Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metodę rozszerzania startera opartą na fluorescencji, aby określić punkty początkowe transkrypcji na podstawie bakteryjnych transkryptów i przetwarzania RNA in vivo za pomocą automatycznego sekwenatora żelowego.

Streszczenie

Rozszerzenie startera oparte na fluorescencji (FPE) to metoda molekularna do określania punktów początkowych transkrypcji lub miejsc przetwarzania cząsteczek RNA. Osiąga się to poprzez odwrotną transkrypcję interesującego RNA przy użyciu specyficznych starterów znakowanych fluorescencyjnie, a następnie analizę powstałych fragmentów cDNA poprzez denaturację elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Jednocześnie na żelu przeprowadzana jest tradycyjna reakcja sekwencjonowania Sangera w celu zmapowania końców fragmentów cDNA na ich dokładne odpowiadające im zasady. W przeciwieństwie do 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), gdzie produkt musi zostać sklonowany, a wielu kandydatów zsekwencjonowanych, większość fragmentów cDNA generowanych przez wydłużenie startera może być jednocześnie wykryta w jednym przebiegu żelu. Ponadto cała procedura (od odwrotnej transkrypcji do końcowej analizy wyników) może zostać zrealizowana w ciągu jednego dnia roboczego. Dzięki zastosowaniu starterów znakowanych fluorescencyjnie można uniknąć stosowania niebezpiecznych odczynników znakowanych izotopami promieniotwórczymi, a czas przetwarzania jest skrócony, ponieważ produkty mogą być wykrywane podczas procedury elektroforezy.

W poniższym protokole opisujemy metodę rozszerzania startera fluorescencyjnego in vivo, aby niezawodnie i szybko wykryć końcówki 5' RNA, aby wydedukować punkty początkowe transkrypcji i miejsca przetwarzania RNA (np. przez składniki systemu toksyna-antytoksyna) w S. aureus, E. coli i innych bakteriach.

Wprowadzenie

Rozszerzenie¹ startera to metoda molekularna do określania końców 5' określonych cząsteczek RNA do rozdzielczości jednej zasady. Zaletą w stosunku do innych metod, takich jak 5'-RACE (szybka amplifikacja końców cDNA), jest szybki czas realizacji i możliwość łatwej analizy mieszaniny cząsteczek RNA o różnych długościach.

Ta metoda polega na poddaniu cząsteczek RNA reakcjom odwrotnej transkrypcji przy użyciu specyficznych starterów fluorescencyjnych, generując fragmenty cDNA o określonej długości. Te cząsteczki cDNA są prowadzone wraz z tradycyjnymi reakcjami sekwencjonowania Sangera² na denaturujących żelach poliakrylamidowych i mogą być wykrywane przez ich fluorescencję dzięki zastosowaniu fluorescencyjnie znakowanych starterów. Długości fragmentów cDNA są następnie oceniane przez porównanie z drabinką sekwencjonowania, co pozwala na mapowanie końców 5' RNA.

Tradycyjnie, reakcje przedłużania starterów są używane w połączeniu z radioaktywnymi izotopami do wykrywania cząsteczek cDNA na kliszach rentgenowskich. Ze względu na zagrożenia dla zdrowia, problemy z utylizacją odpadów i łatwość obsługi, nowsze protokoły wykorzystują fluorescencję do wykrywania rozszerzenia startera za pomocą automatycznych sekwencerów, chociaż ich czułość jest nieco niższa. Stosując startery znakowane fluorescencyjnie, można pominąć powtarzającą się procedurę znakowania radioaktywnego, ponieważ startery fluorescencyjne są stabilne przez długi czas (ponad rok w naszych rękach).

Metoda, którą tutaj opisujemy, wykorzystuje zautomatyzowany sekwenator żelowy, ale z niewielkimi modyfikacjami, sekwencery kapilarne mogą być również używane do separacji i wykrywania cDNA³. Równoległy charakter analizy żelu umożliwia wykrycie nawet niewielkiej ilości rozszczepienia lub przetwarzania RNA. Kolejną zaletą jest wysoka rozdzielczość tej metody, ponieważ można wykryć końcowe rozszczepienie lub przetwarzanie nawet jednej zasady.

