Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

Summary

Ten artykuł opisuje szereg ustawień do wysiewu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na materiały, w tym przypadku przędze elektroprzędzone, które nie pokrywają podstawy standardowych płytek dołków hodowlanych, aby zmaksymalizować i określić ilościowo liczbę komórek, które początkowo się przyczepiają, w porównaniu do znanej gęstości wysiewu.

Abstract

Badania nad biomateriałami i inżynierią tkankową często obejmują badania in vitro na komórkach, które wymagają wstępnej wiedzy na temat początkowej liczby komórek. Chociaż badacze często odwołują się do ich gęstości wysiewu, niekoniecznie wskazuje to na rzeczywistą liczbę komórek, które przylgnęły do danego materiału. Dotyczy to w szczególności materiałów lub rusztowań, które nie pokrywają podstawy standardowych płytek studzienkowych do hodowli komórkowych. W tym badaniu zbadano początkowe przyłączenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych wysianych w znanej liczbie do przędzy poli(ε-kaprolaktonowej) przędzonej elektrolitycznie po 4 godzinach w hodowli. Przędze elektroprzędzone umieszczono w kilku różnych konfiguracjach, w tym w zbiornikach bioreaktora obracających się z prędkością 9 obr./min, wkładkach do hodowli komórkowych umieszczonych w płytkach dołków o niskiej zawartości wiązania oraz w korytkach z politetrafluoroetylenu (PTFE) umieszczonych na szalkach Petriego. Dwa ostatnie zostały poddane warunkom statycznym lub umieszczone na płycie wytrząsającej (30 rpm"). Po 4 godzinnej inkubacji w temperaturze 37 ^oC, 5% CO₂ lokalizację wysianych komórek określono za pomocą testu DNA komórkowego. Rusztowania wyjęto z pojemników i umieszczono w buforze do lizy. W podobny sposób usunięto frakcję pożywki i odwirowano – supernatant wyrzucono, a osad rozdrobniono buforem do lizy. Bufor do lizy dodawano do każdego pojemnika lub studzienki i zeskrobywano, aby uwolnić wszelkie komórki, które mogą być obecne. Test DNA komórkowego określił procent komórek obecnych w rusztowaniu, pożywce i frakcjach studzienek. Przyczepienie komórek było niskie we wszystkich konfiguracjach eksperymentalnych, przy czym największe przywiązanie (30%) dotyczyło przędz utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i poddanych ruchowi wstrząsającemu. Badanie to podnosi świadomość na temat rzeczywistej liczby komórek przyczepiających się do rusztowań, niezależnie od podanej gęstości wysiewu komórek.

Introduction

Rusztowania są rutynowo opracowywane i badane pod kątem zastosowań w biomateriałach i inżynierii tkankowej. W związku z tym są one powszechnie obsiewane komórkami, a ich zachowanie in vitro jest charakteryzowane za pomocą testów, które określają na przykład proliferację komórek i liczbę komórek. W przypadku eksperymentów takich jak te konieczne jest, aby początkowa liczba komórek była znana, a badacze często podają stężenie wysiewu w kategoriach liczby komórek na ml lub^cm2. Chociaż jest to dobra praktyka, zwłaszcza do celów zwiększania skali, nie uwzględnia ona rzeczywistej liczby komórek, które przylegają do powierzchni rusztowania (która jest również zależna od właściwości adhezyjnych powierzchni biomateriału¹). Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rusztowań, które nie pokrywają całej podstawy płytki studzienki do hodowli komórkowej, ponieważ komórki mogą odpaść od konstruktu i, ze względu na często statyczny charakter eksperymentu, mogą nigdy nie zetknąć się ponownie z materiałem będącym przedmiotem zainteresowania. Przędze z włókien elektroprzędzonych są dobrym przykładem rusztowania, które nie zakrywa podstawy studni (rysunek 1A). W takim przypadku należy stosować płytki dołkowe o niskim stopniu wiązania, które nie zostały poddane obróbce powierzchniowej, aby zapobiec przyczepianiu się komórek do powierzchni płytki, a tym samym zniekształcaniu wyników wszelkich dobrze opartych testów.

