i uruchomienie aparatury

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat montażu aparatury do żelu sekwencyjnego, przygotowania żelu oraz sposobu prowadzenia elektroforezy znajdują się w protokole producenta.

  1. Przygotowania
    1. Przygotować 10x TBE zgodnie z instrukcją w Tabeli 4.
    2. W dniu prowadzenia elektroforezy przygotować 1 L buforu 1x TBE z ultrapure ddH2O.
    3. Przygotować 10% (w/v) APS. Uwaga: można przechowywać w alikwotach 200 µl w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy, jednak z czasem aktywność może spaść.
  2. Montaż komory do odlewania żelu
    1. Należy unikać obecności kurzu i kłaczków między płytkami szklanymi. W tym celu dokładnie oczyścić powierzchnie robocze za pomocą wilgotnych chusteczek.
    2. Oczyścić parę szklanych płytek o długości 25 cm z obu stron, używając jednorazowych ręczników papierowych i wody destylowanej, a następnie przemyć wewnętrzną stronę płytek izopropanolem.
    3. Umieścić dystanse 0,25 mm na tylnej płytce szklanej i nałożyć na nią płytkę szklaną z wycięciem (Rysunek 3).
    4. Przymocować prowadnice żelu do obu stron płytek szklanych tak, aby koniec z wycięciem i otwory prowadzące prowadnicy były skierowane do góry, a następnie lekko dokręcić pokrętła.

Schemat elektroforezy żelowej; płytki szklane, odstępnik żelowy; metoda rozdziału DNA.
Rysunek 3. Widok rozstrzelony szklanych płytek do elektroforezy żelowej. Płytek szklanych należy używać w określonym kierunku. Należy zadbać o to, aby wewnętrzna strona płytek szklanych była skierowana do wewnątrz, a zewnętrzna na zewnątrz.

Schemat układu do elektroforezy; elementy do odlewania żelu; płytki szklane, płytka odlewnicza, prowadnice żelu.
Rycina 4. Widok złożonego aparatu do żelowania. Po wstrzyknięciu roztworu żelu, pomiędzy płytki szklane w roztwór umieszcza się dystansy do studzienek. Następnie płytkę odlewniczą wsuwa się pomiędzy przednią płytkę szklaną a prowadnice żelu i mocuje poprzez dokręcenie pokręteł prowadnic.