Jeśli chodzi o wykrywanie rozszczepienia lub przetwarzania RNA, zazwyczaj rozróżnia się dwa różne typy przedłużeń startera. W jednym przypadku obróbka enzymatyczna odbywa się in vitro przy użyciu oczyszczonego RNA i oczyszczonego enzymu, podczas gdy w drugim przypadku przetwarzanie odbywa się in vivo, a uzyskane RNA jest oczyszczane. W obu przypadkach RNA poddaje się przedłużeniu startera przeprowadzanemu in vitro, jednak w zależności od źródła RNA metoda ta nazywana jest przedłużeniem startera in vitro lub in vivo. W prezentowanym przez nas protokole skupiamy się wyłącznie na rozszerzeniu startera in vivo, ze względu na łatwość użycia (brak konieczności stosowania oczyszczonych białek) oraz możliwość wyznaczenia punktów startowych transkrypcji i przetwarzania w tym samym czasie. Jednak przedłużanie starterów in vitro jest zasadniczo konfigurowane w ten sam sposób, a ten protokół może służyć jako punkt wyjścia.

Przedstawiona tutaj metoda może być stosowana do wielu gatunków bakterii, o ile są one podatne na przygotowanie kwasów nukleinowych o wysokiej czystości i wysokiej wydajności.

Badania w naszym laboratorium koncentrują się na zakresie regulacyjnym systemów toksyna-antytoksyna (TA-)^4,5, dziedzinie, w której metoda przedłużania startera jest szeroko stosowana. Systemy TA to małe elementy genetyczne obecne w genomach prokariotycznych, które składają się ze stabilnego i endogennie aktywnego białka toksycznego oraz przeważnie niestabilnego białka lub antytoksyny RNA, która przeciwdziała toksyczności^6,7. Aktywność toksyny jest czasami wywierana przez hamowanie replikacji, syntezę ściany komórkowej lub inne mechanizmy, ale najczęściej przez aktywność RNazy^8,9. Zazwyczaj swoistość RNazy określa się przez przeprowadzenie różnych testów, z których jednym jest metoda wydłużania startera. Reakcje przedłużania podkładu dobrze nadają się do tego zastosowania, ponieważ mieszanina rozszczepionych i pełnych fragmentów może być jednocześnie analizowana w celu określenia ich końców 5'. Stosując mieszankę rozszerzeń starterów in vitro i in vivo, można określić specyficzne rozszczepienie RNazy toksyny, np. swoistość sekwencji,^10-13.

Rysunek 1. Przegląd procedury przedłużania podkładu. Kultury bakteryjne są inkubowane i poddawane obróbce zgodnie z potrzebami doświadczalnymi. Całkowite RNA jest ekstrahowane z komórek, traktowane DNazą I w celu usunięcia śladów DNA i poddawane reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu specyficznych dla celu fluorescencyjnych starterów DNA, w wyniku których powstaje cDNA. Genomowe DNA lub plazmidy są ekstrahowane, a następnie wykorzystywane do fluorescencyjnych reakcji sekwencjonowania Sangera w celu porównania wielkości z fragmentami cDNA. Produkty do przedłużania podkładu są uruchamiane wraz z produktami sekwencjonowania Sanger na denaturującym żelu poliakrylamidowym mocznika i analizowane za pomocą zautomatyzowanego lasera i mikroskopu. Baza sekwencjonowania, która ustawia się w jednej linii z pasmem cDNA, jest ostatnią zasadą końca cDNA 5' (niebieska strzałka). Więcej informacji w Fekete, et al. ³ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przegląd całej procedury rozbudowy podkładu można znaleźć na rysunku 1. Krótko mówiąc, komórki bakteryjne są hodowane, zbierane, osad komórkowy poddawany lizie i ekstrahowany RNA. Oczyszczone RNA jest następnie traktowane DNazą I w celu usunięcia śladów cząsteczek DNA, które mogą działać jako matryce dla odwrotnej transkryptazy. Specyficzne startery fluorescencyjne są dodawane do RNA, hybrydyzowane z regionem zainteresowania, a następnie transkrybowane wstecznie, w wyniku czego powstaje jednoniciowy komplementarny DNA (cDNA). Drabina sekwencjonowania jest tworzona przez tradycyjne sekwencjonowanie Sangera z wykorzystaniem starterów fluorescencyjnych i rozdzielane na denaturującym żelu poliakrylamidowym wraz z fragmentami cDNA wydłużającymi starter. Otrzymany żel jest analizowany poprzez porównanie pasm fluorescencyjnych, co pozwala na identyfikację interesujących końców 5'. Punkty początkowe transkrypcji i miejsca przetwarzania są następnie oceniane indywidualnie poprzez porównania sekwencji.