Płytki dobrze używane są do wysiewania komórek na rusztowaniach, ale nie są jedyną dostępną metodą. Obrotowe systemy hodowli komórkowych, rodzaj bioreaktora opracowanego przez Wydział Nauk Przyrodniczych NASA pod koniec lat 80-tych, mogą być podobnie używane do sadzenia rusztowań w trójwymiarowym (3D) środowisku z symulowaną mikrograwitacją. Ten typ bioreaktora pozostaje popularnym wyborem wśród naukowców na całym świecie i został włączony do badań nad sygnalizacją komórkową^2,3, komórkami macierzystymi^4,5 i inżynierią tkankową^6,7. Tym, co sprawia, że bioreaktor obrotowy jest lepszy od płytek studziennych, jest utrzymanie środowiska 3D, które pomaga zapobiegać dedyferencjacji zróżnicowanych komórek, jak to często ma miejsce w przypadku hodowli w konwencjonalnych warunkach 2D⁸.

Ten artykuł bada różne techniki wysiewu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na przędzach z włókien poli(ε-kaprolaktonowych), jak to zostało wyprodukowane w Bosworth et al.,⁹, w celu maksymalizacji początkowej liczby komórek przyczepiających się do tych rusztowań w ciągu 4 godzin. W przypadku hodowli 2D przędze były bezpiecznie trzymane w płytkach studzienkowych lub wykonanych na zamówienie korytkach z poli(tetrafluoroetylenu) (PTFE) i utrzymywane w warunkach statycznych lub wstrząsane z prędkością 30 obr./min. W przypadku hodowli 3D przędze i komórki utrzymywano w naczyniach bioreaktora obracających się z prędkością 9 obr./min.

Protocol

1.Produkcja i sterylizacja rusztowań

1. Rozpuścić PCL w 1,1,1,3,3,3–heksafluoroizopropanolu, aby uzyskać stężenie 10% w/v. Jak opisano w Bosworth i wsp.9, roztworu polimerowego należy elektrowirować (parametry: 20 kV, 1 ml/h, 20 cm) i zbierać wyrównane włókna na krawędzi obracającego się trzpienia (600 obr./min). Za pomocą skalpela usuń wstęgę zebranego włókna, a następnie pokrój na krótsze odcinki - 3 cm (w przypadku koryt i naczyń obrotowych) i 4 cm (w przypadku wkładek do hodowli komórkowych).
2. Za pomocą cienkich kleszczyków zanurz poszczególne paski w wodzie destylowanej i usuń.
3. Trzymając oba końce między kciukiem a palcem wskazującym; ręcznie przekręć pasek, aż będzie przypominał nić.
4. Zanurz na krótko to nitkowate rusztowanie w wodzie destylowanej i umieść na czystej, niewłóknistej kartonie do wyschnięcia.
5. Po wyschnięciu umieścić pojedynczo w czystych probówkach do mikrowirówek i dodać 1 ml etanolu o stężeniu 50% v/v w wodzie destylowanej. Zamknij pokrywki i pozostaw na 24 godziny.
   Uwaga: Wykonaj następujące czynności przy przepływie laminarnym:
6. Umieść probówki do mikrowirówek w komorze z przepływem laminarnym i odessaj roztwór o stężeniu 50% v/v. Zastąp 1 ml etanolu o stężeniu 70% v/v w wodzie destylowanej, zamknij pokrywki i pozostaw na 24 godziny.
7. Powtórzyć dla 90% i 100% v/v etanolu w wodzie destylowanej (objętość 1 ml).
8. Rusztowania należy umyć dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), 24 godziny na mycie (2 x 1 ml).
9. Usunąć PBS i zastąpić 1 ml pożywki do hodowli komórkowych. Uwaga: Rusztowania są gotowe do użytku po 24 godzinach.