  1. Odlewanie żelu
    UWAGA: niepolimeryzowany akrylamid jest neurotoksyczny! Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki materiałów i stosowanie odpowiednich środków ochrony!!!
    1. Dodać związki wymienione w Tabeli 5 do zlewki i wymieszać za pomocą magnesu i mieszadła magnetycznego.
    2. Niezwłocznie po dodaniu APS i TEMED, pobrać roztwór żelu do strzykawki 50 ml i założyć filtr 0,45 nm na końcówkę.
    3. Przytrzymać górną krawędź szklanej płytki jedną ręką lub umieścić zestaw w statywie do odlewania żelu, aby stworzyć nachylenie pod kątem 10 - 20°.
    4. Powoli dozować roztwór żelu pomiędzy szklane płytki, stale przesuwając końcówkę strzykawki z jednej strony na drugą i przestać, gdy roztwór żelu dotrze do dolnej krawędzi.
    5. Przesunąć na bok lub całkowicie usunąć wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza za pomocą haczyka do pęcherzyków.
    6. Wsunąć dystans do kieszonki żelu (0,25 mm) pomiędzy szklane płytki od strony wcięcia, zanurzyć w roztworze żelu i utrwalić, mocując płytkę odlewniczą.
    7. Lekko dokręcić śruby górnej szyny (patrz Rycina 4 w celu zobaczenia w pełni zmontowanego urządzenia).
    8. Pozostawić żel do zastygnięcia na 1 - 2 h.
    9. Zdjąć płytkę odlewniczą oraz dystans do kieszonki i oczyścić kieszonkę z resztek soli i żelu.
    10. Przepłukać ddH2O i otrzeć nadmiar roztworu papierowym ręcznikiem.
  2. Elektroforeza i wizualizacja żelu
    UWAGA: żele sekwencyjne poddawane są bezpośrednio elektroforezie w obrazowniku żeli, podczas gdy fluorescencja jest jednocześnie wykrywana przez mikroskop laserowy. W przeciwieństwie do konwencjonalnej elektroforezy żelowej, gdzie żel jest najpierw prowadzony, a następnie barwiony i wizualizowany, jednostka detekcyjna jest stała i skanuje prążki w czasie rzeczywistym, gdy przechodzą one przez laser. Poniżej przedstawiono procedurę dla oprogramowania do zbierania danych ImagIR w systemie OS/2, którą można zaadaptować do nowszych wersji. Więcej informacji znajduje się w instrukcji obsługi.
    1. Wsunąć uchwyt zbiornika buforu w szyny żelu na przednich szklanych płytkach i dokręcić pokrętła.
    2. Umieścić żel w dolnym zbiorniku żelowym zautomatyzowanego obrazownika żeli przy płycie grzewczej i utrwalić, wsuwając prowadnicę wejściową szyny w uchwyty urządzenia.
    3. Napełnić dolną i górną komorę buforową żelu buforem 1x TBE, zamknąć dolną komorę buforową i podłączyć górną komorę buforową do zasilania za pomocą przewodu zasilającego.
    4. Jeśli występują, oczyścić kieszonkę żelu z resztek soli poprzez wielokrotne pipetowanie buforu do kieszonki.
    5. Zamknąć górną komorę zbiornika buforu za pomocą górnej pokrywy buforu.
    6. Zamknąć drzwi urządzenia, włączyć obrazownik oraz komputer i uruchomić podstawowe oprogramowanie do zbierania danych ImagIR.
    7. Utworzyć nowy plik projektu (Plik->Nowy…), wprowadzić nazwę pliku projektu, wybrać odpowiednie zakresy laserów (700 lub 800 nm) i zatwierdzić przyciskiem OK.
    8. Wybrać Opcje->Auto gain… z menu obrazu na górze, kliknąć Auto, aby rozpocząć pomiar automatycznego wzmocnienia, i zaakceptować ustawienia klikając OK.
    9. Ustawić ostrość lasera, wybierając Opcje->Focus… z menu sterowania skanerem, klikając przycisk Auto i akceptując ustawienia przyciskiem OK.
    10. Powtórzyć procedurę automatycznego wzmocnienia, aby dostosować ją do nowo ustawionego obszaru ostrości.
    11. Skonfigurować sterowanie skanerem zgodnie z następującymi ustawieniami: 2 000 V, 35 mA, 45 W, 45 °C, Filtr skanowania: 3, Prędkość skanowania: 3.
    12. Przeprowadzić wstępny bieg pustego żelu przez 20 min (wybrać napięcie ON i nacisnąć ).
    13. W międzyczasie podgrzać drabinę sekwencyjną i produkty przedłużania starterów w termocyklerze PCR przez 2 min do 90 °C, a następnie schłodzić na lodzie.
    14. Zatrzymać elektroforezę, otworzyć zautomatyzowany sekwenator żelowy i zdjąć górną pokrywę zbiornika buforu.
    15. Wsunąć grzebień „rekini ząb” pomiędzy szklane płytki i lekko przebić żel zębami grzebienia (patrz Rycina 5).

Schemat układu elektroforezy żelowej; analiza przedłużania starterów; grzebień o zębach w kształcie rekina, granica żel/bufor.
Rysunek 5. Zbliżenie żelu z grzebieniem o zębach w kształcie rekina. Próbkę (kolor fioletowy) nanosi się pomiędzy zęby grzebienia.