Protokół

1. Preparat RNA o wysokiej wydajności

1. Izolacja RNA
   UWAGA: Do reakcji przedłużania startera potrzebne są wysokie stężenia całkowitego RNA. Zestawy kolumn wirowych zwykle nie dają potrzebnej ilości RNA (~5 - 16 μg w objętości 5 μl). Dlatego zaleca się oczyszczanie przy użyciu metody ekstrakcji kwasem tiocyjanian-fenol-chloroform guanidyny, opisanej poniżej.
   UWAGA: Fenol jest rakotwórczy, toksyczny i. Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki i stosowanie pod wyciągiem z zachowaniem odpowiedniej ochrony!
   1. Hoduj lub traktuj komórki bakteryjne (w tym przykładzie S. aureus lub E. coli) zgodnie z życzeniem i zbieraj przez 10-minutowe wirowanie w temperaturze 4 600 × g i 4 °C. Uwaga: Zazwyczaj zbieramy łącznie₆₀₀ OD od 20 do 70. Granulki komórkowe można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C.
   2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml kwaśnego roztworu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu i przenieść do kubka z zakrętką o pojemności 2 ml zawierającego 0,5 ml kulek szklanych cyrkonowo-krzemionkowych o średnicy 0,1 mm.
   3. Poddać komórki trzykrotnej lizie w szybkim ubijaku do przygotowywania/perałkowania z prędkością 6,5 m/s przez 30 sekund przez trzy rundy, schładzając próbki na lodzie przez 5 minut po każdym przebiegu. Uwaga: Zhomogenizowana próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.
   4. Inkubować lizat przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 200 μl chloroformu.
   5. Energicznie wstrząsaj lub wiruj próbkę przez 30 sekund, aby wyekstrahować RNA.
   6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie wirować przez 15 minut w temperaturze 13 000-15 000 × g i temperaturze 4 °C. Uwaga: Rozpuszczalniki rozdziela się na dolną fazę organiczną (różowa, zawiera białka), fazę interfazową (białą, zawiera DNA) i górną fazę wodną (klarowną, zawiera RNA).
      UWAGA: Od tego kroku używaj tylko odczynników wolnych od RNaz i wyrobów plastikowych!
   7. Przygotować świeże probówki reakcyjne o pojemności 1,5 ml wolne od RNaz, odpowiednio oznaczyć i dodać około 500 μl izopropanolu 100% wolnego od RNaz każda (użyć w przybliżeniu tej samej objętości, co faza wodna w poprzedniej probówce).
   8. Trzymaj probówkę pod kątem i przenieś fazę wodną (około 500 μl) do przygotowanych probówek za pomocą końcówek wolnych od RNazy. Nie zakłócaj interfazy.
   9. Wytrącić RNA, kilkakrotnie odwracając i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   10. Odwirować próbki przez 15 minut w temperaturze 13 000–15 000 × g i temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację (pompa strumieniowa wody i butelka do karmienia). Nie naruszaj białej, przezroczystej osadki RNA na dnie.
   11. Dodaj 1 ml 70-80% etanolu wolnego od RNaz (nie wirować) do umycia. Uwaga: RNA w etanolu może być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C.
   12. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 × g i temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant przez pipetowanie lub najlepiej aspirację.
   13. Suchy na powietrzu granulat RNA przez 15 - 30 minut pod wyciągiem. Nie przesuszaj, w przeciwnym razie granulki mogą być trudne do ponownego rozpuszczenia.
   14. Zawiesić osad w 50 μl wolnego od RNaz bufora do przechowywania ddH₂O lub RNA.