2 . Określanie powierzchni rusztowania i liczby komórek

1. Za pomocą mikroskopu świetlnego i oprogramowania do obrazowania zmierz średnicę przędzy elektroprzędzonej wzdłuż jej długości, aby określić wartość średnią.
2. Załóżmy, że przędza jest cylindrycznym prętem i przybliż pole powierzchni za pomocą:
3. Gdzie A = pole powierzchni, r = promień, a h = długość
   Uwaga: Powierzchnia została obliczona na 18 902 800 μm². Ponadto należy zauważyć, że rzeczywista powierzchnia będzie większa niż to obliczenie, ponieważ przędza składa się z setek drobnych włókien, co zwiększy powierzchnię. W związku z tym większa liczba komórek powinna być w stanie przymocować się do rusztowania. Nie ma to jednak wpływu na bezpośrednie porównanie między grupami testowymi.
4. Określ maksymalną liczbę komórek, które mogą przyłączyć się do odsłoniętej powierzchni rusztowania poprzez:
   Uwaga: Za pomocą mikroskopu świetlnego i oprogramowania do obrazowania określono średnicę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na 20 μm (przy założeniu, że komórki są okrągłe), więc w tym przypadku liczba komórek = 60 200.

3. Ustawienie rusztowania – wkładki do hodowli komórkowych (Rysunek 1A)

1. Pod wpływem przepływu laminarnego otwórz sterylne 6-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych i oddziel krótsze pierścienie z zębami od szerszych ciał z pierścieniami.
2. Weź pierścień z zębami skierowanymi do góry. Ułóż jedno z 4-centymetrowych rusztowań na środku pierścienia, upewniając się, że zachodzi na siebie po obu stronach. Weź korpus z pierścieniem i umieść go na pierścieniu zębatym i rusztowaniu, a następnie popchnij w dół, upewniając się, że rusztowanie pozostaje na swoim miejscu i przechodzi przez środek wkładki do hodowli komórkowej.
3. Umieść wkładkę do hodowli komórkowej z rusztowaniem w studzience 6-dołkowej płytki o niskim stopniu wiązania.
4. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej do rusztowania.

4. Ustawienie rusztowania – koryto (Rysunek 1B)

1. Pod przepływem laminarnym umieścić koryta z poli(tetrafluoroetylenu) (PTFE) na indywidualnych szalkach Petriego i dodać do koryta 10 ml pożywki hodowlanej.
2. Za pomocą kleszczy włóż jedno z 3 cm rusztowań do koryta, upewniając się, że jego długość leży równolegle do dłuższej krawędzi koryta.

5. Ustawienie rusztowania – zbiornik bioreaktora (Rysunek 1C)

1. Przy przepływie laminarnym należy przelać 10 ml sterylnego PBS przez główny port zbiornika bioreaktora i pozostawić na 10 minut.
2. Usunąć PBS i zastąpić go 8 ml pożywki hodowlanej.
3. Za pomocą kleszczy włóż jedno z 3 cm rusztowań do naczynia przez port główny.
4. Zamknij główny port.