  1. Do każdego otworu żelu (uformowanego przez zęby rekina) pipetujemy 1 - 2 µl produktów elongacji starterów lub reakcji drabinki sekwencyjnej.
  2. Jeśli nie wszystkie otwory są potrzebne, należy wypełnić puste otwory barwnikiem do ładowania, aby zapobiec nierównomiernemu przebiegu elektroforezy.
  3. Zamykamy zbiornik z buforem oraz drzwiczki sekwenصera żelowego.
  4. Uruchamiamy elektroforezę i włączamy laser (wybieramy Voltage ON oraz Laser ON, a następnie naciskamy ).
  5. Zatrzymujemy elektroforezę, gdy obszar zainteresowania przejdzie przez laser.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak przedstawiono na Rysunku 6, reakcję wydłużania startera można wykorzystać do określenia punktów startu transkrypcji interesujących transkryptów, co może pomóc w wywnioskowaniu regionów promotorowych (zazwyczaj identyfikowanych przez elementy -10 i -35). Najwyższy (najdłuższy) fragment cDNA reprezentuje koniec 5’ mRNA, a zatem może zostać łatwo zmapowany w porównaniu z drabiną sekwencyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wydłużenie startera fluorescencyjnego jest prostą i szybką metodą określania końców 5' RNA, zarówno w celu identyfikacji przetwarzania TSP, jak i wtórnego przetwarzania RNA. Dzięki zastosowaniu starterów fluorescencyjnych, reakcje mogą być zapoczątkowane i przebiegać bez dodatkowych środków ostrożności (w przeciwieństwie do starterów znakowanych radioaktywnie). Ponieważ próbki są wykrywane za pomocą fluorescencji, można je obrazować w trakcie elektroforezy, co pozwala na szybką analizę w porównaniu z metodami radioaktywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia, co mogłoby stanowić konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Anne Wochele za jej pomoc w laboratorium i Verze Augsburger za pomoc z automatycznym sekwencerem żelowym. Dziękujemy Deutsche Forschungsgemeinschaft za dofinansowanie w formie dotacji BE4038/2 i BE4038/5 w ramach "programów priorytetowych" SPP1316 i SPP1617.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odwrotna transkryptaza AMV (20-25 U/&mikro; l)NEB / RocheNEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (bez RNazy)Ambion (technologie życia)Instrument AM2222
FastPrep-24 MPBio116004500
Podkłady znakowane fluorescencyjnieBiomeryn/a5' Modyfikacja DY-681 " zwyczajny" Oligonukleotydy DNA. Kompatybilne barwniki, takie jak LICOR IRDye 700/800, są również dostępne u innych dostawców, takich jak IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer wraz z oprogramowaniem do zbierania danych ImagIRLi-CorProdukt wycofany
NanoDrop 2000Thermo Scientific
Woda wolna od nukleazAmbion (technologie życia)AM9915G
Zestaw do przygotowania plazmidumini QIAGEN12125
RapidGel-XL-40% KoncentratUSBUS75863
BFOR PAMIĘCI RNAAmbion (life technologies)AM7000
Roti-Aqua-P/C/ICarl RothX985.3Alternatywa: " Kwas-fenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)" od Ambion (AM9720)
SUPERase• In RNase InhibitorAmbion (life technologies)AM2696
Thermo Sequenase znakowany fluorescencyjnie zestaw do sekwencjonowania cyklu startera z 7-deaza-dGTPGE HealthcareRPN2538
TRIzol reagentlife technologies15596-026
Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe 0,1 mmBioSpec11079101z

Bibliografia

  1. Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
  2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
  3. Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
  4. Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
  5. Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
  6. Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
  7. Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
  8. Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
  9. Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
  10. Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
  11. Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
  12. Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
  13. Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
  14. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
  15. Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
  16. Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
  17. Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
  18. Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
  19. Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Miejsca ci cia RNAodwrotna transkrypcjaprimery fluorescencyjnedenaturuj cy el poliakrylamidowydrabinka do sekwencjonowania metod Sangeraautomatyczny sekwenator elowyizolacja bakteryjnego RNAsystemy toksyna antytoksyna

Powiązane artykuły