   15. Zmierz stężenie RNA za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis lub kuwety kwarcowej (i konwencjonalnego fotometru) i przejdź do mineralizacji DNazy I.
2. Trawienie RNA przez DNazę I w celu usunięcia śladów DNA
   UWAGA: Ponieważ DNA może działać jako fałszywy szablon w reakcji odwrotnej transkrypcji (wydłużenia startera), należy go usunąć z próbki. Dostępne są różne metody usuwania DNA z roztworów RNA, które zwykle opierają się na trawieniu DNazy. Prosta, ale skuteczna i opłacalna metoda usuwania DNA została opisana poniżej.
   1. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C.
   2. Zmieszać związki wymienione w tabeli 1 w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
   3. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a następnie przejść bezpośrednio do ekstrakcji fenol/chloroform. Uwaga: Inaktywacja termiczna DNazy I nie jest zalecana, ponieważ może to spowodować degradację RNA.
3. Ekstrakcja fenolu/chloroformu RNA po trawieniu DNazą I
   UWAGA: RNA musi zostać oczyszczone w celu usunięcia wolnych nukleotydów, fragmentów DNA i składników buforowych z trawienia DNazy I. Ekstrakcja fenolu/chloroformu pozwala na wysoki odzysk i koncentrację próbki RNA, dlatego została opisana poniżej. Można również zastosować inne metody oczyszczania RNA, jeśli spełniają one te wymagania.
   1. Podzielić 500 μl mieszanki mineralizacyjnej DNazy I na dwie próbki o objętości 250 μl w probówkach reakcyjnych o pojemności 2 ml.
   2. Dodać 1 objętość (250 μl) kwaśnego roztworu P/C/I (w nasyconym wodą fenolu, chloroformie i izopentanolu, w stosunku 25:24:1, pH 4,5 - 5).
      Uwaga: Roztwór P/C/I jest rakotwórczy, toksyczny i. Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki i stosowanie pod wyciągiem z zachowaniem odpowiedniej ochrony!
   3. Energicznie wiruj lub umieść na platformie wirowej na 1 - 3 minuty.
   4. Wirować przez 30 minut w temperaturze 13 000 - 15 000 × g i temperaturze 4 °C.
   5. Zebrać górną (wodną) fazę i przenieść do świeżej probówki (250 μl).
   6. Dodać 1/9 objętości (28 μl) 3 M octanu sodu o pH 5,2.
   7. Dodać 2,5-3 objętości czystego etanolu (700 μl).
   8. Wymieszać przez krótkie wirowanie i umieścić w temperaturze -80 °C na 30 minut lub w temperaturze -20 °C na 2 - 3 godziny. W razie potrzeby przechowywać RNA O/N w temperaturze -20 °C.
   9. Wirować przez 30 - 60 minut w temperaturze 13 000 - 15 000 × g i temperaturze 4 °C.
   10. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.
   11. Umyj granulat, dodając do niego 1 ml 70% etanolu. Nie należy wirować próbki.
   12. Odwirowywać próbkę przez 5 minut w temperaturze 13 000 - 15 000 × g i temperaturze 4 °C.
   13. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.
   14. Suchy pellet na powietrzu pod wyciągiem. W razie potrzeby przechowywać granulki w temperaturze -20 °C O/N.
   15. Rozpuścić osad w 30 μl H₂O poddanych działaniu DEPC przez wirowanie przez 2 minuty i użyć tego roztworu do rozpuszczenia osadu z odpowiedniej drugiej probówki na próbkę (30 μl roztworu na jedną parę ekstrakcyjną).
   16. Zmierz stężenie RNA i upewnij się, że przekracza ono 1 μg/μl do stosowania w wydłużeniu startera średnio wyrażonych mRNA.
   17. W razie potrzeby należy przechowywać RNA w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni do kilku miesięcy.