6. Liczenie komórek

1. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) pochodzących ze szpiku kostnego zgodnie z protokołem producenta do pasażu 4 przed pobraniem.
2. Odessać pożywkę z kolby o średnicy 75^cm2 zawierającej hMSC pochodzące ze szpiku kostnego (pasaż 4, zlewność 80%).
3. Przemyć komórki 10 ml sterylnego PBS i aspiratu.
4. Dodać 3 ml trypsyny i inkubować kolbę w temperaturze 5% CO₂ °C w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się od powierzchni kolby.
5. Dodać 7 ml pożywki hodowlanej w celu dezaktywacji enzymu i przenieść tę całkowitą objętość (10 ml) do probówki wirówkowej.
6. Zawiesić zawiesinę komórek, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodne rozproszenie komórek w pożywce i ograniczenie aglomeratów komórkowych (pipeta 10 ml).
7. Usunąć 20 μl zawiesiny komórek i przenieść do hemocytometru.
8. Umieść hemocytometr pod mikroskopem świetlnym i zobrazuj obiektyw x10.
9. Skoncentruj się na liniach siatki i policz liczbę komórek w kwadratach 4 x 4 w każdym rogu siatki, które mieszczą się w kwadracie i tych, które przecinają prawą lub dolną linię granicy. Policz dla każdego zestawu 4 x 4 kwadraty (4 zliczenia na siatkę).
10. Powtórzyć ponowne zawieszenie i zliczanie komórek trzy razy (kroki 6.6-6.9).
11. Obliczyć średnią liczbę komórek i określić objętość pożywki wymaganą do ponownego zawieszenia komórek (stężenie komórek 60 200 w 200 μl). Na przykład określ średnią liczbę komórek na podstawie hemocytometru, a następnie określ ogólną średnią liczbę komórek z trzech oddzielnych zliczeń. Pomnóż to przez 1 x 10⁴, aby uzyskać liczbę komórek na ml, a następnie pomnóż przez całkowitą objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek. Użyj następującego równania, aby określić objętość pożywki wymaganą do ponownego zawieszenia:
12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 241 x g przez 5 min.

7. Sadzenie komórek

1. Zassać pożywkę z probówki wirówki, pozostawiając osad komórkowy i zastąpić obliczoną objętością pożywki.
2. Ponownie zawieś ogniwa i pożywkę, aby uzyskać równomierne wymieszanie.
3. Za pomocą pipety Gilson P200 powoli dozuj 200 μl zawiesiny komórek na każde rusztowanie, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż rusztowania i poniżej powierzchni płynu podłoża. Pozostaw w spokoju na 20 minut.
4. W przypadku zbiorników bioreaktorów należy dozować 200 μl zawiesiny komórek przez port główny. Uzupełnić pozostałe 2 ml pożywki hodowlanej przez porty strzykawki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml.

8. Eksperymentalny start

1. Przenieś naczynia bioreaktora do bioreaktora RCCS-4DQ i ustaw tak, aby obracały się z prędkością 9 obr./min.
2. Przenieść płytki studzienkowe z wkładkami do hodowli komórkowych i korytkami na płytkę wytrząsającą i ustawić tak, aby obracały się z prędkością 30 obr./min.
3. Płytki studzienkowe z wkładkami do hodowli komórkowych i korytami przenieść na półkę inkubatora komórkowego ustawionego w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ (hodowla statyczna).

9. Test DNA

1. Przygotuj roztwory – bufor do lizy, 1x bufor TE, wzorce DNA i roztwór roboczy DNA komórki - zgodnie z instrukcją producenta.
2. Po 4 godzinach wyjąć próbki z inkubatora i umieścić je pod przepływem laminarnym.
3. Usunąć frakcje pożywki ze wszystkich próbek i umieścić w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych. Odwirować probówki 241 x g . Usunąć sklarowany osad i dodać 3 ml buforu do lizy. Ponownie zawiesić roztwór, aby rozbić osad komórkowy.
4. Za pomocą kleszczy należy usunąć rusztowania i umieścić je w probówkach wirówkowych zawierających 3 ml buforu do lizy (w przypadku rusztowań w zbiornikach bioreaktora należy usunąć rusztowanie przed zasysaniem pożywki). W przypadku rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych należy najpierw uwolnić rusztowanie, przecinając rusztowanie blisko krawędzi wkładki za pomocą skalpela.
5. Dodać 3 ml buforu do lizy do każdego pojemnika rusztowania i zeskrobać powierzchnię (energicznie zamieszać do zbiorników bioreaktora). Usunąć bufor do lizy i umieścić w oddzielnie oznakowanych probówkach wirówkowych.
6. Wirować każdą probówkę wirówkową przez około 1 minutę, aby zapewnić wystarczające wymieszanie komórek i buforu oraz pobudzić lizę błony komórkowej.
7. Na czarną 96-dołkową płytkę dodać 100 μl buforu do lizy dla każdej frakcji próbki – rusztowania, pożywki i studzienki (duplikatu).
8. W ciemności dodać 100 μl roztworu DNA komórkowego do wszystkich studzienek zawierających bufor do lizy i delikatnie wymieszać.
9. Dołączyć studzienki z buforem do lizy niezawierającym roztworu DNA i DNA komórki, aby zapewnić negatywną i pozytywną kontrolę płytki studzienki.
10. Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zmierz absorbancję studzienek przy wzbudzeniu 485 nm i emisji 520 nm.
11. Porównaj dane z krzywą standardową wygenerowaną na podstawie wzorców DNA zgodnie z instrukcjami producenta.