2. Reakcja na przedłużenie startera

1. Wzór podkładu
   UWAGA: Projektując startery do eksperymentu z przedłużaniem startera, należy przestrzegać ogólnych wytycznych dotyczących projektowania starterów PCR (więcej informacji i sekcję dyskusji w tym artykule można znaleźć w instrukcji dołączonej do automatycznego sekwencera żelowego).
   1. W szczególności należy upewnić się, że startery (i) nie zawierają ciągów zasad, (ii) mają G lub C na końcu 3', (iii) mają zrównoważony stosunek GC:AT, (iv) mają temperaturę wyżarzania około 55 - 60 °C i (v) wiążą co najmniej 50 pz, lepiej 100 pz za obszarem zainteresowania, aby uzyskać wyraźne obrazy.
2. Reakcja przedłużania podkładu
   UWAGA: Reakcja wydłużania starterów (synteza cDNA) wymaga dużych ilości matrycowego RNA. Jeśli ilości użytego RNA zostaną wybrane jako zbyt niskie, sygnał może być zbyt niski do wykrycia! Dlatego zalecamy oczyszczanie RNA zgodnie z powyższym opisem.
   UWAGA: UWAGA: Używaj odczynników wolnych od RNaz i wyrobów plastikowych!!
   1. Rozgrzej termocykler do temperatury 95 °C i przeprowadź wszystkie dalsze etapy inkubacji w termocyklerze, aby ułatwić użytkowanie i odtwarzalność.
   2. Wymieszać związki z tabeli 2 w probówce do PCR dla każdej próbki RNA.
   3. Denaturacja próbek przez 1 minutę w temperaturze 95 °C.
   4. Umieść probówki na lodzie i schładzaj przez 5 minut, aby zhybrydyzować RNA i startery.
   5. Ustaw maszynę do PCR na 47 °C.
   6. W międzyczasie należy przygotować główny miks do odwrotnej transkrypcji zgodnie z opisem w Tabeli 3.
   7. Dodaj 4 μl głównej mieszanki odwrotnej transkrypcji do każdej zhybrydyzowanej próbki RNA.
   8. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 47 °C. Uwaga: Optymalna temperatura dla AMV RT wynosi 42 °C, jednak wyższe temperatury pomagają przezwyciężyć drugorzędowe struktury cząsteczek RNA.
   9. Zatrzymać reakcję, podgrzewając próbki do temperatury 95 °C przez 2 min.
      UWAGA: Formamid jest, toksyczny i może być szkodliwy dla nienarodzonego dziecka. Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki, obchodzenie się z nimi ostrożnie i noszenie odpowiedniej ochrony!
   10. Dodać 6 μl barwnika obciążającego formamid (95% (v/v) dejonizowanego formamidu, 10 mM EDTA, 0,05% (w/v) błękitu bromofenolowego) i przechowywać do O/N przez dwa tygodnie w temperaturze -20 °C w ciemności.

3. Przygotowanie drabiny sekwencjonowania

UWAGA: Reakcja drabinkowa sekwencjonowania wymaga albo umiarkowanej ilości plazmidów, albo dużej ilości genomowego DNA. O ile to możliwe, zaleca się stosowanie plazmidów w reakcji sekwencyjnej ze względu na łatwość izolacji i wysoką intensywność sygnału. W innych przypadkach rutynowo stosujemy metodę zaczerpniętą z Marmuru^5,14 do przygotowania genomowego DNA z komórek E. coli i S. aureus bez konieczności stosowania fenolu. Zasadniczo można zastosować każdą metodę, która daje duże ilości i czystość genomowego DNA.

1. Izolacja genomowego DNA
   1. Hodować 10 ml komórek E. coli lub S. aureus O/N w pożywce LB, BM⁵ lub TSB.
   2. Zbierać komórki przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 4 600 × g do probówki sokoła o pojemności 15 ml.
   3. Zawieszony osad w 2 ml buforu P1, jak w niektórych zestawach do przygotowania mini (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNazy A).
   4. Lizować komórki przez 45 - 60 minut za pomocą 20 - 40 μl lizostafiny (0,5 mg/ml, przechowywanie w temperaturze -20 °C). Uwaga: W przypadku komórek E. coli enzymatyczną obróbkę wstępną można pominąć lub zastosować lizozym.
   5. Dodać 100 μl nasyconego roztworu SDS (w 45% etanolu) do zawiesiny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
   6. Dodać 650 μl 5 M NaClO₄ i krótko zawirować komórki.
      UWAGA: Chloroform jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki i stosowanie pod wyciągiem z zachowaniem odpowiedniego zabezpieczenia!!
   7. Do mieszaniny dodać 3 ml chloroformu/izopentanolu (w proporcji 24:1) i wstrząsać przez co najmniej 60 sekund. Uwaga: Płyn powinien zamienić się w jednorodną białą emulsję.
   8. Odwirować próbkę przez 10 minut przy 4 600 × g i RT do rozdzielenia faz.
   9. Ostrożnie przenieś klarowną górną (wodną) fazę do świeżej probówki. Jeśli roztwór jest mętny, powtórzyć ekstrakcję chloroformem/izopentanolem. Zmierzyć objętość roztworu DNA i przygotować świeżą probówkę z 2 objętościami etanolu (100%).
   10. Powoli zdekantować lub odpipetować roztwór DNA do probówki zawierającej etanol. Uwaga: DNA powinno wytrącać się w postaci przezroczystych, gęstych cewek na dnie lub po całkowitym odwodnieniu jako pływająca biała gromada.
   11. Pobrać DNA za pomocą haczyków wykonanych ze szklanych pipet Pasteura (ryc. 2) i umyć każdą próbkę dwukrotnie, zanurzając ją w pojedynczej probówce zawierającej 1 ml 70% etanolu.
   12. Umieść haczyki pionowo na stojaku i susz pellet na powietrzu przez 60 minut. W razie potrzeby należy przechowywać wysuszone DNA przez kilka dni w temperaturze pokojowej.
   13. Rozpuścić DNA, odłamując szklane haczyki pokryte DNA i umieszczając w probówce reakcyjnej o pojemności 2,0 ml zawierającej 100 - 500 μl ddH₂O. Dostosować objętość do końcowego stężenia DNA 1 000 - 1 500 ng / μl. Do jednej reakcji sekwencjonowania należy użyć 10 - 18 μg genomowego DNA.

Rysunek 2. Instrukcja tworzenia wędki DNA. Przytrzymaj końcówkę szklanej pipety Pasteura w płomieniu palnika Bunsena. Powoduje to, że szkło zaczyna się topić po kilku sekundach, tworząc na końcu mały haczyk. Szybko zdejmij z ognia i pozostaw do ostygnięcia na 1 minutę.

2. Izolacja plazmidu
   1. Przygotować plazmidy za pomocą standardowych mini zestawów preparatów i rozpuścić w buforze elucyjnym (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). W zależności od wielkości plazmidu należy użyć 100 - 500 ng plazmidu na jedną drabinę sekwencjonowania.
3. Reakcja sekwencjonowania Sangera
   UWAGA: Poniżej znajduje się prosty protokół, który wykorzystuje fluorescencyjnie znakowany zestaw do sekwencjonowania starterów z 7-deaza-dGTP, który dobrze sprawdza się w celu przedłużania starterów. Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcji zestawu do sekwencjonowania. Należy pamiętać, że reakcja sekwencjonowania musi wykorzystywać ten sam starter, co reakcja przedłużania startera, aby uzyskać produkty o tej samej długości.
   1. Zmieszać 12 μl genomowego DNA (~10 - 15 μg) z 1 μl DMSO i 1 μl znakowanego fluorescencyjnie startera (2 pmol/μl).
   2. Do każdego 1 μl z czterech mieszanin reakcyjnych sekwencjonowania (A, C, G lub T) dodać 3 μl mieszaniny DNA/DMSO/startera.
   3. Umieść próbki w maszynie do PCR i uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 2 minuty; 35 cykli po 95 °C przez 20 sekund, 54 °C przez 20 sekund, 70°C przez 30 sekund; utrzymywać zawsze w temperaturze 4 °C.
   4. Po zakończeniu cyklu należy wyjąć próbki z maszyny, dodać 6 μl barwnika ładującego i przechowywać na lodzie (krótkotrwale) lub w temperaturze -20 °C przez kilka dni do tygodni.

4. Konfiguracja żelu i działanie aparatury

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat tego, jak składa się żel do sekwencjonowania, jak żel jest przygotowywany i jak żel jest uruchamiany, można znaleźć w protokole producenta.

1. Preparaty
   1. Przygotować 10 TBE, jak wskazano w tabeli 4.
   2. W dniu przebiegu żelu przygotować 1 l 1x buforu TBE z ultraczystym ddH₂O.
   3. Przygotuj 10% (w/v) SOA. Uwaga: Może być przechowywany w podwielokrotnościach 200 μl w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy, ale aktywność może z czasem ulec zmniejszeniu.
2. Montaż komory odlewania żelu
   1. Unikaj kurzu i kłaczków między szklanymi płytami. Dlatego dokładnie wyczyść powierzchnie robocze za pomocą wilgotnych chusteczek.
   2. Wyczyść parę szklanych talerzy o długości 25 cm za pomocą jednorazowych ręczników papierowych i wody destylowanej po obu stronach, a następnie izopropanolu po wewnętrznej stronie szklanych płytek.
   3. Umieść przekładki 0.25 mm na tylnej szklanej płycie i opuść karbowaną szklaną płytkę na górze (Rysunek 3).
   4. Przymocuj szyny żelowe po obu stronach szklanych płytek z karbowanym końcem i pilotami wejściowymi do szyny skierowanymi do góry i lekko dokręć pokrętła.