10. Utrwalenie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)

1. Wykonaj następujące czynności przy przepływie laminarnym: Po 4 godzinach usuń wszystkie rusztowania z ich pojemników i umieść je w nowej płytce 6-dołkowej (oddzielne studzienki).
2. Umyj rusztowania dwukrotnie za pomocą PBS.
3. Wykonaj następujące czynności na otwartej ławce: Do każdej studzienki dodaj 2 ml 1,5% v/v aldehydu glutarowego w PBS, aby zapewnić całkowite pokrycie rusztowania.
4. Pozostawić płytkę na co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia komórek.
5. Usunąć roztwór utrwalający i umyć rusztowania dwukrotnie PBS.
6. Odwodnić rusztowania zwiększając stężenie etanolu w wodzie destylowanej, zaczynając od 50% v/v, a następnie 70% v/v i 90% v/v. Dla każdego stężenia całkowicie zanurzyć rusztowania w roztworze (2 ml) i pozostawić na 3 minuty. Wyrzuć roztwór i powtórz.
7. Odwodnić w 100% etanolu, całkowicie zanurzając rusztowania w roztworze (2 ml) i pozostawiając na 5 minut. Wyrzuć roztwór i powtórz czynność.
8. Wysuszyć chemicznie rusztowania za pomocą heksametyldisilazanu (HMDS) w dygestorium. Zanurz rusztowania w HMDS (2 ml) i pozostaw na 5 minut. Wyjmij gogle HMDS i powtórz czynność.
9. Zdejmij gogle HMDS i poczekaj, aż rusztowania wyschną. Rusztowania należy montować na dostępnych na rynku króćcach SEM (w tym przypadku króćce ze stali nierdzewnej z samoprzylepnymi zakładkami węglowymi).
10. Aby ułatwić przeglądanie w SEM, należy pokryć próbki za pomocą napylarki złotej przez 2 minuty, aby zapewnić cienkie i równomierne pokrycie.
11. Umieść próbki w SEM i zwizualizuj rusztowania wysiane z komórek za pomocą wiązki elektronów o napięciu 5 KeV.

Results

Wyniki podkreślają lokalizację komórek po 4 godzinach od siewu dla każdego badanego układu eksperymentalnego. Rysunek 2A przedstawia procent komórek, które w tym czasie przyczepiły się do powierzchni rusztowania. Współczynnik konwersji 8,5 pg/komórkę zastosowano do przeliczenia zmierzonej zawartości DNA na liczbę komórek, a tym samym do określenia procentu komórek¹⁰. Dla wszystkich badanych konfiguracji wysiewu procent przyczepienia komórek jest stosunkowo niski, z największym przyleganiem komórek (30%) w przypadku rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i wytrząsanych z prędkością 30 obr./min (Insert Shaker). Najniższe przestrzeganie zaleceń (15%) dotyczyło rusztowań utrzymywanych we wkładkach do hodowli komórkowych i utrzymywanych w warunkach statycznych (Insert Static).