Rysunek 3. Widok rozstrzelony szklanych płytek żelowych do elektroforezy. Płytki szklane powinny być używane kierunkowo. Należy uważać, aby wewnętrzna strona szklanych płytek była skierowana do wewnątrz, a zewnętrzna strona na zewnątrz.

Rysunek 4. Widok zmontowanego aparatu żelowego. Po wstrzyknięciu roztworu żelu, przekładkę kieszonkową umieszcza się w roztworze między szklanymi płytkami. Płyta odlewnicza jest następnie wsuwana między przednią płytę szklaną a szynami żelowymi i zabezpieczana przez zamocowanie gałek szyny.

3. Odlewanie żelu
   UWAGA: niespolimeryzowany akryloamid jest neurotoksyczny! Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki i stosowanie z zachowaniem odpowiednich zabezpieczeń!!
   1. Dodać związki wymienione w tabeli 5 do zlewki i wymieszać za pomocą mieszadła i mieszadła magnetycznego.
   2. Natychmiast po dodaniu APS i TEMED nabrać roztwór żelu do strzykawki o pojemności 50 ml i umieścić filtr 0,45 nm na końcówce.
   3. Przytrzymaj górną krawędź szklanej płytki jedną ręką lub umieść kanapkę w stojaku do odlewania żelu, aby uzyskać nachylenie pod kątem 10 - 20°.
   4. Powoli dozować roztwór żelu między szklane płytki, ciągle przesuwając końcówkę strzykawki z jednej strony na drugą i zatrzymać, gdy roztwór żelu zetknie się z dolnym końcem.
   5. Przesuń na bok lub całkowicie usuń powstałe bąbelki za pomocą haczyka bąbelkowego.
   6. Wsuń przekładkę kieszeni żelowej (0,25 mm) między szklane płytki na karbowanym końcu, zanurz w roztworze żelu i zamocuj, mocując płytkę odlewniczą.
   7. Lekko dokręć górnej szyny (patrz rysunek 4 dla w pełni zmontowanego urządzenia).
   8. Pozostaw żel na 1 - 2 godziny.
   9. Zdejmij płytkę odlewaną i przekładkę kieszeni i oczyść kieszeń z resztek soli i żelu.
   10. Spłukać ddH₂O i wytrzeć nadmiar roztworu bibułkami.
4. Bieganie i wizualizacja żelu
   UWAGA: Żele do sekwencjonowania są bezpośrednio poddawane elektroforezie w naświetlarce żelowej, podczas gdy fluorescencja jest jednocześnie wykrywana przez mikroskop laserowy. W przeciwieństwie do konwencjonalnej elektroforezy żelowej, w której żel jest najpierw uruchamiany, a następnie barwiony i wizualizowany, jednostka detekcyjna jest nieruchoma i skanuje pasma w czasie rzeczywistym, gdy przechodzą przez laser. Poniżej przedstawiono procedurę działania oprogramowania do zbierania danych ImagIR w systemie OS/2, którą można dostosować do nowszych wersji. Więcej informacji można znaleźć w instrukcji obsługi.
   1. Wsuń uchwyt zbiornika buforowego w szyny żelowe na przednich szklanych płytkach i dokręć pokrętła.
   2. Umieść żel w dolnym zbiorniku żelu automatycznego imagera żelowego na płycie grzewczej i zamocuj, wsuwając pilota wejściowego szyny do wsporników aparatu.
   3. Napełnij 1x bufor TBE do dolnej i górnej komory buforowej żelu, zamknij dolną komorę buforową i podłącz górną komorę buforową do zasilania za pomocą przewodu zasilającego.
   4. Jeśli jest dostępna, oczyścić kieszeń żelową z resztek soli, kilkakrotnie pipetując bufor do kieszonki.
   5. Zamknąć górną komorę zbiornika buforowego za pomocą górnej pokrywy bufora.
   6. Zamknij drzwiczki maszyny i włącz imager oraz komputer, a następnie uruchom oprogramowanie do zbierania danych Base ImagIR
   .
   7. Utwórz nowy plik projektu (Plik->Nowy...), wprowadź nazwę pliku projektu, wybierz odpowiednie zakresy laserów (700 lub 800 nm) i potwierdź przyciskiem OK.
   8. Wybierz Opcje->Automatyczne wzmocnienie... z menu obrazu u góry, kliknij Auto, aby rozpocząć automatyczny pomiar wzmocnienia i zaakceptuj ustawienia, klikając OK.
   9. Ustaw ostrość lasera, wybierając Opcje->Ostrość... z menu sterowania skanerem, klikając przycisk Auto i akceptując ustawienia, klikając OK.
   10. Powtórz procedurę automatycznego wzmocnienia, aby dostosować się do nowo ustawionego obszaru.
   11. Ustaw sterowanie skanerem zgodnie z następującymi ustawieniami: 2 000 V, 35 mA, 45 W, 45 °C, Filtr skanowania: 3, Szybkość skanowania: 3.
   12. Uruchom pusty żel przez 20 minut (wybierz voltage ON i naciśnij ).
   13. W międzyczasie podgrzej drabinkę sekwencyjną i produkty przedłużające starter w maszynie do PCR przez 2 minuty do 90 °C, a następnie ostudź na lodzie.
   14. Zatrzymaj elektroforezę, otwórz automatyczny sekwencer żelowy i zdejmij górną pokrywę zbiornika buforowego.
   15. Włóż grzebień do zębów rekina między szklane płytki i lekko przebij żel zębami rekina (patrz rysunek 5).

Rysunek 5. Zbliżenie żelu z grzebieniem w kształcie zęba rekina. Próbkę (fioletową) nakłada się między zęby rekina.

16. Odpipetować 1-2 μl produktów przedłużających starter lub sekwencjonujące reakcje drabinkowe do każdej kieszeni żelowej (utworzonej przez zęby rekina).
17. Jeśli nie wszystkie kieszenie są potrzebne, wypełnij je barwnikiem ładującym, aby zapobiec niespójnemu zachowaniu podczas pracy.
18. Zamknij zbiornik buforowy i drzwiczki sekwencera żelu.
19. Rozpocznij elektroforezę i włącz laser (Wybierz Voltage ON i Laser ON i naciśnij ).
20. Przerwij elektroforezę, gdy obszar zainteresowania przejdzie przez laser.

Wyniki

Jak pokazano na rysunku 6, reakcja przedłużenia startera może być użyta do określenia punktów początkowych transkrypcji interesujących nas transkryptów i może pomóc w wydedukowaniu regionów promotora (zazwyczaj identyfikowanych przez elementy -10 i -35). Najwyższy (najdłuższy) fragment cDNA reprezentuje koniec 5' mRNA, a zatem można go łatwo zmapować w porównaniu z drabiną sekwencjonowania.

Dyskusja

Wydłużenie startera fluorescencyjnego jest prostą i szybką metodą określania końców 5' RNA, zarówno w celu identyfikacji przetwarzania TSP, jak i wtórnego przetwarzania RNA. Dzięki zastosowaniu starterów fluorescencyjnych, reakcje mogą być zapoczątkowane i przebiegać bez dodatkowych środków ostrożności (w przeciwieństwie do starterów znakowanych radioaktywnie). Ponieważ próbki są wykrywane za pomocą fluorescencji, można je obrazować w trakcie elektroforezy, co pozwala na szybką analizę w porównaniu z metodami radioaktywn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odwrotna transkryptaza AMV (20-25 U/&mikro; l)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (bez RNazy)	Ambion (technologie życia)	Instrument AM2222
FastPrep-24	MPBio	116004500
Podkłady znakowane fluorescencyjnie	Biomery	n/a	5' Modyfikacja DY-681 " zwyczajny" Oligonukleotydy DNA. Kompatybilne barwniki, takie jak LICOR IRDye 700/800, są również dostępne u innych dostawców, takich jak IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer wraz z oprogramowaniem do zbierania danych ImagIR	Li-Cor		Produkt wycofany
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Woda wolna od nukleaz	Ambion (technologie życia)	AM9915G
Zestaw do przygotowania plazmidu	mini QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Koncentrat	USB	US75863
BFOR PAMIĘCI RNA	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternatywa: " Kwas-fenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)" od Ambion (AM9720)
SUPERase• In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase znakowany fluorescencyjnie zestaw do sekwencjonowania cyklu startera z 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe 0,1 mm	BioSpec	11079101z