Duża liczba komórek była obecna we frakcji pożywki (Rysunek 2B), szczególnie w przypadku wkładek do hodowli komórkowych trzymanych w płytkach o niskim poziomie wiązania (Insert Static) i naczyniach obrotowych odpowiednio 50% i 51%. Rusztowania trzymane w korytach wykazały zwiększoną liczbę komórek obecnych w samym uchwycie – 48% komórek w przypadku Trough Shaker i 50% w przypadku Trough Static.

Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwoliła na wizualną ocenę rusztowań zasianych komórkami (Rysunek 3). Reprezentatywne obrazy uwypukliły ograniczoną obecność komórek na powierzchni włóknistej, niezależnie od konfiguracji wysiewu. Jednak większa liczba komórek i aglomeratów komórkowych była obecna na rusztowaniach trzymanych we wkładkach do hodowli komórkowych i wstrząsanych z prędkością 30 obr./min (Insert Shaker).

Rysunek 1. Konfiguracje eksperymentalne, w których przechowywana jest przędza elektroprzędzona; (A) wkładki do hodowli komórkowych i płytka studzienkowa o niskim poziomie wiązania; B) koryto z poli(tetrafluoroetylenu) (PTFE) i szalka Petriego; oraz (C) zbiornik bioreaktora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2.Lokalizacja komórek 4 godziny po wysiewie na przędzach elektroprzędzonych PCL przy użyciu różnych konfiguracji wysiewu. (A) pokazuje odsetek komórek, które przyłączyły się do rusztowania PCL (średnia ± odchylenie standardowe); (B) podkreśla procentowy rozkład lokalizacji komórek w obrębie trzech frakcji – pożywki, studzienki i rusztowania (n = 4, dane przedstawione jako wartości średnie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne skaningowe mikrofotografie elektronowe dla przędz elektroprzędzonych PCL z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, 4 godziny po wstępnym wysiewie przy użyciu różnych ustawień eksperymentalnych. (Wszystkie obrazy w powiększeniu 1,000X, podziałka = 130 μm.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Elektroprzędzione matryce z włókien wytwarzane z biopolimerów są regularnie używane do wspomagania przyłączania i proliferacji komórek w zastosowaniach związanych z biomateriałami i/lub inżynierią tkankową^11,12. W takich przypadkach matryce są często cienkimi arkuszami włókien, które z łatwością pokrywają całą podstawę płytki studzienki do hodowli komórkowej, a tym samym są w pełnym kontakcie z wysiewanymi komórkami, co poprawia przyczepianie komórek. Jeśli jednak rusztowanie z biomateriału nie pokrywa w pełni podstawy płytki studzienki, istnieje duże prawdopodobieństwo, że duża część wysianych komórek nie pozostanie w kontakcie z rusztowaniem i ostatecznie nie będzie w stanie się przyczepić. W badaniu tym zbadano kilka różnych metod wysiewu komórek na rusztowaniach, które nie pokrywają podstawy płytki studziennej, w celu określenia zoptymalizowanej techniki, która może być zalecana dla przyszłych eksperymentów opartych na komórkach.

Zbadano pięć różnych konfiguracji (ryc. 1): rusztowania (przędza elektroprzędzona) utrzymywane za pomocą wkładek do hodowli komórkowych w płytkach studzienkowych o niskim poziomie wiązania i utrzymywane w warunkach statycznych lub wytrząsane z prędkością 30 obr./min; rusztowania umieszczone w wąskich korytach z PTFE i utrzymywane w stanie statycznym lub wstrząsanym z prędkością 30 obr./min; oraz rusztowania umieszczone w zbiornikach bioreaktora obracających się z prędkością 9 obr./min. Określenie liczby komórek, które przylgnęły do przędz elektroprzędzonych za pomocą testu DNA, wykazało niski procent przyłączenia dla wszystkich konfiguracji wysiewu (ryc. 2); Zostało to dodatkowo potwierdzone za pomocą skaningowych mikrofotografii elektronowych (SEM) (ryc. 3). Największe przywiązanie komórek – 30% lub ~ 18 060 komórek – zaobserwowano w przypadku przędz, które były trzymane we wkładkach do hodowli komórkowych i poddawane ciągłemu ruchowi. Co ciekawe, najniższe przyłączanie komórek (15%) osiągnięto w przypadku przędz utrzymywanych przez wkładki do hodowli komórkowych, ale utrzymywanych w warunkach statycznych, co sugerowałoby, że włączenie ruchu promieniowego ma pozytywny wpływ na utrzymanie komórek w kontakcie z rusztowaniem. Należy jednak zauważyć, że ciągłe krążenie przepływu pożywki może być odpowiedzialne za aglomeraty komórkowe obserwowane na obrazach SEM. Płyta wytrząsająca została ustawiona na najniższe ustawienie – 30 obr./min – co może być ograniczeniem dla tej konfiguracji. Stosowanie wolniejszego ruchu promieniowego może pomóc w zapobieganiu lub zmniejszaniu aglomeracji komórek, a także może poprawić przyczepianie komórek, ponieważ komórki będą odczuwać mniejszą siłę. Przyszłe eksperymenty powinny koncentrować się na optymalizacji idealnej prędkości wytrząsarki w celu lepszego mocowania komórek. Włączenie ruchu do przędzy utrzymywanej w korytach nie spowodowało podobnego trendu, przy czym oba scenariusze dały 18% przyłączenia (~ 10 836 komórek); Chociaż może to być spowodowane częściowym unoszeniem się rusztowań w korytach (obserwowane w przypadku koryt umieszczonych na płycie wytrząsarki), ponieważ nie były one zakotwiczone w podstawie. Częściowe unoszenie rusztowania zapobiegnie kontaktowi i przyleganiu komórek, które opadły na dno koryta, do materiału i przylegania. W przypadku tej konkretnej konfiguracji koryto umieszczono na szalce Petriego i dodano łączną objętość pożywki 10 ml. Małe wymiary koryta oznaczają, że większość pożywki znajduje się na szalce Petriego, a jeśli nastąpi jakikolwiek ruch, komórki mogą odpłynąć od koryta do szalki Petriego i pozostać całkowicie poza zasięgiem rusztowania. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dalsze eksperymenty powinny obejmować dodatkowy krok w protokole, w którym końce rusztowań są przypinane do podstawy koryt za pomocą sterylnych cienkich igieł, ponieważ powinno to zapobiec ich unoszeniu się i przemieszczaniu (szczególnie w przypadku rusztowań narażonych na ruch promieniowy), co ostatecznie powinno prowadzić do zwiększenia liczby komórek przyczepiających się do rusztowania. 16% komórek przyczepiło się do przędzy obecnej w naczyniach obrotowych. Pomimo tego, że jest to dobrze znana technika hodowli 3D, pojawiły się problemy z usuwaniem rusztowań z głównego portu statku, co mogło spowodować utratę luźno przymocowanych komórek. Statki, które można w pełni otworzyć, wyeliminowałyby ten problem; Są one dostępne do zakupu, ale są znacznie droższe niż naczynia jednorazowe użyte w tym badaniu.

Badanie to pokazuje obecne problemy z rusztowaniami wysiewającymi, które nie pokrywają całej podstawy standardowych płytek studzienkowych do hodowli komórkowych. Wysiew znanej liczby komórek powodował, że mniej niż jedna trzecia przyczepiała się do rusztowania, mimo że powierzchnia rusztowania pozwalała na przyleganie wszystkich komórek. Może to mieć szkodliwe konsekwencje w innych testach komórkowych, które mogą oceniać biokompatybilność i zachowanie materiału komórkowego / komórka-komórka oraz interakcje z rusztowaniem jako potencjalnym przyszłym wyrobem medycznym. Dalsze ograniczenia badania mogą obejmować 4-godzinny punkt czasowy – pomimo tego, że jest wystarczająco długi, aby zapewnić początkowe wysiewanie komórek (wykazano, że komórki mocno przyczepiają się do substratów w ciągu trzydziestu minut^13,14,15), rozsądne może być zbadanie późniejszych punktów czasowych, pod warunkiem, że komórki nie proliferują w dłuższym przedziale czasu, ponieważ w przeciwnym razie wypaczyłoby to początkową liczbę komórek. Zmniejszenie objętości pożywki, w tym przypadku 10 ml, może również poprawić kontakt między komórkami a rusztowaniem i ostatecznie zwiększyć przyczepienie komórek. Przyszłe badania powinny również uwzględniać żywotność komórek, ponieważ proces wysiewu komórek może powodować uszkodzenie komórek i/lub śmierć komórek¹⁶. Testy DNA komórkowego nie rozróżniają komórek żywotnych i niezdolnych do życia, ponieważ taki test żywy/martwy, na przykład, podkreśliłby poziom żywotności.

To badanie podnosi świadomość na temat rzeczywistej liczby komórek, które przyczepiają się do rusztowania pomimo wysiewu znanej ilości. W przypadku badań, które opierają się na początkowej liczbie komórek, bardzo ważne jest, aby naukowcy dokładnie wiedzieli, ile z tej liczby faktycznie przylega do interesującego nas substratu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Woda destylowana	dostarczana we własnym zakresie	nie dotyczy
Etanol	Merck	1117271000
Fosforanowy buforowany roztwór soli	Technologie życia	70013016
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste	PromoCell GmbH	C-12974
Pożywka hodowlana MSC	PromoCell GmbH	C-28010B	Podgrzana do 37 oC przed użyciem
Mieszanka suplementów	PromoCell GmbH	C-39810	Dodaj do pożywki
Mieszanka antybiotykowo-przeciwmięśniowa	Sigma-Aldrich	A5955	Dodaj do pożywki
Trypsyna (0,05%) EDTA (0,02%)	Sigma-Aldrich	59417C	Podgrzany do 37 ° C przed użyciem
Kolby do hodowli komórkowych (T75)	Becton Dickinson Ltd	353110
Płytki 6-dołkowe o niskim wiązaniu	Costar Corning	3471
6-dołkowe CellCrowns	Scaffdex	C00003S
szalka Petriego o głębokości 50 ml	Sterilin	124
Koryta PTFE	produkcji	nie dotyczy
Jednorazowe RCCS naczynia 10 ml	Bioreaktor Synthecon	D-410
4-naczyniowy obrotowy system hodowli komórek	Synthecon	RCCS-4DQ
Płytka wytrząsająca	Stuart	SSM1	Mini wytrząsarka orbitalna
	Cyfrowy Bio	DHC-F01	Jednorazowa
probówka wirówkowa	C-Chip Deltalab	352096, 429901	15 ml i 50 ml
Wirówka	Hettich	Rotafix 32 A
Strzykawka 3 ml	Shield Medicare Ltd	3039820
Pipety	Sterilin	40305, 47310, 40125	5, 10 i 25 ml
Pipety Gilson	SLS	F144801, F144802, F123600, F123601, F123602	P2 - P1000
Końcówki do pipet	SLS	PIP7852, PIP7834, PIP7840
Mikroprobówka 1,5 ml	Eppendorf	30125.15
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Test PicoGreen	Invitrogen	P7589	Konfiguracja testu w ciemnej
czarnej 96-dołkowej płytce	Greiner Bio One	655086
Czytnik płytek fluorescencyjnych	BGM Labtech	FLUOstar Optima
Aldehyd glutarowy 25%	TAAB Laboratories	G002	Wykonane w stężeniu 1,5% v/v w PBS
Heksametyldisilazan (HMDS)	Sigma	999-97-3
Aluminiowe króćce (SEM)	Agar Scientific	G301
Zakładki węglowe (SEM)	Agar Scientific	G3347N
Napylarka do złota Skaningowy	Edwards	S150B
(SEM)	Phenom World	Phenom Pro